Hybridzell-Analysesystem zur Beurteilung struktureller und kontraktiler Veränderungen von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten für die präklinische kardiale Risikobewertung

Zusammenfassung

Die Analyse von Veränderungen der kontraktilen Funktion und der zellulären Integrität von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten ist von immenser Bedeutung für die nicht-klinische Arzneimittelentwicklung. Ein hybrides 96-Well-Zellanalysesystem adressiert beide Parameter in Echtzeit und physiologisch für zuverlässige, für den Menschen relevante Ergebnisse, die für einen sicheren Übergang in klinische Stadien erforderlich sind.

Zusammenfassung

Die Beurteilung der kardialen Kontraktilität ist von immenser Bedeutung für die Entwicklung neuer Therapeutika und deren sicheren Übergang in die klinischen Stadien. Während human-induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) vielversprechend sind, als humanrelevantes Modell in präklinischen Phasen der Arzneimittelforschung und Sicherheitspharmakologie zu dienen, ist ihre Reife in der wissenschaftlichen Gemeinschaft immer noch umstritten und wird ständig weiterentwickelt. Wir präsentieren eine hybride Kontraktilitäts- und Impedanz-/extrazelluläres Feldpotenzial (EFP)-Technologie, die einer branchenüblichen 96-Well-Plattform signifikante Reifungsmerkmale hinzufügt.

Das Impedanz-/EFP-System überwacht die zelluläre Funktionalität in Echtzeit. Neben der Schlagrate kontraktiler Zellen erkennen die elektrischen Impedanzspektroskopie-Anzeigen verbindungsinduzierte morphologische Veränderungen wie Zelldichte und Integrität der zellulären Monoschicht. In der anderen Komponente des Hybridzellanalysesystems werden die Zellen auf biokonformen Membranen kultiviert, die die mechanische Umgebung von echtem Herzgewebe nachahmen. Diese physiologische Umgebung unterstützt die Reifung von hiPSC-CMs in vitro, was nach der Behandlung mit Isoproterenol, S-Bay K8644 oder omecamtiver Mecarbil zu eher adulten kontraktilen Reaktionen führt, einschließlich positiver inotroper Effekte. Parameter wie die Amplitude der Kontraktionskraft (mN/^mm2) und die Schlagdauer zeigen auch nachgeschaltete Effekte von Verbindungen mit Einfluss auf die elektrophysiologischen Eigenschaften und den Umgang mit Kalzium.

Das Hybridsystem bietet das ideale Werkzeug für die ganzheitliche Zellanalyse und ermöglicht eine präklinische kardiale Risikobewertung über die aktuellen Perspektiven humanrelevanter zellbasierter Assays hinaus.

Einleitung

Eines der Hauptziele der modernen Arzneimittelentwicklung ist die Verbesserung der Erfolgsrate neuer Therapeutika in der Wirkstoffforschungspipeline vom Labor bis zum Krankenbett. Pharmakologische Sicherheitstests dieser neuen Medikamente zeigen häufig unerwünschte Arzneimittelwirkungen auf das Herz-Kreislauf-System, die fast ein Viertel der Fluktuationsrate in präklinischen Stadien ausmachen¹. Die Entwicklung und Integration neuer Ansatzmethoden (NAMs) spielt eine Schlüsselrolle bei der Modernisierung der präklinischen Bewertung, insbesondere der Kernorgane der Batterie wie des Herzens. Da es sich bei diesen Methoden um tierversuchsfreie Ansätze handelt, wurde die Verwendung humanbasierter Zellmodelle wie Kardiomyozyten (CMs) mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) in den letzten zehn Jahren zum Arbeitspferd für die moderne Bewertung von sicherheitspharmakologischen und toxikologischen Fragestellungen². Weit verbreitete Assay-Systeme für solche Untersuchungen sind Mikroelektroden-Arrays (MEA) und spannungsempfindliche farbstoffbasierte experimentelle Ansätze³.

