전임상 심장 위험 평가를 위해 인간 iPSC 유래 심근 세포의 구조적 및 수축성 변화를 평가하기위한 하이브리드 세포 분석 시스템

요약

인간 iPSC 유래 심근 세포의 수축 기능 및 세포 무결성의 변화 분석은 비임상 약물 개발에 매우 중요합니다. 하이브리드 96웰 세포 분석 시스템은 임상 단계로의 안전한 전환에 필요한 신뢰할 수 있는 인간 관련 결과를 위해 실시간 및 생리학적 방식으로 두 파라미터를 모두 처리합니다.

초록

심장 수축성 평가는 새로운 치료제의 개발과 임상 단계로의 안전한 전환에 매우 중요합니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)는 약물 발견 및 안전 약리학의 전임상 단계에서 인간 관련 모델로 사용될 것으로 기대되지만, 그 성숙도는 여전히 과학계에서 논란의 여지가 있으며 지속적으로 개발 중입니다. 우리는 하이브리드 수축성 및 임피던스/세포외 전위(EFP) 기술을 제시하여 산업 표준 96웰 플랫폼에 상당한 성숙 방지 기능을 추가합니다.

임피던스/EFP 시스템은 실시간으로 셀룰러 기능을 모니터링합니다. 수축 세포의 박동 속도 외에도 전기 임피던스 분광법 판독값은 세포 밀도 및 세포 단층의 무결성과 같은 화합물 유도 형태학적 변화를 감지합니다. 하이브리드 세포 분석 시스템의 다른 구성 요소에서 세포는 실제 심장 조직의 기계적 환경을 모방하는 생체 적합성 막에서 배양됩니다. 이 생리적 환경은 시험관 내에서 hiPSC-CM의 성숙을 지원하여 이소프로테레놀, S-Bay K8644 또는 omecamtiv mecarbil로 치료한 후 양성 변성 효과를 포함하여 성인과 같은 수축 반응을 유발합니다. 수축력의 진폭 (mN /^mm2) 및 박동 지속 시간과 같은 매개 변수는 전기 생리 학적 특성 및 칼슘 취급에 영향을 미치는 화합물의 다운 스트림 효과를 나타냅니다.

하이브리드 시스템은 전체론적 세포 분석을 위한 이상적인 도구를 제공하여 인간 관련 세포 기반 분석의 현재 관점을 넘어 전임상 심장 위험 평가를 가능하게 합니다.

서문

현대 약물 개발의 주요 목표 중 하나는 약물 발견 파이프 라인에서 새로운 치료법의 벤치 투 병상 성공률을 향상시키는 것입니다. 이러한 신약의 안전성 약리학적 검사는 종종 전^{임상 단계에서 약물} 소모율의 거의 1/4을 차지하는 심혈관계에 대한 약물 부작용을 나타냅니다1. 새로운 접근법 방법론(NAM)의 개발 및 통합은 전임상 평가, 특히 심장과 같은 핵심 배터리 기관의 현대화에 핵심적인 역할을 합니다. 이러한 방법론은 동물이 없는 접근 방식이기 때문에 유도만능줄기세포(iPSC) 기원의 심근세포(CM)와 같은 인간 기반 세포 모델의 사용은 지난 10년 동안 안전성 약리^{학적 및 독성}학적 문제의 현대적 평가를 위한 주력 제품이 되었습니다2. 이러한 조사를 위해 널리 사용되는 분석 시스템은 미세 전극 어레이 (MEA) 및 전압에 민감한 염료 기반 실험 접근법³입니다.

그럼에도 불구하고, 이 세포 유형의 표현형 및 기능적 미성숙은 비임상 연구와^{임상 연구 사이의} 번역 격차를 줄일 수 있는 잠재력을 가진 이상적인 인간 기반 세포 모델의 길에 장애물을 놓는다4.

내포된 미성숙 표현형의 이유를 이해하고 시험관 내에서 인간 iPSC-CM의 성숙 과정을 추진하는 방법을 찾기 위해 수년에 걸쳐 엄청난 연구가 수행되었습니다.

세포 배양 시간 연장, 주변에 다른 세포 유형의 부재 또는 호르몬 자극 부족과 같은 심장 성숙 단서가 부족하면^{성숙 과정에 영향을} 미치는 것으로 나타났습니다5. 또한, 일반 세포 배양 플레이트의 비생리학적 환경은^인간 iPSC-CM의 성숙을 방해하는 중요한 원인으로 확인되었으며, 이는 천연 인간 심장의 생리적 기질 경직성 누락으로 인해 ^5,6.

