Мониторинг и модуляция артериального давления в режиме реального времени в модели ишемического инсульта у кроликов

Резюме

Непрерывная регистрация артериального давления позволяет исследовать влияние различных гемодинамических параметров. В этом отчете демонстрируется применение непрерывного мониторинга артериального давления на модели ишемического инсульта на крупных животных для определения патофизиологии инсульта, влияния различных гемодинамических факторов и оценки новых подходов к лечению.

Аннотация

Контроль артериального давления, как с точки зрения абсолютных значений, так и с точки зрения его вариабельности, влияет на исходы у пациентов с ишемическим инсультом. Тем не менее, по-прежнему сложно определить механизмы, которые приводят к плохим результатам, или оценить меры, с помощью которых эти последствия могут быть смягчены из-за запретительных ограничений, присущих человеческим данным. В таких случаях животные модели могут быть использованы для проведения строгих и воспроизводимых оценок заболеваний. Здесь мы сообщаем о уточнении ранее описанной модели ишемического инсульта у кроликов, которая дополняется непрерывной регистрацией артериального давления для оценки влияния модуляции на артериальное давление. Под общим наркозом бедренные артерии обнажаются через хирургические разрезы для двустороннего размещения артериальных оболочек. При рентгеноскопической визуализации и дорожной карте микрокатетер продвигается в артерию заднего круга кровообращения головного мозга. Ангиограмма выполняется путем инъекции контралатеральной позвоночной артерии для подтверждения окклюзии целевой артерии. Когда окклюзионный катетер остается в нужном положении в течение фиксированного времени, артериальное давление непрерывно регистрируется, чтобы обеспечить плотное титрование манипуляций с артериальным давлением, будь то механическими или фармакологическими средствами. По завершении интервала окклюзии микрокатетер удаляют, и животное поддерживается под общим наркозом в течение предписанной длины реперфузии. Для острых исследований животное затем усыпляют и обезглавливают. Мозг собирают и обрабатывают для измерения объема инфаркта под световой микроскопией и дополнительно оценивают с помощью различных гистопатологических пятен или пространственного транскриптомного анализа. Этот протокол обеспечивает воспроизводимую модель, которая может быть использована для более тщательных доклинических исследований влияния параметров артериального давления во время ишемического инсульта. Это также способствует эффективной доклинической оценке новых нейропротекторных вмешательств, которые могут улучшить уход за пациентами с ишемическим инсультом.

Введение

Ишемический инсульт (ИИ) является основной причиной смерти и длительной инвалидности во всем мире, и, по прогнозам, его распространенность будет увеличиваться по мере старения общества¹. Несмотря на то, что были достигнуты значительные успехи в неотложных вмешательствах и стратегиях вторичной профилактики, дополнительные нейропротекторные методы лечения не последовали быстро 2,3,4,5,6,7. Необходимы дальнейшие исследования патобиологии инсульта, потому что механизмы, с помощью которых терапия может оказаться или не оказаться эффективной, плохо изучены. Во многом это связано с гетерогенным характером популяции пациентов с инсультом, многие из которых имеют многочисленные сопутствующие заболевания, затрудняющие анализ¹. Одной из причин ограничений в исследованиях является отсутствие данных на тканевом уровне - золотой стандарт в биомедицинских исследованиях - из-за непомерно высокой заболеваемости забором тканей из центральной нервной системы человека. В частности, забор сосудистой ткани у живого человека может вызвать инсульт, поэтому сосудистая ткань обычно получается только при вскрытии, что недостаточно репрезентативно для населения в целом и склоняется к более позднему заболеванию у пожилых пациентов с сопутствующими диагнозами.

В таких случаях, когда не может быть использовано достаточное количество данных о человеке, животные модели могут восполнить пробелы в данных. Модели инсульта на крупных животных ограничены, так как большинство крупных животных, используемых в исследованиях, являются копытными, имеющими rete mirabile, который предотвращает прямой эндоваскулярный доступ к мозговым артериям 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Кролики имеют долгую историю использования для исследования сердечно-сосудистых заболеваний, включая внутричерепные патологии 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Кролики представляют собой идеальную модель цереброваскулярных заболеваний, потому что они достаточно велики для эндоваскулярной катетеризации и не имеют rete mirabile, который исключает внутричерепной доступ у других крупных млекопитающих 9,15,16,17. Ранее они использовались специально для исследования ИИ путем точной и хорошо контролируемой окклюзии внутричерепной артерии с помощью микрокатетера¹⁸.

