Sistema di analisi delle cellule ibride per valutare i cambiamenti strutturali e contrattili dei cardiomiociti umani derivati da iPSC per la valutazione preclinica del rischio cardiaco

Riepilogo

L'analisi dei cambiamenti nella funzione contrattile e nell'integrità cellulare dei cardiomiociti umani derivati da iPSC è di immensa importanza per lo sviluppo di farmaci non clinici. Un sistema ibrido di analisi cellulare a 96 pozzetti affronta entrambi i parametri in tempo reale e in modo fisiologico per risultati affidabili e rilevanti per l'uomo, necessari per una transizione sicura nelle fasi cliniche.

Abstract

La valutazione della contrattilità cardiaca è di immensa importanza per lo sviluppo di nuove terapie e la loro transizione sicura nelle fasi cliniche. Mentre i cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC-CM) promettono di servire come modello rilevante per l'uomo nelle fasi precliniche della scoperta di farmaci e della farmacologia di sicurezza, la loro maturità è ancora controversa nella comunità scientifica e in costante sviluppo. Presentiamo una contrattilità ibrida e una tecnologia EFP (impedenza/potenziale di campo extracellulare), aggiungendo significative caratteristiche di pro-maturazione a una piattaforma standard del settore a 96 pozzetti.

Il sistema impedenza/EFP monitora la funzionalità cellulare in tempo reale. Oltre alla frequenza di battimento delle cellule contrattili, le letture della spettroscopia di impedenza elettrica rilevano cambiamenti morfologici indotti da composti come la densità cellulare e l'integrità del monostrato cellulare. Nell'altro componente del sistema di analisi delle cellule ibride, le cellule sono coltivate su membrane bio-compatibili che imitano l'ambiente meccanico del tessuto cardiaco reale. Questo ambiente fisiologico supporta la maturazione di hiPSC-CMs in vitro, portando a risposte contrattili più simili a quelle degli adulti, inclusi effetti inotropi positivi dopo il trattamento con isoproterenolo, S-Bay K8644 o omecamtiv mecarbil. Parametri come l'ampiezza della forza di contrazione (mN/mm²) e la durata del battito rivelano anche effetti a valle dei composti con influenza sulle proprietà elettrofisiologiche e sulla manipolazione del calcio.

Il sistema ibrido fornisce lo strumento ideale per l'analisi olistica delle cellule, consentendo la valutazione preclinica del rischio cardiaco oltre le attuali prospettive dei saggi cellulari rilevanti per l'uomo.

Introduzione

Uno dei principali obiettivi dello sviluppo di farmaci moderni è il miglioramento del tasso di successo da banco a letto di nuove terapie nella pipeline di scoperta di farmaci. I test farmacologici di sicurezza di questi nuovi farmaci spesso rivelano reazioni avverse al farmaco sul sistema cardiovascolare che rappresentano quasi un quarto del tasso di abbandono del farmaco nelle fasi precliniche¹. Lo sviluppo e l'integrazione di nuove metodologie di approccio (NAM) svolgono un ruolo chiave nella modernizzazione della valutazione preclinica, in particolare degli organi della batteria centrale come il cuore. Poiché queste metodologie sono approcci privi di animali, l'uso di modelli cellulari basati sull'uomo come i cardiomiociti (CM) di origine delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) è diventato il cavallo di battaglia nell'ultimo decennio per la moderna valutazione delle questioni farmacologiche e tossicologiche di sicurezza². I sistemi di analisi ampiamente utilizzati per tali indagini sono gli array di microelettrodi (MEA) e gli approcci sperimentali basati su coloranti sensibili^{alla tensione 3}.

Tuttavia, la presunta immaturità fenotipica e funzionale di questo tipo di cellula pone ostacoli sulla strada di un modello cellulare ideale basato sull'uomo, con il potenziale di ridurre i divari traslazionali tra studi non clinici e clinici⁴.

Nel corso degli anni sono state condotte enormi ricerche per comprendere la ragione del fenotipo immaturo implicito e per trovare modi per spingere il processo di maturazione delle iPSC-CM umane in vitro.