이 문제를 해결하기 위해 천연 생리적 조건에 초점을 맞춘 다양한 분석 시스템이 개발되었으며, 여기에는 세포가 일반적인 2차원 세포 배양 대신 천연 심장 구조와 유사하도록 3차원으로 정렬되는 3D 세포 배양 시스템이^{포함됩니다7.} 3D 분석으로 향상된 성숙도를 얻을 수 있지만, 시간과 비용이^{재무 수준에서 새로운} 치료제를 평가하는 데 근본적인 역할을 하기 때문에 숙련된 인력의 필요성과 이러한 시스템의 낮은 처리량은 약물 개발 프로세스에서 이를 풍부하게 사용하는 데 방해가 됩니다8.

새로운 치료제의 안전성 약리학적 및 독성학적 평가를 위한 중요한 판독값은 인간 iPSC-CM의 기능적 및 구조적 특성의 변화인데, 이는 심혈관계의 화합물 유발 약물 부작용이 일반적으로^{이러한 특성 중} 하나 또는 둘 다에 영향을 미치기 때문입니다^1,9. 이러한 광범위한 부작용의 잘 알려진 예는 안트라사이클린 계열의 항암제입니다. 여기에서 심혈관 시스템에 대한 유해한 기능적 및 유해한 구조적 영향은 환자의 암 치료 중 및 치료 후 뿐만 아니라 시험관 내 세포 기반 분석^10,11에서도 널리 보고됩니다.

본 연구에서는 hiPSC-CM에 대한 기능적 및 구조적 화합물 부작용을 평가하기위한 포괄적 인 방법론을 설명합니다. 이 방법론에는 심근 세포 수축력 분석 및 임피던스 / 세포 외 전위 (EFP) 분석이 포함됩니다. 수축력은 생리적 기계적 조건에서 측정되며, 세포는 천연 인간 심장 조직의 기계적 환경을 반영하여 연질(33kPa) 실리콘 기질에서 배양됩니다.

이 시스템에는 전임상 심장 안전 약리학 및 독성학 연구를 위한 인간 iPSC-CM의 고처리량 분석을 위한 96웰 플레이트가 장착되어 있어 Langendorff 심장 또는 심장 슬라이스^12,13과 같이 현재 사용되는 3D 접근 방식에 이점을 제공합니다.

세부적으로, 하이브리드 시스템은 생리적 조건 하에서의 심장 수축성 평가 또는 실시간 세포 구조 독성^{분석 (6,14})의 두 가지 모듈로 구성됩니다. 두 모듈 모두 빠르고 비용 효율적인 데이터 수집을 위해 특수 고처리량 96웰 플레이트와 함께 작동합니다.

3D 구조가 필요 없는 수축성 모듈은 일반 세포 배양 플레이트가 일반적으로 구성되는 뻣뻣한 유리 또는 플라스틱 대신 유연한 실리콘 멤브레인을 포함하는 특수 플레이트를 세포의 기판으로 사용합니다. 멤브레인은 전형적인 인간의 생체 역학적 심장 특성을 반영하므로 높은 처리량 방식으로 생체 내 조건을 모방합니다. 인간 iPSC-CM은 종종 다른 세포 기반 분석에서 화합물-유도된 양성 변성에 관한 성인 심근세포 거동을 나타내지 못하는 반면(¹⁴), 세포가 수축성 모듈의 플레이트 상에서 배양될 때 보다 성인-유사 반응이 평가될 수 있다. 이전 연구에서 iPSC-CM은 이소프로테레놀, S-Bay K8644 또는 omecamtiv mecarbil ^6,15와 같은 화합물로 치료할 때 긍정적인 변성 효과를 나타내는 것으로 입증되었습니다. 여기에서 수축력의 진폭(mN/^mm2), 박동 지속 시간 및 박동 속도와 같은 1차 매개변수와 곡선 아래 면적, 수축 및 이완 기울기, 박동률 변화 및 부정맥과 같은 수축 주기의 2차 매개변수와 같은 여러 수축성 매개변수를 평가할 수 있습니다(보충 그림 1)¹⁶ . 모든 파라미터에서 약물-유도된 변화는 용량성 거리 감지에 의해 비침습적으로 평가된다. 원시 데이터는 특수 소프트웨어에 의해 분석됩니다.

