Preklinik Kardiyak Risk Değerlendirmesi için İnsan iPSC Kaynaklı Kardiyomiyositlerin Yapısal ve Kasılma Değişikliklerini Değerlendirmek için Hibrit Hücre Analiz Sistemi

Özet

İnsan iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin kasılma fonksiyonlarındaki ve hücresel bütünlüğündeki değişikliklerin analizi, klinik olmayan ilaç gelişimi için büyük önem taşımaktadır. Hibrit bir 96 kuyucuklu hücre analiz sistemi, klinik aşamalara güvenli bir geçiş için gerekli olan güvenilir, insanla ilgili sonuçlar için her iki parametreyi de gerçek zamanlı ve fizyolojik bir şekilde ele alır.

Özet

Kardiyak kontraktilitenin değerlendirilmesi, yeni terapötiklerin geliştirilmesi ve klinik aşamalara güvenli geçişi için büyük önem taşımaktadır. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), ilaç keşfi ve güvenlik farmakolojisinin klinik öncesi aşamalarında insanla ilgili bir model olarak hizmet etme sözü verirken, olgunlukları bilimsel toplulukta hala tartışmalıdır ve sürekli gelişme halindedir. Hibrit kontraktilite ve empedans/hücre dışı alan potansiyeli (EFP) teknolojisi sunarak endüstri standardı 96 kuyucuklu bir platforma önemli pro-olgunlaşma özellikleri ekliyoruz.

Empedans/EFP sistemi, hücresel işlevselliği gerçek zamanlı olarak izler. Kasılma hücrelerinin vuruş hızının yanı sıra, elektriksel empedans spektroskopisi okumaları, hücre yoğunluğu ve hücresel tek katmanın bütünlüğü gibi bileşiğin neden olduğu morfolojik değişiklikleri tespit eder. Hibrit hücre analiz sisteminin diğer bileşeninde, hücreler gerçek kalp dokusunun mekanik ortamını taklit eden biyo-uyumlu membranlar üzerinde kültürlenir. Bu fizyolojik ortam, hiPSC-CM'lerin in vitro olgunlaşmasını destekler ve izoproterenol, S-Bay K8644 veya omecamtiv mekarbil ile tedaviden sonra pozitif inotropik etkiler de dahil olmak üzere daha yetişkin benzeri kontraktil yanıtlara yol açar. Kasılma kuvvetinin genliği (mN /^mm2) ve atma süresi gibi parametreler, elektrofizyolojik özellikler ve kalsiyum kullanımı üzerinde etkisi olan bileşiklerin aşağı akış etkilerini de ortaya koymaktadır.

Hibrit sistem, bütünsel hücre analizi için ideal bir araç sağlar ve insanla ilgili hücre bazlı testlerin mevcut perspektiflerinin ötesinde klinik öncesi kardiyak risk değerlendirmesine izin verir.

Giriş

Modern ilaç geliştirmenin ana hedeflerinden biri, ilaç keşif boru hattındaki yeni terapötiklerin tezgahtan başucuna başarı oranının iyileştirilmesidir. Bu yeni ilaçların güvenli farmakolojik testleri genellikle kardiyovasküler sistem üzerinde preklinik aşamalarda ilaç yıpranma oranının neredeyse dörtte birini oluşturan advers ilaç reaksiyonlarını ortaya koymaktadır¹. Yeni yaklaşım metodolojilerinin (NAM'lar) geliştirilmesi ve entegrasyonu, klinik öncesi değerlendirmenin, özellikle de kalp gibi çekirdek pil organlarının modernizasyonunda kilit bir rol oynamaktadır. Bu metodolojiler hayvansız yaklaşımlar olduğundan, indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kökenli kardiyomiyositler (CM'ler) gibi insan bazlı hücre modellerinin kullanılması, son on yılda güvenlik farmakolojik ve toksikolojik konularının modern değerlendirmesi için iş gücü haline gelmiştir². Bu tür araştırmalar için yaygın olarak kullanılan tahlil sistemleri mikroelektrot dizisi (MEA) ve voltaja duyarlı boya bazlı deneysel yaklaşımlardır³.