La mancanza di segnali di maturazione cardiaca come tempi di coltura cellulare prolungati, l'assenza di altri tipi di cellule nelle vicinanze o la mancanza di stimolazione ormonale hanno dimostrato di influenzare il processo di maturazione⁵. Inoltre, l'ambiente non fisiologico delle piastre di coltura cellulare regolare è stato identificato come una causa significativa che impedisce la maturazione delle iPSC-CM umane, a causa della mancanza di rigidità fisiologica del substrato del cuore umano nativo ^5,6.

Per affrontare questo problema sono stati sviluppati diversi sistemi di analisi incentrati sulle condizioni fisiologiche native, compresi i sistemi di coltura cellulare 3D in cui le cellule sono allineate tridimensionalmente per assomigliare all'architettura cardiaca nativa anziché alle tipiche colture cellulari bidimensionali⁷. Sebbene si ottenga una migliore maturazione con saggi 3D, la necessità di una forza lavoro qualificata e la bassa produttività di questi sistemi ostacolano un uso abbondante di questo nel processo di sviluppo dei farmaci, poiché tempi e costi giocano un ruolo fondamentale nella valutazione di nuove terapie a livello finanziario⁸.

Letture importanti per la valutazione farmacologica e tossicologica della sicurezza di nuove terapie sono i cambiamenti nelle caratteristiche funzionali e strutturali delle iPSC-CM umane, poiché le reazioni avverse al farmaco indotte da composti del sistema cardiovascolare di solito influenzano una o entrambe queste proprietà ^1,9. Esempi ben noti di reazioni avverse così ampie sono i farmaci antitumorali della famiglia delle antracicline. Qui, effetti funzionali e strutturali avversi pericolosi sul sistema cardiovascolare sono ampiamente riportati durante e dopo il trattamento del cancro nei pazienti, nonché con saggi in vitro basati su cellule^10,11.

Nel presente studio, descriviamo una metodologia completa per la valutazione degli effetti collaterali dei composti sia funzionali che strutturali sulle hiPSC-CM. La metodologia include l'analisi della forza contrattile dei cardiomiociti e l'analisi dell'impedenza/potenziale di campo extracellulare (EFP). La forza contrattile viene misurata in condizioni meccaniche fisiologiche, con le cellule coltivate su substrati di silicone morbido (33 kPa), che riflettono l'ambiente meccanico del tessuto cardiaco umano nativo.

Il sistema è dotato di piastre a 96 pozzetti per l'analisi ad alta produttività di iPSC-CM umane per studi farmacologici e tossicologici preclinici sulla sicurezza cardiaca, e quindi offre un vantaggio agli approcci 3D attualmente utilizzati come il cuore di Langendorff o le fette di cuore^12,13.

Nel dettaglio, il sistema ibrido si compone di due moduli, sia per la valutazione della contrattilità cardiaca in condizioni fisiologiche che per l'analisi della tossicità strutturale cellulare in tempo reale ^6,14. Entrambi i moduli funzionano con piastre specializzate ad alta produttività a 96 pozzetti per un'acquisizione dei dati rapida ed economica.

Senza la necessità di un costrutto 3D, il modulo di contrattilità impiega piastre speciali che contengono membrane siliconiche flessibili come substrato per le cellule invece del vetro rigido o della plastica di cui di solito sono costituite le normali piastre di coltura cellulare. Le membrane riflettono le tipiche proprietà del cuore biomeccanico umano e quindi imitano le condizioni in vivo in modo ad alta produttività. Mentre le iPSC-CM umane spesso non riescono a mostrare il comportamento dei cardiomiociti adulti per quanto riguarda l'inotropia positiva indotta da composti in altri saggi basati su cellule¹⁴, una reazione più simile all'adulto può essere valutata quando le cellule sono coltivate sulle piastre del modulo di contrattilità. In studi precedenti, è stato dimostrato che le iPSC-CM mostrano effetti inotropi positivi al trattamento con composti come isoproterenolo, S-Bay K8644 o omecamtiv mecarbil ^6,15. Qui possono essere valutati più parametri di contrattilità, come parametri primari come l'ampiezza della forza di contrazione (mN / mm²), la durata del battito e la frequenza di battito, nonché parametri secondari del ciclo di contrazione come l'area sotto la curva, le pendenze di contrazione e rilassamento, le variazioni della frequenza di battito e le aritmie (Figura supplementare 1)¹⁶ . I cambiamenti indotti dal farmaco in tutti i parametri sono valutati in modo non invasivo mediante il rilevamento capacitivo della distanza. I dati grezzi vengono analizzati successivamente da software specializzati.