구조적 독성 모듈은 구조적 세포 독성 및 전기 생리 학적 특성^{분석 17,18}에 대한 판독 값으로 고유 한 임피던스 및 EFP 매개 변수를 추가합니다. 전기 임피던스 분광법 기술은 알려진 심장 독성 화합물로 처리 된 인간 iPSC-CM에서 볼 수 있듯이 실시간으로 모니터링되는 세포 밀도 또는 세포 및 단층 무결성의 화합물 유도 변화를 나타냅니다¹³. 다양한 주파수(1-100kHz)에서 임피던스 판독값을 사용하면 생리적 반응을 추가로 해부할 수 있으므로 막 지형, 세포-셀 또는 세포-매트릭스 접합의 변화를 밝힐 수 있습니다. 인간 iPSC-CM의 추가 EFP 기록은 CiPA 연구^17,19에 비추어 나타난 바와 같이 화합물 처리에 의해 유도된 전기생리학적 효과의 분석을 추가로 가능하게 합니다.

본 연구에서, 인간 iPSC-CM은 심장 독성 안트라 사이클린으로 잘 설명 된 에피 루비 신 및 독소루비신과 심혈관 독성 위험이 다소 낮은 티로신 키나제 억제제 (TKI) 인 erlotinib으로 치료되었습니다. 에피 루비 신, 독소루비신 및 에를로 티닙을 사용한 만성 평가를 5 일 동안 수행했습니다. 결과는 세포가 erlotinib으로 처리되었을 때 수축성 및 염기 임피던스의 약간의 변화를 보여 주지만, 각각 에피 루비 신 및 독소루비신으로 처리했을 때 수축 진폭 및 염기 임피던스의 시간 및 용량 의존적 독성 감소를 보였다. 급성 측정은 칼슘 채널 차단제 니페디핀으로 수행되었으며 수축 진폭, 전계 전위 지속 시간 및 기본 임피던스의 감소를 보여 기능적 및 구조적 수준에 대한 이 화합물의 심장 독성 부작용을 보여줍니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

참고: 수축성 및 임피던스/EFP 측정을 위한 워크플로는 보충 그림 2에 나와 있습니다.

1. 플레이트 코팅

1. 진공 밀봉 포장을 열고 96웰 플레이트를 꺼냅니다. 두 모듈의 96웰 플레이트에 대한 처리 절차는 동일합니다. 수축 모듈에서 측정할 때까지 추가로 제공된 멤브레인 가드로 덮인 수축판을 그대로 두십시오.
2. 심근 세포를 파종하기 위해 유연한 96 웰 플레이트를 코팅하십시오.
   1. 멸균 원심분리 튜브에 2.75mL의 EHS 겔 즉시 사용 가능한 용액을 옮겨 희석된 EHS 겔 코팅 용액을 준비합니다. 그런 다음 Ca 2+ 및 Mg 2+와 함께^8.25mL의 DPBS를 추가합니다. 용액을 조심스럽게 섞는다.
      참고: 선택적으로, 피브로넥틴은 웰 코팅에도 사용할 수 있습니다: 13mL의 DPBS에 650μL의 피브로넥틴 원액(1μg/mL)을 Ca 2+ 및 Mg²⁺로 희석하여 멸균 원심분리 튜브에서 피브로넥틴 코팅 용액 13mL를 준비하여 50μg/mL 작업 용액을 만듭니다. 용액을 조심스럽게 섞는다.
3. 코팅 용액을 실험실 자동화 로봇에 배치된 멸균 시약 저장소로 옮깁니다.
4. "ADD100μL" 프로그램을 사용하여 실험실 자동화 로봇으로 웰당 100μL의 코팅 용액을 추가합니다. 뚜껑을 96웰 플레이트에 다시 놓고 37°C에서 3시간 동안 배양합니다.
   알림: 실험실 자동화 로봇용 프로그램은 미리 수동으로 사전 설정해야 합니다.

