İskemik inmenin tavşan modelinde kan basıncının gerçek zamanlı izlenmesi ve modülasyonu

Özet

Sürekli arteriyel kan basıncı kaydı, çeşitli hemodinamik parametrelerin etkilerinin araştırılmasını sağlar. Bu yazıda, iskemik inmenin büyük bir hayvan modelinde sürekli arteriyel kan basıncı izlemenin inme patofizyolojisinin belirlenmesi, farklı hemodinamik faktörlerin etkisi ve yeni tedavi yaklaşımlarının değerlendirilmesi için uygulanması gösterilmiştir.

Özet

Kan basıncının kontrolü, hem mutlak değerler hem de değişkenliği açısından, iskemik inme hastalarında sonuçları etkilemektedir. Bununla birlikte, kötü sonuçlara yol açan mekanizmaları tanımlamak veya insan verilerine özgü yasaklayıcı sınırlamalar nedeniyle bu etkilerin hafifletilebileceği önlemleri değerlendirmek zor olmaya devam etmektedir. Bu gibi durumlarda, hastalıkların titiz ve tekrarlanabilir değerlendirmelerini yapmak için hayvan modelleri kullanılabilir. Burada, modülasyonun kan basıncı üzerindeki etkilerini değerlendirmek için sürekli kan basıncı kaydı ile artırılan tavşanlarda daha önce tarif edilen bir iskemik inme modelinin iyileştirilmesini bildiriyoruz. Genel anestezi altında, femoral arterler, arteriyel kılıfları iki taraflı olarak yerleştirmek için cerrahi kesiklerle açığa çıkarılır. Floroskopik görselleştirme ve yol haritası rehberliğinde, bir mikrokateter beynin posterior dolaşımının bir arterine ilerletilir. Hedef arterin tıkanmasını doğrulamak için kontralateral vertebral arter enjekte edilerek anjiyografi yapılır. Tıkayıcı kateter sabit bir süre boyunca yerinde kaldığında, mekanik veya farmakolojik yollarla kan basıncı manipülasyonlarının sıkı titrasyonuna izin vermek için kan basıncı sürekli olarak kaydedilir. Tıkanma aralığının tamamlanmasında, mikrokateter çıkarılır ve hayvan, öngörülen bir reperfüzyon süresi boyunca genel anestezi altında tutulur. Akut çalışmalar için, hayvan daha sonra ötenazi yapılır ve kafası kesilir. Beyin, ışık mikroskobu altında enfarktüs hacmini ölçmek için toplanır ve işlenir ve ayrıca çeşitli histopatolojik lekeler veya uzamsal transkriptomik analiz ile değerlendirilir. Bu protokol, iskemik inme sırasında kan basıncı parametrelerinin etkileri üzerine daha kapsamlı preklinik çalışmalar için kullanılabilecek tekrarlanabilir bir model sağlar. Ayrıca, iskemik inme hastalarının bakımını iyileştirebilecek yeni nöroprotektif müdahalelerin etkili preklinik değerlendirmesini kolaylaştırır.

Giriş

İskemik inme (IS) dünya çapında önde gelen bir ölüm ve uzun süreli sakatlık nedenidir ve prevalansının^{toplum 1} yaşlandıkça artacağı tahmin edilmektedir. Akut girişimlerde ve sekonder korunma stratejilerinde önemli ilerlemeler kaydedilmiş olsa da, yardımcı nöroprotektif tedaviler 2,3,4,5,6,7 apace takip etmemiştir. İnme patobiyolojisi konusunda daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır, çünkü tedavilerin etkili olabileceği veya olamayacağı mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu, büyük ölçüde, birçoğu analizi karıştıran çok sayıda komorbiditeye sahip olan inme hastası popülasyonunun heterojen doğasından kaynaklanmaktadır¹. Araştırmadaki sınırlamaların itici güçlerinden biri, insan merkezi sinir sisteminden örnekleme dokusunun engelleyici morbiditesi nedeniyle biyomedikal araştırmalarda altın standart olan doku düzeyinde verilerin olmamasıdır. Spesifik olarak, yaşayan bir insanda vasküler doku hasadı inmeye neden olur, bu nedenle vasküler doku tipik olarak sadece genel popülasyonu yeterince temsil etmeyen ve eşlik eden tanıları olan yaşlı hastalarda daha ileri hastalığa doğru eğilen otopside elde edilir.