Il modulo di tossicità strutturale aggiunge i suoi parametri unici di impedenza e EFP come lettura per la tossicità cellulare strutturale e l'analisi delle proprietà elettrofisiologiche^17,18. La tecnologia della spettroscopia di impedenza elettrica rivela cambiamenti indotti da composti nella densità cellulare o nell'integrità delle cellule e dei monostrati monitorati in tempo reale, come mostrato con iPSC-CM umane trattate con composti cardiotossici noti¹³. Con letture di impedenza a frequenze diverse (1-100 kHz) è possibile sezionare ulteriormente una risposta fisiologica, e quindi è possibile rivelare cambiamenti nella topografia della membrana, nelle giunzioni cellula-cellula o cellula-matrice. La registrazione EFP aggiuntiva delle iPSC-CM umane consente inoltre l'analisi degli effetti elettrofisiologici indotti dal trattamento con composti, come è stato dimostrato alla luce dello studio CiPA^17,19.

Nel presente studio, sono state impiegate iPSC-CM umane, trattate con epirubicina e doxorubicina, entrambe ben descritte come antracicline cardiotossiche, ed erlotinib, un inibitore della tirosin-chinasi (TKI) con un rischio piuttosto basso di tossicità cardiovascolare. La valutazione cronica con epirubicina, doxorubicina ed erlotinib è stata eseguita per 5 giorni. Il risultato mostra lievi cambiamenti nella contrattilità e nell'impedenza basale quando le cellule sono state trattate con erlotinib, ma una diminuzione tossica dipendente dal tempo e dalla dose dell'ampiezza della contrazione e dell'impedenza basale quando trattati rispettivamente con epirubicina e doxorubicina. Le misurazioni acute sono state eseguite con il calcio-antagonista nifedipina e mostrano una diminuzione dell'ampiezza della contrazione, della durata del potenziale di campo e dell'impedenza di base, dimostrando effetti collaterali cardiotossici di questo composto a livello funzionale e strutturale.

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Protocollo

NOTA: Il flusso di lavoro per la misura di contrattilità e impedenza/EFP è riportato nella figura supplementare 2.

1. Rivestimento della piastra

1. Aprire la confezione sottovuoto ed estrarre la piastra a 96 pozzetti. Le procedure di gestione per le piastre a 96 pozzetti di entrambi i moduli sono le stesse. Lasciare la piastra di contrazione coperta dalla protezione della membrana in dotazione fino alla misurazione nel modulo di contrattilità.
2. Rivestire le piastre flessibili a 96 pozzetti per la semina dei cardiomiociti.
   1. Preparare una soluzione diluita di rivestimento in gel EHS trasferendo 2,75 ml di soluzione pronta all'uso di gel EHS in una provetta da centrifuga sterile. Quindi aggiungere 8,25 ml di DPBS con Ca 2+ e Mg²⁺. Mescolare accuratamente la soluzione.
      NOTA: Opzionalmente, la fibronectina può essere utilizzata anche per il rivestimento dei pozzetti: preparare 13 ml di soluzione di rivestimento di fibronectina in una provetta sterile da centrifuga diluendo 650 μL di soluzione madre di fibronectina (1 μg/ml) in 13 ml di DPBS con Ca 2+ e Mg²⁺, ottenendo una soluzione di lavoro da 50 μg/ml. Mescolare accuratamente la soluzione.
3. Trasferire la soluzione di rivestimento in un serbatoio di reagente sterile posto nel robot di automazione di laboratorio.
4. Aggiungere 100 μL della soluzione di rivestimento per pozzetto con il robot di automazione di laboratorio utilizzando il programma "ADD100μL". Riporre il coperchio sulla piastra a 96 pozzetti e incubare per 3 ore a 37 °C.
   NOTA: Il programma per il robot di automazione di laboratorio deve essere preimpostato manualmente in anticipo.