Bununla birlikte, bu hücre tipinin iddia edilen fenotipik ve fonksiyonel olgunlaşmamışlığı, klinik olmayan ve klinik çalışmalar arasındaki translasyonel boşlukları azaltma potansiyeli olan ideal bir insan tabanlı hücre modelinin önüne engeller koymaktadır⁴.

İma edilen olgunlaşmamış fenotipin nedenini anlamak ve insan iPSC-CM'lerinin olgunlaşma sürecini in vitro olarak zorlamanın yollarını bulmak için yıllar boyunca muazzam araştırmalar yapılmıştır.

Uzun hücre kültürü süreleri, civardaki diğer hücre tiplerinin yokluğu veya hormonal stimülasyon eksikliği gibi kardiyak olgunlaşma ipuçlarının eksikliğinin olgunlaşma sürecini etkilediği gösterilmiştir⁵. Ayrıca, düzenli hücre kültürü plakalarının fizyolojik olmayan ortamı, doğal insan kalbinin eksik fizyolojik substrat sertliği nedeniyle insan iPSC-CM'lerinin olgunlaşmasını engelleyen önemli bir neden olarak tanımlanmıştır ^5,6.

Bu sorunun üstesinden gelmek için, hücrelerin tipik iki boyutlu hücre kültürleri yerine doğal kardiyak mimariye benzeyecek şekilde üç boyutlu olarak hizalandığı 3D hücre kültürü sistemleri de dahil olmak üzere doğal fizyolojik koşullara odaklanan farklı tahlil sistemleri geliştirilmiştir⁷. Her ne kadar 3D analizlerle daha iyi olgunlaşma elde edilse de, vasıflı bir işgücüne duyulan ihtiyaç ve bu sistemlerin düşük verimi, ilaç geliştirme sürecinde bunun bol miktarda kullanılmasını engellemektedir, çünkü zaman ve maliyet, yeni terapötiklerin finansal düzeyde değerlendirilmesinde temel bir rol oynamaktadır⁸.

Yeni terapötiklerin güvenlik farmakolojik ve toksikolojik değerlendirmesi için önemli okumalar, insan iPSC-CM'lerinin fonksiyonel ve yapısal özelliklerindeki değişikliklerdir, çünkü kardiyovasküler sistemin bileşiğe bağlı advers ilaç reaksiyonları genellikle bu özelliklerden birini veya her ikisini de etkiler ^1,9. Bu kadar geniş advers reaksiyonların iyi bilinen örnekleri, antrasiklin ailesinin anti-kanser ilaçlarıdır. Burada, kardiyovasküler sistem üzerindeki tehlikeli fonksiyonel ve olumsuz yapısal etkiler, hastalarda kanser tedavisi sırasında ve sonrasında ve ayrıca in vitro hücre bazlı tahlillerde yaygın olarak bildirilmektedir^10,11.

Bu çalışmada, hiPSC-CM'ler üzerindeki hem fonksiyonel hem de yapısal bileşik yan etkilerinin değerlendirilmesi için kapsamlı bir metodoloji açıklanmaktadır. Metodoloji, kardiyomiyosit kontraktil kuvvetinin analizini ve empedans/Hücre Dışı Alan Potansiyeli (EFP) analizini içerir. Kasılma kuvveti, fizyolojik mekanik koşullar altında, doğal insan kalp dokusunun mekanik ortamını yansıtan yumuşak (33 kPa) silikon substratlar üzerinde kültürlenmiş hücrelerle ölçülür.

Sistem, klinik öncesi kardiyak güvenlik farmakolojik ve toksikolojik çalışmaları için insan iPSC-CM'lerinin yüksek verimli analizi için 96 kuyucuklu plakalarla donatılmıştır ve bu nedenle Langendorff kalp veya kalp dilimleri^12,13 gibi şu anda kullanılan ^3D yaklaşımlara avantaj sağlar.