Bu gibi durumlarda, yeterli insan verisi kullanılamadığında, hayvan modelleri veri boşluklarını kapatabilir. Araştırmada kullanılan büyük hayvanların çoğu, serebral arterlere doğrudan endovasküler erişimi önleyen bir rete mirabilene sahip ungulatlar olduğu için inmenin büyük hayvan modelleri sınırlıdır 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Tavşanlar, intrakraniyal patolojiler 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 dahil olmak üzere kardiyovasküler hastalıkların araştırılması için uzun bir kullanım geçmişine sahiptir. Tavşanlar serebrovasküler hastalıklar için ideal bir model sunarlar, çünkü endovasküler kateterizasyon için yeterince büyüktürler ve diğer büyük memelilerde intrakraniyal erişimi engelleyen rete mirabile'den yoksundurlar^9,15,16,17. Daha önce, intrakraniyal arterin mikrokateter¹⁸ ile hassas ve iyi kontrol edilen tıkanması yoluyla İS'nin araştırılması için özel olarak kullanılmıştır.

Hem mutlak BP hem de BP değişkenliğinin (BPV) modülasyonu yoluyla kan basıncı (BP) kontrolü, arteriyel BP'nin ortalama bir BP etrafında dalgalanma derecesi, kötü kontrol edilen BP veya BPV'si olanlarda daha kötü sonuçların bildirilmesinden sonra IS hastaları için ortaya çıkan potansiyel bir terapötik hedeftir 19,20,21,22. Değişikliklerin IS hastalarında nasıl kötü sonuçlara yol açtığına dair mekanik araştırmalar eksiktir. Bu kısmen doku düzeyinde veri elde etmedeki ve insanlarda iyi kontrol edilen analizler yapmadaki zorluktan kaynaklanmaktadır. BP veya BPV'yi modüle eden müdahaleleri test etmek için, bu sınırlamaların üstesinden gelmek için hayvan modelleri kullanılmalıdır. Bu yazıda, BP^18'in sürekli intra-arteriyel ölçümü ile birlikte posterior serebral arterin kontrollü tıkanması kullanılarak daha önce doğrulanmış bir tavşan IS modelinin başarılı bir şekilde eşleştirilmesi açıklanmaktadır. Burada sunulan yöntem, BP'nin hassas ölçümünün ve kontrolünün sağlanabileceği bir sisteme doğrulanmış ve tekrarlanabilir bir inme modeli uygulayarak inme patofizyolojisine önceki yaklaşımları geliştirmektedir. Bu rafine modelde, enfarktüs yükü, hasat edilen beynin işlem sonrası histopatolojik boyanması ile değerlendirilebilir, bu da çeşitli lekelere ve mekansal transkriptomikler gibi daha ileri analizlere de uygundur. Ek olarak, tıkalı posterior dolaşım arteri de sağkalım prosedürlerini takiben morbidite analizi için değerlendirilmek üzere seçilebilir.

Protokol

Bu protokol, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Utah Üniversitesi IACUC Protokol Numarası 21-09021) tarafından onaylanmıştır. Olgun Yeni Zelanda Beyaz tavşanlar ticari satıcılardan elde edilir.

1. Hayvan edinimi

1. Hayvanları kurumsal protokole göre varıştan sonra gerekli süre boyunca iklimlendirin, hayvanları standart chow diyetleriyle bir vivaryumda sosyal olarak barındırın. Kurumumuzda alışma süresi 2 haftadır.