2. Semina di cardiomiociti umani derivati da iPSC in piastre flessibili a 96 pozzetti (Giorno 0)

1. Scongelare le celle secondo le linee guida del produttore.
2. Contare le celle con una camera di conteggio manuale e regolare le celle nel mezzo di placcatura consigliato secondo le istruzioni del produttore della cella (ad esempio, 1 x 10⁵ celle / pozzetto), ottenendo 11 x 10⁶ celle / 11 ml per seminare un'intera piastra a 96 pozzetti.
3. Rimuovere la soluzione di gel EHS dai pozzetti con il robot di automazione di laboratorio utilizzando il programma "REMOVE100μL". Rimuovere dal robot il serbatoio del reagente contenente la soluzione di rivestimento erogata.
4. Trasferire la sospensione cellulare (11 ml totali) in un serbatoio di reagente sterile posto nel robot di automazione di laboratorio e seminare le cellule con 100 μL/pozzetto utilizzando il programma "CELLS_ADD100 μL".
5. Immediatamente dopo la semina cellulare, trasferire la piastra flessibile a 96 pozzetti nell'incubatore (37 °C, 5% CO₂, umidità controllata) e lasciare che le cellule si depositino durante la notte.

3. Scambio medio di piastre flessibili a 96 pozzetti (giorno 1)

1. Riscaldare almeno 22 mL di terreno di mantenimento dei cardiomiociti per piastra a 37 °C in una provetta da centrifuga da 50 mL, 18-24 ore dopo la semina delle piastre.
2. Trasferire il mezzo fresco (almeno 22 ml) in un serbatoio di reagente sterile e lasciarlo accanto al robot di automazione di laboratorio. Posizionare un serbatoio di reagente vuoto nel robot ed eseguire la rimozione del mezzo con il programma "REMOVE100μL". Successivamente, sostituire il serbatoio del reagente contenente il mezzo di scarto con il serbatoio del reagente contenente il mezzo fresco ed erogare 200 μL del mezzo fresco per pozzetto con il programma "ADD100μL". Eseguire questo passaggio due volte per raggiungere 200 μL/pozzetto.
3. Immediatamente dopo lo scambio del mezzo, trasferire nuovamente la piastra nell'incubatore.
4. Eseguire uno scambio medio (200 μL/pozzetto) a giorni alterni fino all'aggiunta del composto.

4. Scambio finale del mezzo prima dell'aggiunta di composti (Giorno 5-7)

1. Eseguire un cambio finale del mezzo 4-6 ore prima dell'aggiunta del composto.
2. Riscaldare almeno 22 ml di tampone di dosaggio per una piastra flessibile a 96 pozzetti. Il tampone di analisi è costituito da mezzi di mantenimento o suoi derivati (ad esempio, mezzi sierici bassi / assenti, mezzi liberi rosso fenolo o altri tamponi isotonici).
3. Trasferire il mezzo fresco in un serbatoio di reagente sterile e lasciarlo proprio accanto al robot di automazione di laboratorio. Posizionare un serbatoio di reagente vuoto nel robot ed eseguire la rimozione media. Successivamente, sostituire il serbatoio del reagente contenente il mezzo di scarto con il serbatoio del reagente contenente il mezzo fresco ed erogare 200 μL/pozzetto del mezzo fresco.
4. Immediatamente dopo la sostituzione del mezzo, trasferire nuovamente la piastra flessibile nell'incubatore.

5. Aggiunta di composti e registrazione dei dati (giorno 5-7)

NOTA: Un esempio di piano di misurazione per l'esperimento è riportato nella figura supplementare 3.

1. Preparare la soluzione di lavoro per composto a una concentrazione 4x nella cappa a flusso laminare utilizzando una piastra sterile regolare profonda 96 pozzetti. La soluzione composta si basa sul tampone di analisi utilizzato nella fase 4. Trasferire la piastra del pozzetto profonda 96 contenente la soluzione composta per almeno 1 ora nell'incubatore per regolarla nelle stesse condizioni della piastra flessibile.
   NOTA: La concentrazione 1x di ogni farmaco utilizzato per ogni esperimento è fornita nelle figure e nelle legende.
2. Trasferire la piastra al rispettivo dispositivo di misurazione 1 ora prima di eseguire una misurazione di base.
3. Aprire Edit Protocol nel software di controllo (parte del sistema di analisi delle celle ibride) e selezionare la rispettiva modalità di misurazione contrattilità o impedenza/EFP.
4. Definire la durata della scansione (lunghezza di una misura, ad esempio, 30 s) e l'intervallo di ripetizione (tempo tra le misurazioni, ad esempio, 5 minuti) e salvare il numero di protocollo.
5. Selezionare Avvia protocollo > Continua e compilare i campi richiesti.
6. Infine, seleziona Avvia misurazione. Eseguire un minimo di tre misurazioni di base (sweep) a intervalli di 5 minuti poco prima dell'aggiunta del composto.
   NOTA: I dati di esempio di una misurazione della linea di base della contrattilità utilizzando il modulo di contrattilità prima dell'aggiunta di composti sono illustrati nella figura supplementare 4
7. Rimuovere 50 μL del tampone di analisi da ciascun pozzetto senza rimuovere la piastra flessibile a 96 pozzetti dal dispositivo di misurazione.
8. Aggiungere 50 μL della soluzione composta concentrata 4x in ciascun pozzetto della piastra, secondo il piano di misurazione.
9. Selezionare Aggiungi marcatore regione e definire il layout della piastra composta e il volume della soluzione composta dopo l'aggiunta del composto.
10. Infine, selezionare Procedi con la misurazione standard o Procedi con le serie di misurazione in base al piano sperimentale.