Ayrıntılı olarak, hibrid sistem, fizyolojik koşullar altında kardiyak kontraktilitenin değerlendirilmesi veya gerçek zamanlı hücresel yapısal toksisitenin analizi için iki modülden oluşur ^6,14. Her iki modül de hızlı ve uygun maliyetli veri toplama için özel yüksek verimli 96 delikli plakalarla çalışır.

Bir 3D yapıya ihtiyaç duymadan, kontraktilite modülü, normal hücre kültürü plakalarının genellikle içerdiği sert cam veya plastik yerine, hücreler için substrat olarak esnek silikon membranlar içeren özel plakalar kullanır. Membranlar tipik insan biyomekanik kalp özelliklerini yansıtır ve bu nedenle in vivo koşulları yüksek verimle taklit eder. İnsan iPSC-CM'leri genellikle diğer hücre bazlı tahlillerde bileşik kaynaklı pozitif inotropi ile ilgili yetişkin kardiyomiyosit davranışını gösteremezken^{, hücreler} kontraktilite modülünün plakaları üzerinde kültürlendiğinde daha yetişkin benzeri bir reaksiyon değerlendirilebilir. Önceki çalışmalarda, iPSC-CM'lerin izoproterenol, S-Bay K8644 veya omecamtiv mecarbil ^6,15 gibi bileşiklerle tedavi üzerine pozitif inotropik etkiler gösterdiği gösterilmiştir. Burada, kasılma kuvvetinin genliği (mN/^mm2), vuruş süresi ve vuruş hızı gibi birincil parametrelerin yanı sıra eğrinin altındaki alan, kasılma ve gevşeme eğimleri, vuruş hızı değişimleri ve aritmiler gibi büzülme döngüsünün ikincil parametreleri gibi çoklu kontraktilite parametreleri değerlendirilebilir (Ek Şekil 1)¹⁶ . Tüm parametrelerdeki ilaca bağlı değişiklikler, kapasitif mesafe algılaması ile non-invaziv olarak değerlendirilir. Ham veriler daha sonra özel yazılımlar tarafından analiz edilir.

Yapısal toksisite modülü, yapısal hücresel toksisite ve elektrofizyolojik özelliklerin analizi için bir okuma olarak benzersiz empedans ve EFP parametrelerini ekler^17,18. Elektriksel empedans spektroskopisi teknolojisi, bilinen kardiyotoksik bileşiklerle muamele edilmiş insan iPSC-CM'lerinde gösterildiği gibi, gerçek zamanlı olarak izlenen hücre yoğunluğunda veya hücre ve tek katmanlı bütünlükte bileşiğin neden olduğu değişiklikleri ortaya koymaktadır¹³. Farklı frekanslarda (1-100 kHz) empedans okumaları ile fizyolojik bir yanıtı daha da incelemek mümkündür ve böylece membran topografyasındaki, hücre-hücre veya hücre-matris kavşaklarındaki değişiklikleri ortaya çıkarmak mümkündür. İnsan iPSC-CM'lerinin ek EFP kaydı, CiPA çalışması^17,19'un ışığında gösterildiği gibi^, bileşik işlemle ortaya çıkan elektrofizyolojik etkilerin analizini de sağlar.

Bu çalışmada, her ikisi de kardiyotoksik antrasiklinler olarak iyi tanımlanan epirubisin ve doksorubisin ve oldukça düşük kardiyovasküler toksisite riski olan bir tirozin kinaz inhibitörü (TKI) olan erlotinib ile tedavi edilen insan iPSC-CM'leri kullanılmıştır. Epirubisin, doksorubisin ve erlotinib ile kronik değerlendirme 5 gün boyunca yapıldı. Sonuç, hücreler erlotinib ile tedavi edildiğinde kontraktilitede ve baz empedansında küçük değişiklikler gösterir, ancak sırasıyla epirubisin ve doksorubisin ile tedavi edildiğinde kasılma genliği ve baz empedansında zaman ve doza bağlı toksik bir azalma gösterir. Kalsiyum kanal blokeri nifedipin ile akut ölçümler yapıldı ve kasılma genliğinde, alan potansiyel süresinde ve baz empedansında azalma göstererek bu bileşiğin fonksiyonel ve yapısal seviyeler üzerindeki kardiyotoksik yan etkilerini gösterdi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Kontraktilite ve empedans/EFP ölçümü için iş akışı Ek Şekil 2'de verilmiştir.