Nichtsdestotrotz stellt die behauptete phänotypische und funktionelle Unreife dieses Zelltyps Hindernisse für ein ideales humanbasiertes Zellmodell dar, mit dem Potenzial, translationale Lücken zwischen nicht-klinischen und klinischen Studien zu verringern⁴.

Im Laufe der Jahre wurde eine enorme Forschung durchgeführt, um den Grund für den implizierten unreifen Phänotyp zu verstehen und Wege zu finden, den Reifungsprozess von humanen iPSC-CMs in vitro voranzutreiben.

Es wurde gezeigt, dass fehlende kardiale Reifungssignale wie verlängerte Zellkulturzeiten, das Fehlen anderer Zelltypen in der Nähe oder ein Mangel an hormoneller Stimulation den Reifungsprozess beeinflussen⁵. Auch die nicht-physiologische Umgebung regulärer Zellkulturplatten wurde als eine signifikante Ursache identifiziert, die die Reifung von humanen iPSC-CMs aufgrund der fehlenden physiologischen Substratsteifigkeit des nativen menschlichen Herzens behindert ^5,6.

Um dieses Problem anzugehen, wurden verschiedene Assay-Systeme entwickelt, die sich auf native physiologische Bedingungen konzentrieren, darunter 3D-Zellkultursysteme, bei denen Zellen dreidimensional ausgerichtet sind, um einer nativen Herzarchitektur anstelle von typischen zweidimensionalen Zellkulturen zu ähneln⁷. Obwohl mit 3D-Assays eine verbesserte Reifung erreicht wird, behindern der Bedarf an qualifizierten Arbeitskräften und der geringe Durchsatz dieser Systeme eine reichliche Verwendung im Arzneimittelentwicklungsprozess, da Zeit und Kosten eine grundlegende Rolle bei der Bewertung neuer Therapeutika auf finanzieller Ebene spielen⁸.

Wichtige Erkenntnisse für die pharmakologische und toxikologische Sicherheitsbewertung neuer Therapeutika sind Veränderungen der funktionellen und strukturellen Eigenschaften humaner iPSC-CMs, da verbindungsinduzierte unerwünschte Arzneimittelwirkungen des kardiovaskulären Systems in der Regel eine oder beide dieser Eigenschaften beeinflussen ^1,9. Bekannte Beispiele für solche breiten Nebenwirkungen sind Krebsmedikamente der Anthrazyklin-Familie. Hier wird ausführlich über gefährliche funktionelle und nachteilige strukturelle Auswirkungen auf das Herz-Kreislauf-System während und nach der Krebsbehandlung bei Patienten sowie mit zellbasierten In-vitro-Assays berichtet^10,11.

In der vorliegenden Studie beschreiben wir eine umfassende Methodik zur Bewertung von funktionellen und strukturellen Nebenwirkungen von hPSC-CMs. Die Methodik umfasst die Analyse der Kardiomyozytenkontraktionskraft und der Impedanz/Analyse des extrazellulären Feldpotentials (EFP). Die kontraktile Kraft wird unter physiologisch-mechanischen Bedingungen gemessen, wobei die Zellen auf weichen (33 kPa) Silikonsubstraten kultiviert werden, die die mechanische Umgebung des natürlichen menschlichen Herzgewebes widerspiegeln.

Das System ist mit 96-Well-Platten für die Hochdurchsatzanalyse von humanen iPSC-CMs für präklinische pharmakologische und toxikologische Studien zur kardialen Sicherheit ausgestattet und bietet damit einen Vorteil gegenüber derzeit verwendeten 3D-Ansätzen wie Langendorff-Herz oder Herzschnitten^12,13.

Im Detail besteht das Hybridsystem aus zwei Modulen, entweder zur Beurteilung der kardialen Kontraktilität unter physiologischen Bedingungen oder zur Analyse der zellulären Strukturtoxizität^{in Echtzeit 6,14}. Beide Module arbeiten mit speziellen 96-Well-Platten mit hohem Durchsatz für eine schnelle und kostengünstige Datenerfassung.