6. Analisi dei dati

1. Con il software di registrazione, misurare le sweep, la cui lunghezza e intervallo di ripetizione sono definiti dall'utente.
2. Con il software di analisi, cattura la forma del segnale leggendo automaticamente parametri come ampiezza, frequenza di battimento, larghezza dell'impulso e così via.
   NOTA: Un segnale medio che include la deviazione standard, il cosiddetto battito medio, viene calcolato automaticamente in base ai dati di uno sweep. L'utente può definire i parametri di contrattilità/IMP/EFP che il software calcola e visualizza.
3. Con il software di analisi calcolare la curva dose-risposta e IC50/EC50 per ogni composto.
   NOTA: I dati grezzi e i risultati delle analisi generati con il software di analisi possono essere facilmente esportati in una varietà di formati. Infine, i report dei dati vengono generati automaticamente per riassumere e archiviare i risultati sperimentali. Una descrizione completa di cosa e come viene misurato un segnale EFP è discussa in ¹⁷.

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Risultati

Gli effetti dell'inibitore della chinasi erlotinib sulla contrattilità delle hiPSC-CM sono mostrati nella Figura 1. Le cellule sono state trattate con concentrazioni comprese tra 10 nM e 10 μM per 5 giorni e i parametri di battimento sono stati registrati quotidianamente. Erlotinib, un EGFR (recettore del fattore di crescita epidermico) e inibitore della tirosin-chinasi con un rischio relativamente basso di cardiotossicità, ha avuto una dose minore e un effetto dipendente dal tempo sulle ...

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Discussione

Il sistema ibrido impedenza/EFP/contrattilità è una metodologia completa per la valutazione farmacologica e tossicologica della sicurezza ad alta produttività delle passività cardiache per lo sviluppo preclinico di farmaci. Fornisce un approccio moderno per i test di sicurezza preclinici senza l'uso di modelli animali, ma con capacità di produttività più elevate che riducono significativamente tempi e costi. Questo sistema ha il potenziale per essere utilizzato come approccio complementare per il Langendorff Heart...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes	Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)	R1059
Centrifuge (50 mL tubes)	Thermo Fisher Scientific	15878722
12-channel adjustable pipette (100-1250 μL)	Integra Biosciences	4634
DPBS with Ca2+ and Mg2+	GE Healthcare HyClone	SH304264.01
96 deep well plate	Thermo Fisher Scientific	A43075
EHS gel			Extracellular Matrix Gel
FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device	Nanion Technologies	19 1004 1005	Hybrid cell analysis system
FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates	Nanion Technologies	20 1010
Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex)	Sigma Aldrich	F1141
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	ThermoFischer Scientific	A1569601
Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium	FCDI	R1059
Incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Fisher Scientific	51023121
Laminar Flow Hood	Thermo Fisher Scientific	51032678
NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent	Nanion Technologies	20 1011
Pipette tips (1250µL)	Integra Biosciences	94420813
Reagent Reservoir	Integra Biosciences	8096-11
Serological pipette (e.g. 25 mL)	Thermo Fisher Scientific	16440901
Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL)	Eppendorf	3123000063
Vacuum aspiration system	Thermo Fisher Scientific	15567479
Optional: VIAFLO ASSIST	Integra Biosciences	4500	Lab automation Robot
Water bath (37 °C)	Thermo Fisher Scientific	15365877