2. Anestezi ve izleme

1. Kas içi buprenorfin (0.03 mg / kg) enjeksiyonu ile genel endotrakeal anesteziyi indükleyin, ardından yaklaşık 30 dakika sonra ketamin (25-35 mg / kg) ve ksilazin (3 mg / kg) kas içi enjeksiyonu izleyin. Bir endotrakeal tüp yoluyla verilen oksijende% 1-5 izofluran ile anesteziyi sürdürün. İndüksiyon sırasında,% 100 FiO 2 kullanın ve ardından% 100 SpO_2'yi koruyan en düşük FiO_2'ye titre edin.
   NOT: Hayvanın hareketini önlemek için kesintisiz anestezi gereklidir, böylece inme, inme-indüksiyon sürecinin tek bozulması olacaktır. Bu aynı zamanda yetersiz anesteziden kaynaklanabilecek ajitasyondan kaynaklanabilecek BP'deki ani artışları da önler. Tutarlı oksijenasyon, karşılaştırılabilir inmeler elde etmek için kontrol etmek için de önemlidir. Bu önlemlerin tümü aşağıda açıklanan temsili sonuçlarda açıklanmıştır.
2. Ayak parmağına zararlı uyaranlar uygulayarak yeterli anestezi derinliğini onaylayın. Kuruluğu önlemek için gözlere veteriner göz merhemi uygulayın.
3. Kulağa yerleştirilen bir nabız oksimetresi ile oksijen doygunluğunu izleyin. Auriküler vende anjiyokateter ile intravenöz erişim elde edin. Bir dikiş veya yapışkan şeffaf film pansumanı ile sabitlendiğinden emin olun. Vazospazmı hafifletmek için, anestezi indüksiyonundan sonra kulağın iç kısmına 0.25 inç transdermal nitrogliserin yerleştirin.
4. Bakım sıvılarını normal salin ile 1 cc/kg/s hızında sağlayın. Vücut ısısını izlemek için bir özofagus sıcaklık probu yerleştirin. Hayvanın altına yerleştirilen ısınma battaniyeleri ile normotermiyi (33-37 ° C) gerektiği gibi koruyun.

3. Cerrahi hazırlık

1. Tavşanı floroskopi uyumlu bir ameliyat masasına sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Sonraki anjiyografik görünümler için konumlandırmayı optimize ederken kafayı uzatın. Tavşanlar, enstrümantasyondan sonra vazospazma eğilimli zarif hassas arterlere sahiptir.
2. Elektrikli makas kullanarak kürkü her iki kasık bölgesinden de çıkarın. Daha sonra, bilateral femoral arteriyel nabızları palpe ederek iki taraflı olarak keserek yeterli klirensi onaylayın. Cildi klorheksidin ve alkol ovma ile hazırlayın ve ardından cildi her zamanki steril şekilde örtün.
3. Bilateral inguinal bölgelere deri altından 2 mL% 1 lidokain enjekte ederek lokal anestezi uygulayın. Lidokainin enjekte edildiği yerde 10 numaralı bıçakla 5 cm'lik bir cerrahi kesi yapın. Nörovasküler demeti ortaya çıkarmak için künt diseksiyon kullanın (Şekil 1A). Gerekirse, insizyonu erişim için yeterince büyük bir arteriyel segmenti yeterince açığa çıkaracak şekilde uzatın.
4. Nörovasküler demetin izolasyonu üzerine, vazospazmı önlemek için artere birkaç damla% 1 lidokain damlatın. Forseps kullanarak arteri damardan ve bitişik sinirden yavaşça ayırın. Arteri, damarın ince duvarlarına kıyasla kas duvarının karakteristik görünümü ile tanımlayın. Arter daha parlak kana sahip olurken, damar daha koyu kan içerecektir.