Ohne dass ein 3D-Konstrukt erforderlich ist, verwendet das Kontraktilitätsmodul spezielle Platten, die flexible Silikonmembranen als Substrat für die Zellen enthalten, anstelle des steifen Glases oder Kunststoffs, aus dem normale Zellkulturplatten normalerweise bestehen. Die Membranen spiegeln typische biomechanische Herzeigenschaften des Menschen wider und ahmen daher in vivo Bedingungen im Hochdurchsatz nach. Während humane iPSC-CMs in anderen zellbasierten Assays oft kein adultes Kardiomyozytenverhalten in Bezug auf die verbindungsinduzierte positive Inotropie zeigen¹⁴, kann eine erwachsenere Reaktion beurteilt werden, wenn die Zellen auf den Platten des Kontraktilitätsmoduls kultiviert werden. In früheren Studien wurde gezeigt, dass iPSC-CMs positive inotrope Wirkungen bei der Behandlung mit Verbindungen wie Isoproterenol, S-Bay K8644 oder Omecamtiv Mecarbil ^6,15 zeigen. Hier können mehrere Kontraktilitätsparameter bewertet werden, wie z. B. primäre Parameter wie die Amplitude der Kontraktionskraft (mN/mm²), die Schlagdauer und die Schlagfrequenz sowie sekundäre Parameter des Kontraktionszyklus wie Fläche unter der Kurve, Kontraktions- und Relaxationssteigungen, Schlaggeschwindigkeitsschwankungen und Arrhythmien (ergänzende Abbildung 1)¹⁶ . Medikamenteninduzierte Veränderungen in allen Parametern werden nicht-invasiv durch kapazitive Distanzmessung erfasst. Die Rohdaten werden anschließend von einer speziellen Software analysiert.

Das Modul für strukturelle Toxizität fügt seine einzigartigen Impedanz- und EFP-Parameter als Anzeige für die strukturelle zelluläre Toxizität und die Analyse der elektrophysiologischen Eigenschaften^{hinzu 17,18}. Die elektrische Impedanzspektroskopie-Technologie zeigt verbindungsinduzierte Veränderungen der Zelldichte oder der Zell- und Monoschichtintegrität, die in Echtzeit überwacht werden, wie bei humanen iPSC-CMs gezeigt wurde, die mit bekannten kardiotoxischen Verbindungen behandelt wurden¹³. Mit Impedanzanzeigen bei verschiedenen Frequenzen (1-100 kHz) ist es möglich, eine physiologische Reaktion weiter zu sezieren und somit Veränderungen in der Membrantopographie, Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Verbindungen aufzudecken. Die zusätzliche EFP-Aufzeichnung von humanen iPSC-CMs ermöglicht darüber hinaus die Analyse von elektrophysiologischen Effekten, die durch die Behandlung mit Wirkstoffen hervorgerufen werden, wie im Lichte der CiPA-Studie^{gezeigt wurde 17,19}.

In der vorliegenden Studie wurden humane iPSC-CMs verwendet, die mit Epirubicin und Doxorubicin, die beide als kardiotoxische Anthrazykline beschrieben werden, und Erlotinib, einem Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI) mit einem relativ geringen Risiko für kardiovaskuläre Toxizität, behandelt wurden. Die chronische Beurteilung mit Epirubicin, Doxorubicin und Erlotinib wurde über 5 Tage durchgeführt. Das Ergebnis zeigt geringfügige Veränderungen der Kontraktilität und Basenimpedanz, wenn die Zellen mit Erlotinib behandelt wurden, aber eine zeit- und dosisabhängige toxische Abnahme der Kontraktionsamplitude und Basenimpedanz, wenn sie mit Epirubicin bzw. Doxorubicin behandelt wurden. Akute Messungen wurden mit dem Calciumkanalblocker Nifedipin durchgeführt und zeigten eine Abnahme der Kontraktionsamplitude, der Feldpotentialdauer und der Basenimpedanz, was kardiotoxische Nebenwirkungen dieser Verbindung sowohl auf funktioneller als auch auf struktureller Ebene zeigte.

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Protokoll

HINWEIS: Der Arbeitsablauf für die Kontraktilitäts- und Impedanz-/EFP-Messung ist in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt.