Контроль артериального давления (АД), как посредством модуляции абсолютного АД, так и вариабельности АД (АД), степени, в которой артериальное АД колеблется вокруг среднего АД, является новой потенциальной терапевтической мишенью для пациентов с ИИ после сообщений о худших исходах у пациентов с плохо контролируемым АД или АД 19,20,21,22 . Механистическое исследование того, как изменения приводят к плохим результатам у пациентов с ИИ, отсутствует. Отчасти это связано с трудностями в получении данных на тканевом уровне и проведении хорошо контролируемых анализов у людей. Для тестирования вмешательств, модулирующих АД или БПВ, необходимо использовать модели на животных для преодоления этих ограничений. В этом отчете описывается успешное сопряжение ранее проверенной модели ИИ у кроликов с использованием контролируемой окклюзии задней мозговой артерии в сочетании с непрерывным внутриартериальным измерением АД¹⁸. Представленный здесь метод улучшает предыдущие подходы к патофизиологии инсульта, применяя проверенную и воспроизводимую модель инсульта к системе, в которой может быть достигнуто точное измерение и контроль АД. В этой уточненной модели инфарктное бремя может быть оценено с помощью постпроцедурного гистопатологического окрашивания собранного мозга, которое также поддается различным окрашиваниям и более продвинутым анализам, таким как пространственная транскриптомика. Кроме того, закупоренная артерия заднего круга кровообращения также может быть выбрана для оценки для анализа заболеваемости после процедур выживания.

протокол

Этот протокол одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (Университет штата Юта, номер протокола IACUC 21-09021). Зрелые новозеландские белые кролики получают от коммерческих продавцов.

1. Приобретение животных

1. Акклиматизация животных в течение необходимого времени после прибытия в соответствии с институциональным протоколом, социальное размещение животных в виварии со стандартными диетами чау-чау. Период акклиматизации в нашем учреждении составляет 2 недели.

2. Анестезия и мониторинг

1. Индуцируют общую эндотрахеальную анестезию внутримышечной инъекцией бупренорфина (0,03 мг/кг) с последующей внутримышечной инъекцией кетамина (25-35 мг/кг) и ксилазина (3 мг/кг). Поддерживайте анестезию 1-5% изофлураном в кислороде, вводимом через эндотрахеальную трубку. Во время индукции используйте 100% FiO 2, а затем титруйте до самого низкого FiO 2, который поддерживает 100% SpO₂.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывная анестезия необходима для предотвращения движения животного, так что инсульт будет единственным нарушением процесса индукции инсульта. Это также предотвращает скачки АД, которые могут возникнуть в результате возбуждения, которое может возникнуть из-за неадекватной анестезии. Последовательная оксигенация также важна для контроля для достижения сопоставимых инсультов. Все эти показатели учтены в репрезентативных результатах, описанных ниже.
2. Подтвердите достаточную глубину анестезии, применив вредные раздражители к пальцу ноги. Нанесите ветеринарную глазную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость.
3. Контролируйте насыщение кислородом с помощью пульсоксиметра, помещенного на ухо. Получите внутривенный доступ с помощью ангиокатетера в ушной вене. Убедитесь, что он закреплен швом или клейкой повязкой из прозрачной пленки. Чтобы смягчить спазм сосудов, поместите 0,25 дюйма трансдермального нитроглицерина на внутреннюю часть уха после индукции анестезии.
4. Обеспечьте поддерживающие жидкости нормальным физиологическим раствором со скоростью 1 куб. см / кг / ч. Установите датчик температуры пищевода для контроля температуры тела. Поддерживайте нормотермию (33-37 °C) по мере необходимости с помощью согревающих одеял, подложенных под животное.