2. 인간 iPSC 유래 심근 세포를 유연한 96웰 플레이트에 파종(Day 0)

1. 제조업체의 지침에 따라 세포를 해동하십시오.
2. 수동 계수 챔버로 세포를 계수하고 세포 제조업체 지침(예: 1 x 10⁵ cells/well)에 따라 권장 도금 매체에서 셀을 조정하면 전체 96웰 플레이트를 시딩하기 위한 11 x 10⁶ cells/11mL가 생성됩니다.
3. 프로그램 "REMOVE100μL"을 사용하여 실험실 자동화 로봇으로 웰에서 EHS 겔 용액을 제거합니다. 분배된 코팅 용액이 들어 있는 시약 저장소를 로봇에서 제거합니다.
4. 세포 현탁액(총 11mL)을 실험실 자동화 로봇에 있는 멸균 시약 저장소로 옮기고 "CELLS_ADD100 μL" 프로그램을 사용하여 100μL/웰로 세포를 시딩합니다.
5. 세포 파종 직후 유연한 96웰 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5%_CO2, 습도 제어)로 옮기고 세포를 밤새 안정시킵니다.

3. 유연한 96웰 플레이트의 중간 교환(1일차)

1. 플레이트를 시딩한 후 18-24시간 동안 플레이트당 최소 22mL의 심근세포 유지 배지를 50mL 원심분리 튜브에서 37°C로 가온합니다.
2. 새 배지(최소 22mL)를 멸균 시약 저장소로 옮기고 실험실 자동화 로봇 바로 옆에 두십시오. 로봇에 빈 시약 저장소를 놓고 "REMOVE100μL" 프로그램으로 배지 제거를 수행합니다. 그런 다음 폐 배지가 포함된 시약 저장소를 새 배지가 포함된 시약 저장소로 교환하고 "ADD100μL" 프로그램으로 웰당 200μL의 새 배지를 분배합니다. 이 단계를 두 번 수행하여 200μL/웰에 도달합니다.
3. 배지 교환 직후 플레이트를 인큐베이터로 다시 옮깁니다.
4. 화합물이 첨가될 때까지 격일로 배지 교환(200μL/웰)을 수행합니다.

4. 화합물 첨가 전 최종 배지 교환 (Day 5-7)

1. 화합물 첨가 4-6시간 전에 최종 배지 변경을 수행합니다.
2. 유연한 96웰 플레이트 1개에 대해 최소 22mL의 분석 버퍼를 따뜻하게 합니다. 분석 완충액은 유지 배지 또는 이의 유도체(예를 들어, 저혈청 배지/무혈청 배지, 페놀 레드 유리 배지 또는 다른 등장성 완충액)로 구성된다.
3. 새로운 배지를 멸균 시약 저장소로 옮기고 실험실 자동화 로봇 바로 옆에 두십시오. 로봇에 빈 시약 저장소를 놓고 배지 제거를 수행합니다. 그런 다음 폐 배지가 포함된 시약 저장소를 새 배지가 들어 있는 시약 저장소로 교환하고 새 배지 200μL/well을 분배합니다.
4. 배지 교환 직후 플렉시블 플레이트를 인큐베이터로 다시 옮깁니다.

5. 화합물 첨가 및 데이터 기록 (5-7 일)

참고: 실험에 대한 측정 계획의 예는 보충 그림 3에 나와 있습니다.

1. 멸균 일반 96-deep 웰 플레이트를 사용하여 층류 후드에서 4x 농도로 화합물당 작업 용액을 준비합니다. 화합물 용액은 단계 4에서 사용된 분석 완충액에 기초한다. 화합물 용액이 포함된 96-딥 웰 플레이트를 최소 1시간 동안 인큐베이터로 옮겨 플렉시블 플레이트와 동일한 조건으로 조정합니다.
   참고 : 모든 실험에 사용 된 각 약물의 1x 농도는 그림과 범례에 제공됩니다.
2. 기준선 측정을 수행하기 1시간 전에 플레이트를 각 측정 장치로 옮깁니다.
3. 제어 소프트웨어(하이브리드 세포 분석 시스템의 일부)에서 프로토콜 편집을 열고 각 측정 모드 수축성 또는 임피던스/EFP를 선택합니다.
4. 스윕 지속 시간(한 측정 길이, 예: 30초)과 반복 간격(측정 간 시간, 예: 5분)을 정의하고 프로토콜 번호를 저장합니다.
5. 프로토콜 시작 > 계속을 선택하고 요청된 필드를 채웁니다.
6. 마지막으로 측정 시작을 선택합니다. 화합물 첨가 직전에 5분 간격으로 최소 3회의 기준선 측정(스윕)을 수행합니다.
   참고: 화합물 첨가 전에 수축성 모듈을 사용한 수축성 기준선 측정의 예제 데이터는 보충 그림 4에 나와 있습니다.
7. 측정 장치에서 유연한 96웰 플레이트를 제거하지 않고 각 웰에서 50μL의 분석 버퍼를 제거합니다.
8. 측정 계획에 따라 4x 농축 화합물 용액 50μL를 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
9. 영역 마커 추가를 선택하고 화합물 플레이트 레이아웃과 화합물 첨가 후 화합물 용액의 부피를 정의합니다.
10. 마지막으로 실험 계획에 따라 표준 측정 진행 또는 측정 계열로 진행 을 선택합니다.