1. Plattenbeschichtung

1. Öffnen Sie die vakuumversiegelte Verpackung und nehmen Sie die 96-Well-Platte heraus. Die Handhabung der 96-Well-Platten beider Module ist gleich. Lassen Sie die Kontraktionsplatte bis zur Messung im Kontraktilitätsmodul durch den zusätzlich mitgelieferten Membranschutz abgedeckt.
2. Beschichten Sie die flexiblen 96-Well-Platten für die Aussaat von Kardiomyozyten.
   1. Bereiten Sie eine verdünnte EHS-Gelbeschichtungslösung vor, indem Sie 2,75 ml gebrauchsfertige EHS-Gel-Lösung in ein steriles Zentrifugenröhrchen überführen. Dann fügen Sie 8,25 ml DPBS mit Ca^{2 +} und Mg²⁺ hinzu. Mischen Sie die Lösung vorsichtig.
      HINWEIS: Optional kann Fibronektin auch für die Beschichtung der Vertiefungen verwendet werden: Bereiten Sie 13 ml Fibronektin-Beschichtungslösung in einem sterilen Zentrifugenröhrchen vor, indem Sie 650 μL Fibronektin-Stammlösung (1 μg/ml) in 13 ml DPBS mit Ca2+ und^Mg2+ verdünnen, was zu einer 50 μg/ml Arbeitslösung führt. Mischen Sie die Lösung vorsichtig.
3. Übertragen Sie die Beschichtungslösung in ein steriles Reagenzienreservoir, das sich im Laborautomatisierungsroboter befindet.
4. Geben Sie 100 μL der Beschichtungslösung pro Vertiefung mit dem Laborautomatisierungsroboter unter Verwendung des Programms "ADD100μL" hinzu. Setzen Sie den Deckel wieder auf die 96-Well-Platte und inkubieren Sie ihn 3 h bei 37 °C.
   HINWEIS: Das Programm für den Laborautomatisierungsroboter muss vorher manuell voreingestellt werden.

2. Aussaat von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten in flexible 96-Well-Platten (Tag 0)

1. Tauen Sie die Zellen gemäß den Richtlinien des Herstellers auf.
2. Zählen Sie die Zellen mit einer manuellen Zählkammer und stellen Sie die Zellen im empfohlenen Beschichtungsmedium gemäß den Anweisungen des Zellherstellers ein (z. B. 1 x 10⁵ Zellen / Well), was zu 11 x 10⁶ Zellen / 11 ml für die Aussaat einer gesamten 96-Well-Platte führt.
3. Entfernen Sie die EHS-Gellösung mit dem Laborautomatisierungsroboter mit dem Programm "REMOVE100μL" aus den Vertiefungen. Entfernen Sie das Reagenzreservoir mit der abgegebenen Beschichtungslösung vom Roboter.
4. Die Zellsuspension (insgesamt 11 ml) wird in ein steriles Reagenzienreservoir im Laborautomatisierungsroboter überführt und mit dem Programm "CELLS_ADD100 μL" mit 100 μL/Well beimpft.
5. Unmittelbar nach der Zellaussaat die flexible 96-Well-Platte in den Inkubator (37 °C, 5 %_CO2, feuchtigkeitsgeregelt) überführen und die Zellen über Nacht absetzen lassen.

3. Mittlerer Austausch von flexiblen 96-Well-Platten (Tag 1)

1. Erwärmen Sie mindestens 22 mL Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium pro Platte auf 37 °C in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen, 18-24 h nach der Aussaat der Platten.
2. Füllen Sie das frische Medium (mindestens 22 ml) in ein steriles Reagenzienreservoir und lassen Sie es direkt neben dem Laborautomatisierungsroboter stehen. Legen Sie einen leeren Reagenzienbehälter in den Roboter und führen Sie mit dem Programm "REMOVE100μL" eine Medienentnahme durch. Anschließend tauschen Sie das Reagenzreservoir, das das Abfallmedium enthält, gegen das Reagenzreservoir aus, das das Frischmedium enthält, und geben Sie mit dem Programm "ADD100μL" 200 μL des Frischmediums pro Vertiefung aus. Führen Sie diesen Schritt zweimal durch, um einen Topf von 200 μL/well zu erreichen.
3. Unmittelbar nach dem Mediumwechsel die Platte wieder in den Inkubator überführen.
4. Führen Sie jeden zweiten Tag einen Mediumsaustausch (200 μl/Well) durch, bis die Verbindung zugegeben wird.