3. Хирургическая подготовка

1. Поместите кролика в положение лежа на спине на операционном столе, совместимом с рентгеноскопией. Вытяните головку, так как она оптимизирует положение для последующих ангиографических изображений. Кролики имеют изысканно чувствительные артерии, склонные к спазму сосудов после инструментов.
2. Удалите мех с обеих паховых областей с помощью электрических машинок для стрижки. Затем пальпируйте двусторонние импульсы бедренной артерии, чтобы подтвердить адекватный клиренс путем двусторонней обрезки. Подготовьте кожу скрабами из хлоргексидина и спирта, а затем задрапируйте кожу обычным стерильным способом.
3. Вводят местную анестезию путем подкожного введения 2 мл 1% лидокаина в двусторонние паховые области. Сделайте хирургический разрез 5 см лезвием No 10 в месте, где был введен лидокаин. Используйте тупое рассечение, чтобы обнажить сосудисто-нервный пучок (рис. 1А). При необходимости расширьте разрез, чтобы адекватно обнажить артериальный сегмент, достаточно большой для доступа.
4. При выделении сосудисто-нервного пучка капните несколько капель 1% лидокаина на артерию, чтобы предотвратить спазм сосудов. Аккуратно отделите артерию от вены и соседнего нерва с помощью щипцов. Идентифицируют артерию по характерному внешнему виду ее мышечной стенки по сравнению с тонкими стенками вены. Артерия будет иметь более светлую кровь, в то время как вена будет содержать более темную кровь.

4. Артериальный доступ

1. После того, как артерия была изолирована, проведите под сосудом прямоугольные щипцы. Возьмитесь инструментом за две петли сосуда и осторожно проведите ими под артерией. Разместите по одному на верхнем и нижнем концах открытого сосуда.
2. Подвергните артерию мягкому вытяжению, потянув за петли сосуда. На этом этапе осмотрите сосуд на наличие остаточной ткани и удалите его с помощью осторожного рассечения (рис. 1B). Это увеличивает шансы на успешный доступ.
3. Для доступа используйте ангиокатетер 22 G. Слегка наденьте сам катетер на внутреннюю иглу, так как он часто прилипает, когда он полностью сидит, и может сместить устройство во время попыток доступа.
4. После рассечения сосуда и подготовки ангиокатетера снова закапайте лидокаин на сосуд. Артерия будет заметно расширяться, что увеличивает шансы на успешный доступ и размещение оболочки с использованием техники Сельдингера.
5. Мягко натяните нижнюю петлю сосуда, чтобы набухнуть артерию, уменьшив отток. Это также стабилизирует судно для попытки доступа. Медленно продвигайте иглу ангиокатетера в середину обнаженного артериального сегмента (рис. 1C). Когда в ангиокатетере и камере в его центре видна вспышка крови, направьте катетер над иглой в просвет артерии.
6. Если попытка доступа не увенчалась успехом, добейтесь гемостаза, применив тягу к петле судна вверх по течению. Промойте ангиокатетер физиологическим раствором и замените его на вводную иглу для дополнительных попыток.
7. Когда ангиокатетер успешно помещен в сосуд к его концентратору, проведите микропровод Cope через просвет ангиокатетера в аорту (рис. 1D). Снимите ангиокатетер с проволоки и замените его 5 французскими тонкими гидрофильными оболочками (рис. 1E).
8. Подтвердите возврат артериальной крови через трубку бокового рычага, открыв трехходовой клапан. Промойте оболочку 0,9% физиологическим раствором и закройте клапан во время промывки.
9. Закрепите ступицу ножен на прилегающей коже дополнительным шелковым швом 3-0. Повторите этот процесс для контралатеральной бедренной артерии. Для достижения более высокой эффективности два оператора могут одновременно работать, сосредотачиваясь на одной артерии каждый.