1. Plaka kaplama

1. Vakumla kapatılmış ambalajı açın ve 96 delikli plakayı çıkarın. Her iki modülün 96 delikli plakaları için taşıma prosedürleri aynıdır. Kasılma plakasını, kontraktilite modülünde ölçüm yapılana kadar ek olarak verilen membran koruması ile örtülü bırakın.
2. Kardiyomiyositlerin tohumlanması için esnek 96 delikli plakaları kaplayın.
   1. 2,75 mL EHS jel kullanıma hazır çözeltiyi steril bir santrifüj tüpünde aktararak seyreltilmiş bir EHS jel kaplama çözeltisi hazırlayın. Ardından Ca 2+^{ve Mg 2+ ile 8,25} mL DPBS ekleyin. Çözeltiyi dikkatlice karıştırın.
      NOT: İsteğe bağlı olarak, fibronektin kuyucukları kaplamak için de kullanılabilir: Ca 2 +^{ve Mg 2 +} ile 13 mL DPBS'de 650 μL fibronektin stok çözeltisini (1 μg / mL) seyrelterek steril bir santrifüj tüpünde 13 mL fibronektin kaplama çözeltisi hazırlayın ve 50 μg / mL çalışma çözeltisi elde edin. Çözeltiyi dikkatlice karıştırın.
3. Kaplama çözeltisini laboratuvar otomasyon robotuna yerleştirilmiş steril bir reaktif rezervuarına aktarın.
4. "ADD100μL" programını kullanarak laboratuvar otomasyon robotu ile kuyu başına 100 μL kaplama çözeltisi ekleyin. Kapağı tekrar 96 delikli plakaya yerleştirin ve 37 ° C'de 3 saat boyunca inkübe edin.
   NOT: Laboratuvar otomasyon robotu programının önceden manuel olarak ayarlanması gerekir.

2. İnsan iPSC türevi kardiyomiyositlerin esnek 96 delikli plakalara tohumlanması (Gün 0)

1. Hücreleri üreticinin yönergelerine göre çözün.
2. Hücreleri manuel bir sayım odasıyla sayın ve hücreleri önerilen kaplama ortamındaki hücreleri hücre üreticisinin talimatlarına göre ayarlayın (örneğin, 1 x 10⁵ hücre / kuyu), bu da⁹⁶ delikli bir plakanın tamamını tohumlamak için 11 x 10 6 hücre / 11 mL ile sonuçlanır.
3. "REMOVE100μL" programını kullanarak laboratuvar otomasyon robotu ile EHS jel çözeltisini kuyulardan çıkarın. Dağıtılan kaplama çözeltisini içeren reaktif haznesini robottan çıkarın.
4. Hücre süspansiyonunu (toplam 11 mL) laboratuvar otomasyon robotuna yerleştirilen steril bir reaktif rezervuarına aktarın ve "CELLS_ADD100 μL" programını kullanarak hücreleri 100 μL / kuyucuk ile tohumlayın.
5. Hücre tohumlamasından hemen sonra, esnek 96 delikli plakayı inkübatöre aktarın (37 ° C,% 5 CO₂, nem kontrollü) ve hücrelerin gece boyunca yerleşmesine izin verin.