4. Letzter Mediumsaustausch vor der Zugabe der Verbindung (Tag 5-7)

1. Führen Sie 4-6 h vor der Zugabe der Verbindung einen letzten Mediumwechsel durch.
2. Erwärmen Sie mindestens 22 ml Assay-Puffer für eine flexible 96-Well-Platte. Der Assay-Puffer besteht aus Erhaltungsmedien oder deren Derivaten (z. B. niedrige/keine Serummedien, phenolrotfreie Medien oder andere isotonische Puffer).
3. Füllen Sie das frische Medium in ein steriles Reagenzienreservoir um und stellen Sie es direkt neben dem Laborautomatisierungsroboter ab. Legen Sie ein leeres Reagenzienreservoir in den Roboter und führen Sie eine Mediumentfernung durch. Tauschen Sie anschließend das Reagenzreservoir, das das Abfallmedium enthält, gegen das Reagenzreservoir aus, das das frische Medium enthält, und geben Sie 200 μl/Vertiefung des frischen Mediums ab.
4. Unmittelbar nach dem Mediumwechsel die flexible Platte wieder in den Inkubator überführen.

5. Compound-Addition und Datenaufzeichnung (Tag 5-7)

ANMERKUNG: Ein Beispiel für einen Messplan für das Experiment ist in der ergänzenden Abbildung 3 dargestellt.

1. Bereiten Sie die Arbeitslösung pro Verbindung in 4-facher Konzentration in der Laminar-Flow-Haube unter Verwendung einer sterilen regulären 96-Tiefen-Well-Platte vor. Die zusammengesetzte Lösung basiert auf dem in Schritt 4 verwendeten Assay-Puffer. Übertragen Sie die 96-Tiefen-Well-Platte mit der zusammengesetzten Lösung für mindestens 1 Stunde in den Inkubator, um sie auf den gleichen Zustand wie die flexible Platte einzustellen.
   HINWEIS: Die 1x-Konzentration jedes Medikaments, das für jedes Experiment verwendet wird, ist in den Abbildungen und Legenden angegeben.
2. Übertragen Sie die Platte 1 h vor der Basismessung auf das jeweilige Messgerät.
3. Öffnen Sie in der Steuerungssoftware (Teil des Hybridzellanalysesystems) das Edit-Protokoll und wählen Sie den jeweiligen Messmodus Kontraktilität oder Impedanz/EFP aus.
4. Definieren Sie die Sweep-Dauer (Länge einer Messung, z. B. 30 s) und das Wiederholungsintervall (Zeit zwischen den Messungen, z. B. 5 Minuten) und speichern Sie die Protokollnummer.
5. Wählen Sie Protokoll starten > Weiter und füllen Sie die erforderlichen Felder aus.
6. Wählen Sie abschließend Messung starten aus. Führen Sie mindestens drei Baseline-Messungen (Sweeps) in 5-Minuten-Intervallen kurz vor der Zugabe der Verbindung durch.
   ANMERKUNG: Beispieldaten einer Kontraktilitäts-Baseline-Messung mit dem Kontraktilitätsmodul vor der Compound-Addition sind in der ergänzenden Abbildung 4 dargestellt.
7. Entfernen Sie 50 μl des Assay-Puffers aus jeder Vertiefung, ohne die flexible 96-Well-Platte vom Messgerät zu entfernen.
8. Geben Sie 50 μL der 4x konzentrierten Verbindungslösung gemäß dem Messplan in jede Vertiefung der Platte.
9. Wählen Sie Bereichsmarkierung hinzufügen und definieren Sie das Layout der Verbundplatte und das Volumen der Verbindungslösung nach der Zugabe der Verbindung.
10. Wählen Sie abschließend Mit Standardmessung fortfahren oder Mit Messreihen gemäß Versuchsplan fortfahren.