5. Шейно-мозговая ангиография и внутричерепной доступ

1. При рентгеноскопической визуализации направьте 4 французских скользящих катетера на 0,035-дюймовую скользящую проволоку, вставленную через левую оболочку бедренной кости. Расположите наконечник скользящего катетера в проксимальном отделе левой позвоночной артерии. Извлеките проволоку и промойте катетер гепаринизированным 0,9% физиологическим раствором.
2. Выполняйте ангиографию вручную, вводя йодированный контраст в левую позвоночную артерию под малым увеличением, чтобы визуализировать всю голову и шею (рис. 2А). Модулируйте инъекцию контрастного раствора, начиная с инъекции под низким давлением, которая нарастает, чтобы визуализировать всю сосудистую сеть.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходима достаточная инъекция для визуализации рефлюкса вниз по правой позвоночной артерии, так как это ангиографическое изображение будет использоваться для руководства дорожной картой для эффективного выбора правильной позвоночной артерии. Мягкая инъекция необходима, чтобы свести к минимуму спазм сосудов или более глубокие повреждения. Кроме того, чрезмерная сила или объем могут вызвать преходящие движения животного даже под глубокой анестезией.
3. Для инъекции в левый позвонок введите 50% контраст, разведенный в физиологическом растворе, с легким крещендо из шприца объемом 3 куб. См. Обычно достаточно ввести 1-2 куб. см разбавленного контраста. Определите адекватное количество инъекции, проверив рефлюкс вниз по правой позвоночной артерии и в правую подключичную артерию. Во время этой инъекции также обратите внимание на заднюю мозговую и верхнюю мозжечковые артерии, одна из которых будет мишенью для окклюзии микрокатетером.
4. Подготовьте 2,4-дюймовый проточный микрокатетер с 0,010-дюймовым микропроводом. Сделайте С-образную форму на кончике микропровода. В соответствии с дорожной картой продвигайте микрокатетер внутри катетера с 4 французскими скольжениями через правую оболочку бедренной кости и по проводу в правую позвоночную артерию. Из-за склонности к катетер-индуцированному спазму сосудов минимизируйте время манипуляции с устройством и количество выполненных попыток катетера.
5. Продвигают микрокатетер через шейный сегмент правой позвоночной артерии. Чтобы наилучшим образом пройти резкий поворот от сегмента V2 к сегменту V3, продвигайте микрокатетер в одиночку, пока микропровод находится проксимальнее его кончика. Сведение микропровода в этот момент часто вызывает выделение мелких боковых ветвей позвоночной артерии и может быть источником существенного спазма сосудов.
6. После прохождения резкого поворота от V2 к V3 микрокатетер часто легко переходит к проксимальному отделу основной артерии. В этот момент продвигают микропровод и выбирают нужную заднюю мозговую или верхнюю мозжечковую артерию. Инъекции микрокатетера не рекомендуются, учитывая хрупкий характер внутричерепных артерий.
7. Продвиньте микрокатетер по микропроводу в целевую артерию. Выберите проксимальное положение, так как оно обычно безопаснее всего в задней части для общения из-за его угла в начале. Более глубокое положение возможно в верхней мозжечковой артерии (рис. 2Б).
8. Повторите ангиограмму, введя катетер левой позвоночной артерии с большим увеличением над головой, чтобы подтвердить окклюзию целевой артерии (рис. 2B-C). Для оптимальной визуализации введите контраст полной силы в шприц объемом 3 куб. см. Как правило, для адекватного помутнения всех внутричерепных артерий требуется не более 1 куб. см.
9. Аккуратно извлеките микропровод из микрокатетера под рентгеноскопической визуализацией, чтобы подтвердить стабильное положение. Поместите запорный кран на ступицу микрокатетера и закройте запорный кран, чтобы предотвратить кровопотерю из-за ретроградного кровотока. Удалите катетер левого позвонка, чтобы освободить оболочку левого бедренного доступа.
10. В течение последующего периода окклюзии получите прерывистые рентгеноскопические изображения, чтобы подтвердить стабильное положение окклюзионного микрокатетера. Результаты периодов окклюзии задней мозговой артерии в диапазоне от 60 до 240 минут были опубликованы ранее¹⁸.