3. Esnek 96 delikli plakaların orta değişimi (1. Gün)

1. Plakaları tohumladıktan 18-24 saat sonra, 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde plaka başına en az 22 mL kardiyomiyosit bakım ortamını 37 ° C'ye ısıtın.
2. Taze ortamı (en az 22 mL) steril bir reaktif haznesine aktarın ve laboratuvar otomasyon robotunun hemen yanında bırakın. Robota boş bir reaktif haznesi yerleştirin ve "REMOVE100μL" programı ile orta kaldırma işlemini gerçekleştirin. Daha sonra, atık ortamı içeren reaktif rezervuarını, taze ortamı içeren reaktif rezervuarı ile değiştirin ve "ADD100μL" programı ile kuyu başına 200 μL taze ortam dağıtın. 200 μL/kuyuya ulaşmak için bu adımı iki kez gerçekleştirin.
3. Orta değişimden hemen sonra, plakayı tekrar inkübatöre aktarın.
4. Bileşik ilavesine kadar her gün bir orta değişim (200 μL / kuyu) gerçekleştirin.

4. Bileşik eklemeden önce son orta değişim (Gün 5-7)

1. Bileşik eklemeden 4-6 saat önce son bir ortam değişimi gerçekleştirin.
2. Esnek bir 96 delikli plaka için en az 22 mL tahlil tamponunu ısıtın. Tahlil tamponu, bakım ortamından veya bunların türevlerinden oluşur (örneğin, düşük / hiç serum ortamı, fenol kırmızısı içermeyen ortam veya diğer izotonik tamponlar).
3. Taze ortamı steril bir reaktif haznesine aktarın ve laboratuvar otomasyon robotunun hemen yanında bırakın. Robota boş bir reaktif haznesi yerleştirin ve orta temizleme işlemini gerçekleştirin. Daha sonra, atık ortamını içeren reaktif rezervuarını, taze ortamı içeren reaktif rezervuarı ile değiştirin ve taze ortamın 200 μL / kuyucuğunu dağıtın.
4. Orta değişimden hemen sonra, esnek plakayı inkübatöre geri aktarın.

5. Bileşik toplama ve veri kaydı (Gün 5-7)

NOT: Deney için örnek bir ölçüm planı Ek Şekil 3'te verilmiştir.

1. Steril normal 96 derinliğinde bir kuyu plakası kullanarak laminer akış davlumbazında 4x konsantrasyonda bileşik başına çalışma çözeltisi hazırlayın. Bileşik çözelti, adım 4'te kullanılan tahlil tamponuna dayanır. Bileşik çözeltiyi içeren 96 derinliğindeki kuyucuk plakasını, esnek plaka ile aynı duruma ayarlamak için en az 1 saat boyunca inkübatöre aktarın.
   NOT: Her deney için kullanılan her ilacın 1x konsantrasyonu şekil ve efsanelerde verilmiştir.
2. Bir taban çizgisi ölçümü yapmadan önce plakayı ilgili ölçüm cihazına 1 saat aktarın.
3. Kontrol yazılımında (hibrit hücre analiz sisteminin bir parçası) Düzenleme Protokolü'nü açın ve ilgili ölçüm modu kontraktilitesini veya empedansını/EFP'yi seçin.
4. Süpürme süresini (bir ölçümün uzunluğu; örneğin, 30 sn) ve tekrarlama aralığını (ölçümler arasındaki süre; örneğin, 5 dakika) tanımlayın ve protokol numarasını kaydedin.
5. Protokolü başlat > Devam'ı seçin ve istenen alanları doldurun.
6. Son olarak, Ölçümü başlat'ı seçin. Bileşik eklemeden kısa bir süre önce 5 dakikalık aralıklarla en az üç temel ölçüm (süpürme) gerçekleştirin.
   NOT: Bileşik ilavesinden önce kontraktilite modülünü kullanan bir kontraktilite taban çizgisi ölçümünün örnek verileri Ek Şekil 4'te gösterilmiştir.
7. Esnek 96 delikli plakayı ölçüm cihazından çıkarmadan her bir kuyucuktan 50 μL tahlil tamponunu çıkarın.
8. Ölçüm planına göre, plakanın her bir kuyucuğuna 4x konsantre bileşik çözeltinin 50 μL'sini ekleyin.
9. Bölge işaretçisi ekle'yi seçin ve bileşik toplama işleminden sonra bileşik plaka düzenini ve bileşik çözeltisinin hacmini tanımlayın.
10. Son olarak, Standart ölçümle devam et veya Deneysel plana göre ölçüm serileriyle ilerle'yi seçin.