4. Arteriyel erişim

1. Arter izole edildikten sonra, dik açılı forsepsleri damarın altından geçirin. Aletle iki damar halkasını kavrayın ve yavaşça arterin altından geçirin. Her birini açıkta kalan geminin yukarı ve aşağı akış uçlarına yerleştirin.
2. Damar halkalarını çekerek arteri yumuşak bir çekişe maruz bırakın. Bu noktada, damarı herhangi bir kalıntı doku için kontrol edin ve nazik diseksiyonla çıkarın (Şekil 1B). Bu, başarılı erişim şansını artırır.
3. Erişim için 22 G anjiyokateter kullanın. Kateterin kendisini iç iğnenin üzerinde hafifçe ilerletin, çünkü bu genellikle tamamen oturduğunda yapışır ve erişim girişimleri sırasında cihazı yerinden çıkarabilir.
4. Damarı diseksiyon yaptıktan ve anjiyokateteri hazırladıktan sonra, lidokaini tekrar damara damlatın. Arter gözle görülür şekilde genişleyecek, bu da Seldinger tekniğini kullanarak bir kılıfın başarılı bir şekilde erişilmesi ve yerleştirilmesi şansını artıracaktır.
5. Çıkışı azaltarak arteri sıkıştırmak için aşağı akış damar döngüsüne yumuşak çekiş uygulayın. Bu aynı zamanda erişim girişimi için gemiyi stabilize eder. Anjiyokateterin iğnesini yavaşça maruz kalan arteriyel segmentin ortasına doğru ilerletin (Şekil 1C). Anjiyokateterde ve göbeğindeki odada bir kan parlaması görüldüğünde, kateteri iğnenin üzerinden arteriyel lümene ilerletin.
6. Erişim girişimi başarısız olursa, yukarı akış damar döngüsüne çekiş uygulayarak hemostaz elde edin. Anjiyokateteri salinle yıkayın ve ek girişimler için tanıtıcı iğnesine yerleştirin.
7. Anjiyokateter damara başarılı bir şekilde göbeğine yerleştirildiğinde, anjiyokateter lümenden ve aort içine bir Cope mikroteli ilerletin (Şekil 1D). Anjiyokateteri telin üzerinden çıkarın ve 5 Fransız ince hidrofilik kılıfla değiştirin (Şekil 1E).
8. Üç kapağı açarak arteriyel kanın yan kol borusundan geri dönüşünü onaylayın. Kılıfı% 0,9 tuzlu suyla yıkayın ve yıkama sırasında vanayı kapalı olarak kilitleyin.
9. Kılıf göbeğini bitişik cilde ek bir 3-0 ipek dikiş ile sabitleyin. Kontralateral femoral arter için bu işlemi tekrarlayın. Daha yüksek verimlilik elde etmek için, iki operatör aynı anda çalışabilir ve her biri bir artere odaklanabilir.