6. Измерение и модуляция артериального давления

1. В то время как один участок бедренного доступа используется для окклюзионного внутричерепного микрокатетера, используйте контралатеральную оболочку для измерения АД.
2. Записывайте непрерывные показания артериального АД с помощью пьезорезистивного датчика 3 французских калибра, помещенного через оболочку бедренной кости и продвигаемого до тех пор, пока наконечник датчика не окажется в нижней грудной аорте. Подключите этот датчик к оборудованию для сбора данных и визуализируйте измеренное давление с помощью соответствующего программного обеспечения. Наблюдайте за АД в окне визуализации давления. Записи BP могут быть экспортированы в электронную таблицу для визуализации в статистическом программном обеспечении.
3. В качестве альтернативы, если требуется механическое манипулирование АД с использованием баллонного катетера, вставьте 4-французский баллонный катетер Фогарти диаметром 5 мм через имеющуюся бедренную оболочку. Поместите баллон в подаренную аорту. Используйте внутренний просвет 0,025 дюйма для отслеживания давления, чтобы непрерывно контролировать АД перед баллоном, и диаметр 4 френча баллона для второй линии отслеживания АД, которая будет подключена к оболочке для непрерывного мониторинга АД ниже по течению от баллона.

7. Эвтаназия и забор тканей

1. Удалить окклюзионный микрокатетер через 3 ч, а затем продолжить измерение артериального АД и модуляцию в течение дополнительного желаемого периода. Стандартный восстановительный период продолжительностью 3 ч используется для визуализации завершенного инфаркта при последующей гистологии.
2. После завершения предписанного времени окклюзии и восстановления убедитесь, что животное находится в хирургической плоскости анестезии, и выполните эвтаназию (перфузионную фиксацию фосфатным буферным раствором с последующим обезглавливанием после подтверждения отсутствия сердечной деятельности). В качестве альтернативы выполняют перфузионную фиксацию путем инфузии перфузата через бедренную оболочку, а затем пересечения яремной вены, нижней полой вены или правого предсердия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузия может быть предпочтительнее для некоторых посмертных анализов, поскольку раствор может повлиять на экспрессию генов или значения биомаркеров. Обе техники были успешно выполнены нашей группой.
3. При острых процедурах с немедленным забором мозга подтверждают эвтаназию и обезглавливают животное. Удаляйте кальварий по частям с помощью ронгеров, начиная с затылочного гребня и работая кпереди до тех пор, пока мозг не будет собран в целости и сохранности. Поместите мозг в формалин или раствор с оптимальной температурой резки и заморозьте, в зависимости от желаемого типа анализа тканей.

Результаты

В первоначальных экспериментах с этой моделью наша группа успешно достигла желаемого результата окклюзии задней церебральной или верхней мозжечковой артерии у 12 из 14 животных (85,7%). Для эксперимента были изучены семь самцов и семь самок. Средняя масса животного составила 3,6 кг (± 0,46 кг). ...

Обсуждение

Существенный прогресс был достигнут в лечении ИС, особенно с учетом достижений в стратегиях неотложного вмешательства и вторичной профилактики. Тем не менее, можно проделать большую работу по улучшению ухода за пациентами с ИБ. Ограниченный прогресс в других аспектах лечения ИИ, особе...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 Silk Suture	Ethicon	A184H
Buprenorphine	Sigma-Aldrich	B9275
Catheter	Terumo	CG415	4F glide catheter
Endovascular Pressure Sensor	Millar	SPR-524
Euthasol	Virbac	PVS111
Guidewire	Terumo	GR1804
Iohexol	ThermoFisher	466651000	Iodinated Contrast
Ketamine	Biorbyt	orb61131
LabChart Software	ADInstruments
Lidocaine	Spectrum	LI102
Microcatheter	Medtronic	EV3 105-5056	Marathon Microcatheter
Microwire	Medtronic	EV3 103-0608	Mirage Microwire
PowerLab	ADInstruments
Rabbit Brain 2mm Coronal Cutting Matrix	Ted Pella	15026
Saline	FisherScientific	23-535435
Sheath	Merit Medical	PSI-5F-11
Xylazine	ThermoFisher	J61430.14