6. Veri analizi

1. Kayıt yazılımıyla, uzunluğu ve tekrarlama aralığı kullanıcı tarafından tanımlanan ölçüm süpürmeleri.
2. Analiz yazılımıyla, genlik, vuruş hızı, darbe genişliği ve benzeri parametreleri otomatik olarak okuyarak sinyalin şeklini yakalayın.
   NOT: Ortalama vuruş olarak adlandırılan standart sapmayı içeren ortalama bir sinyal, bir taramanın verilerine dayanarak otomatik olarak hesaplanır. Kullanıcı, yazılımın hesapladığı ve görüntülediği kontraktilite/IMP/EFP parametrelerini tanımlayabilir.
3. Analiz yazılımı ile her bileşik için doz-yanıt eğrisini ve IC50/EC50'yi hesaplayın.
   NOT: Ham veriler ve analiz yazılımı ile oluşturulan analiz sonuçları, çeşitli formatlarda kolayca dışa aktarılabilir. Son olarak, deneysel sonuçları özetlemek ve arşivlemek için veri raporları otomatik olarak oluşturulur. Bir EFP sinyalinin ne ve nasıl ölçüldüğüne dair kapsamlı bir açıklama ^17'de tartışılmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Kinaz inhibitörü erlotinibin hiPSC-CM'lerin kontraktilitesi üzerine etkileri Şekil 1'de gösterilmiştir. Hücreler 5 gün boyunca 10 nM ila 10 μM arasında değişen konsantrasyonlarla tedavi edildi ve günlük vuruş parametreleri kaydedildi. Nispeten düşük kardiyotoksisite riski olan bir EGFR (epidermal büyüme faktörü reseptörü) ve tirozin kinaz inhibitörü olan Erlotinib, sadece mikromolar aralıktaki konsantrasyonlarda hiPSC-CM'ler üzerinde küçük bir doz ve zamana ba?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Empedans/EFP/kontraktiliteli hibrid sistem, klinik öncesi ilaç geliştirme için kardiyak yükümlülüklerin yüksek verim güvenliği farmakolojik ve toksikolojik değerlendirmesi için kapsamlı bir metodolojidir. Hayvan modelleri kullanılmadan klinik öncesi güvenlik testleri için modern bir yaklaşım sağlar, ancak zaman ve maliyetleri önemli ölçüde azaltan daha yüksek verim yetenekleri ile. Bu sistem, Langendorff Kalbi ve klinik öncesi fonksiyonel ve yapısal toksisite değerlendirmesi için diğer hayv...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes	Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)	R1059
Centrifuge (50 mL tubes)	Thermo Fisher Scientific	15878722
12-channel adjustable pipette (100-1250 μL)	Integra Biosciences	4634
DPBS with Ca2+ and Mg2+	GE Healthcare HyClone	SH304264.01
96 deep well plate	Thermo Fisher Scientific	A43075
EHS gel			Extracellular Matrix Gel
FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device	Nanion Technologies	19 1004 1005	Hybrid cell analysis system
FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates	Nanion Technologies	20 1010
Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex)	Sigma Aldrich	F1141
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	ThermoFischer Scientific	A1569601
Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium	FCDI	R1059
Incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Fisher Scientific	51023121
Laminar Flow Hood	Thermo Fisher Scientific	51032678
NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent	Nanion Technologies	20 1011
Pipette tips (1250µL)	Integra Biosciences	94420813
Reagent Reservoir	Integra Biosciences	8096-11
Serological pipette (e.g. 25 mL)	Thermo Fisher Scientific	16440901
Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL)	Eppendorf	3123000063
Vacuum aspiration system	Thermo Fisher Scientific	15567479
Optional: VIAFLO ASSIST	Integra Biosciences	4500	Lab automation Robot
Water bath (37 °C)	Thermo Fisher Scientific	15365877