6. Datenanalyse

1. Messen Sie mit einer Aufzeichnungssoftware Sweeps, deren Länge und Wiederholungsintervall vom Benutzer definiert werden.
2. Mit der Analysesoftware können Sie die Form des Signals erfassen, indem Sie Parameter wie Amplitude, Schlagfrequenz, Pulsbreite usw. automatisch auslesen.
   HINWEIS: Ein gemitteltes Signal mit der Standardabweichung, dem sogenannten Mean Beat, wird automatisch auf Basis der Daten eines Sweeps berechnet. Der Benutzer kann die Kontraktilitäts-/IMP-/EFP-Parameter definieren, die die Software berechnet und anzeigt.
3. Berechnen Sie mit der Analysesoftware die Dosis-Wirkungs-Kurve und IC50/EC50 für jede Verbindung.
   HINWEIS: Die Rohdaten und die Analyseergebnisse, die mit der Analysesoftware generiert wurden, können einfach in eine Vielzahl von Formaten exportiert werden. Schließlich werden die Datenberichte automatisch generiert, um die experimentellen Ergebnisse zusammenzufassen und zu archivieren. Eine umfassende Beschreibung, was und wie ein EFP-Signal gemessen wird, wird in ¹⁷ diskutiert.

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Ergebnisse

Die Auswirkungen des Kinase-Inhibitors Erlotinib auf die Kontraktilität von hiPSC-CMs sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Zellen wurden 5 Tage lang mit Konzentrationen im Bereich von 10 nM bis 10 μM behandelt und die Schlagparameter wurden täglich aufgezeichnet. Erlotinib, ein EGFR (epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor) und Tyrosinkinase-Inhibitor mit einem vergleichsweise geringen Risiko für Kardiotoxizität, hatte nur bei Konzentrationen im mikromolaren Bereich eine geringe dosis- und...

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Diskussion

Das Impedanz-/EFP-/Kontraktilitäts-Hybridsystem ist eine umfassende Methodik für die pharmakologische und toxikologische Bewertung der kardialen Verbindlichkeiten im Hochdurchsatz für die präklinische Arzneimittelentwicklung. Es bietet einen modernen Ansatz für präklinische Sicherheitstests ohne den Einsatz von Tiermodellen, aber mit höheren Durchsatzkapazitäten, die Zeit und Kosten erheblich reduzieren. Dieses System hat das Potenzial, als komplementärer Ansatz für das Langendorff-Herz und andere Tiermodelle z...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes	Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)	R1059
Centrifuge (50 mL tubes)	Thermo Fisher Scientific	15878722
12-channel adjustable pipette (100-1250 μL)	Integra Biosciences	4634
DPBS with Ca2+ and Mg2+	GE Healthcare HyClone	SH304264.01
96 deep well plate	Thermo Fisher Scientific	A43075
EHS gel			Extracellular Matrix Gel
FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device	Nanion Technologies	19 1004 1005	Hybrid cell analysis system
FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates	Nanion Technologies	20 1010
Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex)	Sigma Aldrich	F1141
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	ThermoFischer Scientific	A1569601
Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium	FCDI	R1059
Incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Fisher Scientific	51023121
Laminar Flow Hood	Thermo Fisher Scientific	51032678
NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent	Nanion Technologies	20 1011
Pipette tips (1250µL)	Integra Biosciences	94420813
Reagent Reservoir	Integra Biosciences	8096-11
Serological pipette (e.g. 25 mL)	Thermo Fisher Scientific	16440901
Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL)	Eppendorf	3123000063
Vacuum aspiration system	Thermo Fisher Scientific	15567479
Optional: VIAFLO ASSIST	Integra Biosciences	4500	Lab automation Robot
Water bath (37 °C)	Thermo Fisher Scientific	15365877