5. Servikoserebral anjiyografi ve intrakraniyal erişim

1. Floroskopik görselleştirme altında, sol femoral kılıftan yerleştirilen 0.035 inçlik bir kayma teli üzerinde 4 Fransız kayma kateterini ilerletin. Kayma kateterinin ucunu proksimal sol vertebral artere yerleştirin. Teli çıkarın ve kateteri heparinize edilmiş% 0.9 salin ile yıkayın.
2. Tüm baş ve boynu görselleştirmek için sol vertebral artere düşük büyütme altında iyotlu kontrast enjekte ederek anjiyografi yapın (Şekil 2A). Tüm vaskülatürü görselleştirmek için kreşendos yapan düşük basınçlı bir enjeksiyonla başlayarak kontrast çözeltisinin enjeksiyonunu modüle edin.
   NOT: Sağ vertebral arterden aşağı reflüyü görselleştirmek için yeterli enjeksiyon gereklidir, çünkü bu anjiyografik görüntü doğru vertebral arteri verimli bir şekilde seçmek için yol haritası rehberliği için kullanılacaktır. Vazospazmı veya daha derin yaralanmaları en aza indirmek için nazik enjeksiyon gereklidir. Ek olarak, aşırı kuvvet veya hacim, derin anestezi altında bile hayvandan geçici harekete neden olabilir.
3. Sol vertebral enjeksiyon için, 3 cc'lik bir şırıngadan yumuşak bir kreşendo ile normal salin içinde seyreltilmiş% 50 kontrast enjekte edin. Seyreltik kontrastın 1-2 cc enjekte edilmesi tipik olarak yeterlidir. Reflüyü sağ vertebral arterden aşağıya ve sağ subklaviyen artere doğru kontrol ederek yeterli enjeksiyon miktarını belirleyin. Bu enjeksiyon sırasında, biri mikrokateter ile tıkanması gereken hedef olacak posterior serebral ve superior serebellar arterleri de not edin.
4. 0.010 inçlik bir mikrotel ile 2.4 Fransız akışa yönelik bir mikrokateter hazırlayın. Mikrotelin ucunda bir c şekli yapın. Yol haritası rehberliğinde, mikrokateteri 4 Fransız kayma kateterinin içinde sağ femoral kılıftan ve telin üzerinden sağ vertebral artere ilerletin. Kateter kaynaklı vazospazm eğilimi nedeniyle, cihaz manipülasyon süresini ve yapılan kateter girişim sayısını en aza indirin.
5. Mikrokateteri sağ vertebral arterin servikal segmentinden ilerletin. Keskin dönüşü V2'den V3 segmentine en iyi şekilde geçirmek için, mikrotel ucuna proksimal geri dönerken mikrokateteri tek başına ilerletin. Bu noktada mikrotel ile liderlik etmek genellikle vertebral arterin küçük yan dallarının seçimine neden olur ve önemli vazospazmın kaynağı olabilir.
6. Keskin dönüşü V2'den V3'e geçtikten sonra, mikrokateter genellikle proksimal baziler artere kolayca geçer. Bu noktada, mikroteli ilerletin ve istenen posterior serebral veya superior serebellar arterleri seçin. İntrakraniyal arterlerin kırılgan doğası göz önüne alındığında mikrokateter enjeksiyonları önerilmez.
7. Mikrokateteri mikrotel üzerinden hedef artere ilerletin. Proksimal bir pozisyon seçin, çünkü kökenindeki açılanma nedeniyle iletişim kurmak için posteriorda tipik olarak en güvenli olanıdır. Superior serebellar arterde daha derin bir pozisyon mümkündür (Şekil 2B).
8. Hedef arterin tıkanmasını doğrulamak için sol vertebral arter kateterini başın üzerine yüksek büyütme ile enjekte ederek anjiyografiyi tekrarlayın (Şekil 2B-C). Optimum görüntüleme için, 3 cc şırıngaya tam mukavemetli kontrast enjekte edin. Tipik olarak, tüm intrakraniyal arterlerin yeterli opaklaştırılması için 1 cc'den fazla gerekli olmayacaktır.
9. Sabit bir pozisyonu doğrulamak için mikroteli floroskopik görselleştirme altında mikrokateterden yavaşça çıkarın. Mikrokateterin göbeğine bir stopcock yerleştirin ve kan kaybının retrograd kan akışından kaynaklanmasını önlemek için stopcock'u kapatın. Sol femoral erişim kılıfını kullanılabilir hale getirmek için sol vertebral kateteri çıkarın.
10. Takip eden oklüzyon döneminde, tıkayıcı mikrokateterin stabil bir pozisyonunu doğrulamak için aralıklı floroskopik görüntüler elde edin. 60-240 dakika arasında değişen posterior serebral arter tıkanıklık sürelerinin sonuçları daha önce¹⁸ kez yayınlanmıştır.

6. Kan basıncı ölçümü ve modülasyonu

1. Tıkayıcı intrakraniyal mikrokateter için bir femoral erişim bölgesi kullanılırken, BP ölçümü için kontralateral kılıf kullanın.
2. Femoral bir kılıftan geçirilen ve sensör ucu alt torasik aortta olana kadar ilerletilen 3 Fransız gauge piezorezistif sensör ile sürekli arteriyel BP okumalarını kaydedin. Bu sensörü veri toplama donanımına bağlayın ve ilgili yazılımıyla ölçülen basınçları görselleştirin. Basınç görselleştirme penceresinde BP'yi gözlemleyin. BP kayıtları, istatistik yazılımında görselleştirme için bir elektronik tabloya aktarılabilir.
3. Alternatif olarak, bir balon kateteri kullanılarak BP'nin mekanik manipülasyonu isteniyorsa, mevcut femoral kılıftan 4 Fransız 5 mm'lik Fogarty balon kateterini ilerletin. Balonu infrarenal aort içine yerleştirin. Balonun yukarı yönündeki BP'yi sürekli izlemek üzere basınç izleme için 0,025 inç iç lümeni ve balonun aşağı yönündeki BP'nin sürekli izlenmesi için kılıfa bağlanacak ikinci bir BP izleme hattı için balonun 4 Fransız çapını kullanın.