6. 데이터 분석

1. 기록 소프트웨어를 사용하면 길이와 반복 간격이 사용자에 의해 정의되는 스윕을 측정합니다.
2. 분석 소프트웨어를 사용하면 진폭, 비트 속도, 펄스 폭 등과 같은 파라미터를 자동으로 판독하여 신호의 형태를 캡처할 수 있습니다.
   알림: 표준 편차를 포함한 평균 신호, 소위 평균 비트는 한 번의 스윕 데이터를 기반으로 자동으로 계산됩니다. 사용자는 소프트웨어가 계산하고 표시하는 수축성/IMP/EFP 매개변수를 정의할 수 있습니다.
3. 분석 소프트웨어를 사용하여 각 화합물에 대한 용량-반응 곡선과 IC50/EC50을 계산합니다.
   참고: 분석 소프트웨어로 생성된 원시 데이터와 분석 결과는 다양한 형식으로 쉽게 내보낼 수 있습니다. 마지막으로 실험 결과를 요약하고 보관하기 위해 데이터 보고서가 자동으로 생성됩니다. EFP 신호가 측정되는 대상과 방법에 대한 포괄적인 설명은 ¹⁷에서 설명합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

키나아제 억제제 에를로티닙이 hiPSC-CM의 수축성에 미치는 영향은 그림 1에 나와 있습니다. 세포를 5일 동안 10 nM 내지 10 μM 범위의 농도로 처리하고, 박동 파라미터를 매일 기록하였다. 심장 독성의 위험이 비교적 낮은 EGFR (표피 성장 인자 수용체) 및 티로신 키나제 억제제 인 Erlotinib은 마이크로 몰 범위의 농도에서만 hiPSC-CM에 약간의 용량과 시간 의존적 영향을 미쳤습니다. ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

임피던스/EFP/수축성 하이브리드 시스템은 전임상 약물 개발을 위한 심장 책임에 대한 고처리량 안전성 약리학적 및 독성학적 평가를 위한 포괄적인 방법론입니다. 동물 모델을 사용하지 않고 전임상 안전성 테스트를 위한 현대적인 접근 방식을 제공하지만 시간과 비용을 크게 줄이는 더 높은 처리량 기능을 제공합니다. 이 시스템은 전임상 기능 및 구조적 독성 평가를 위한 Langendorff Heart 및 기타 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes	Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)	R1059
Centrifuge (50 mL tubes)	Thermo Fisher Scientific	15878722
12-channel adjustable pipette (100-1250 μL)	Integra Biosciences	4634
DPBS with Ca2+ and Mg2+	GE Healthcare HyClone	SH304264.01
96 deep well plate	Thermo Fisher Scientific	A43075
EHS gel			Extracellular Matrix Gel
FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device	Nanion Technologies	19 1004 1005	Hybrid cell analysis system
FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates	Nanion Technologies	20 1010
Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex)	Sigma Aldrich	F1141
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	ThermoFischer Scientific	A1569601
Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium	FCDI	R1059
Incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Fisher Scientific	51023121
Laminar Flow Hood	Thermo Fisher Scientific	51032678
NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent	Nanion Technologies	20 1011
Pipette tips (1250µL)	Integra Biosciences	94420813
Reagent Reservoir	Integra Biosciences	8096-11
Serological pipette (e.g. 25 mL)	Thermo Fisher Scientific	16440901
Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL)	Eppendorf	3123000063
Vacuum aspiration system	Thermo Fisher Scientific	15567479
Optional: VIAFLO ASSIST	Integra Biosciences	4500	Lab automation Robot
Water bath (37 °C)	Thermo Fisher Scientific	15365877