7. Ötanazi ve doku hasadı

1. Tıkayıcı mikrokateteri 3 saat sonra çıkarın ve ardından istenen ek süre boyunca arteriyel BP ölçümüne ve modülasyonuna devam edin. Sonraki histolojide tamamlanmış bir enfarktüsün görüntülenmesi için 3 saatlik standart bir iyileşme süresi kullanılır.
2. Öngörülen tıkanma ve iyileşme sürelerini tamamladıktan sonra, hayvanın cerrahi bir anestezi düzleminde olduğundan emin olun ve ötenazi yapın (fosfat tamponlu çözelti ile perfüzyon fiksasyonu, ardından kardiyak aktivitenin yokluğunun doğrulanmasından sonra kafa kesme). Alternatif olarak, perfüzyonu femoral bir kılıftan infüze ederek ve daha sonra juguler veni, inferior vena kava veya sağ atriyumu transekte ederek perfüzyon fiksasyonu gerçekleştirin.
   NOT: Bazı postmortem analizler için perfüzyon tercih edilebilir, çünkü gen ekspresyonu veya biyobelirteç değerleri solüsyondan etkilenebilir. Her iki teknik de grubumuz tarafından başarıyla uygulanmıştır.
3. Beynin derhal toplanmasıyla yapılan akut prosedürlerde, ötenaziyi onaylayın ve hayvanın kafasını kesin. Kalvaryumu rongeurlarla parça parça bir şekilde çıkarın, oksipital sırttan başlayın ve beyin bozulmadan hasat edilene kadar önden çalışın. Beyni, istenen doku analizinin türüne bağlı olarak formalin veya optimum kesme sıcaklığı çözeltisine ve flaş dondurucuya yerleştirin.

Sonuçlar

Bu model ile yapılan ilk deneylerde grubumuz 14 hayvanın 12'sinde (%85.7) posterior serebral veya superior serebellar arter tıkanıklığının istenen sonucunu başarıyla elde etmiştir. Deney için yedi erkek ve yedi kadın incelendi. Ortalama hayvan ağırlığı 3.6 kg (± 0.46 kg) idi. Başarının elde edilemediği iki hayvanda, derin kateter kaynaklı vazospazm, intrakraniyal dolaşıma güvenli erişimi engelledi. Bir tavşanda, tıkayıcı vazospazm nedeniyle intrakraniyal erişim sağlanamadı ve diğer hay...

Tartışmalar

İD yönetiminde, özellikle akut müdahale ve ikincil önleme stratejilerindeki ilerlemeler göz önüne alındığında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Bununla birlikte, IS hastalarının bakımını iyileştirmek için daha fazla çalışma yapılabilir. IS tedavisinin diğer yönlerinde, özellikle nöroproteksiyon alanındaki sınırlı ilerleme, muhtemelen doku ve moleküler düzeyde mekanik süreçlerin patofizyolojik anlayışındaki sınırlamalardan kaynaklanmaktadır. İnsanlardan gelen etkili veriler ger...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 Silk Suture	Ethicon	A184H
Buprenorphine	Sigma-Aldrich	B9275
Catheter	Terumo	CG415	4F glide catheter
Endovascular Pressure Sensor	Millar	SPR-524
Euthasol	Virbac	PVS111
Guidewire	Terumo	GR1804
Iohexol	ThermoFisher	466651000	Iodinated Contrast
Ketamine	Biorbyt	orb61131
LabChart Software	ADInstruments
Lidocaine	Spectrum	LI102
Microcatheter	Medtronic	EV3 105-5056	Marathon Microcatheter
Microwire	Medtronic	EV3 103-0608	Mirage Microwire
PowerLab	ADInstruments
Rabbit Brain 2mm Coronal Cutting Matrix	Ted Pella	15026
Saline	FisherScientific	23-535435
Sheath	Merit Medical	PSI-5F-11
Xylazine	ThermoFisher	J61430.14