허혈성 뇌졸중의 토끼 모델에서 혈압의 실시간 모니터링 및 조절

요약

지속적인 동맥 혈압 기록을 통해 다양한 혈역학 적 매개 변수의 영향을 조사 할 수 있습니다. 이 보고서는 뇌졸중 병태생리학, 다양한 혈역학적 요인의 영향 및 새로운 치료 접근법의 평가를 결정하기 위해 허혈성 뇌졸중의 대규모 동물 모델에서 지속적인 동맥 혈압 모니터링의 적용을 보여줍니다.

초록

절대값과 변동성 측면에서 혈압 조절은 허혈성 뇌졸중 환자의 결과에 영향을 미칩니다. 그러나 열악한 결과를 초래하는 메커니즘을 식별하거나 인간 데이터에 내재된 금지된 한계로 인해 이러한 영향을 완화할 수 있는 조치를 평가하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 이러한 경우 동물 모델을 사용하여 질병에 대한 엄격하고 재현 가능한 평가를 수행할 수 있습니다. 여기에서 우리는 혈압 조절의 영향을 평가하기 위해 지속적인 혈압 기록으로 보강된 토끼의 허혈성 뇌졸중 모델에 대한 개선을 보고합니다. 전신 마취 하에서 대퇴 동맥은 외과적 절단을 통해 노출되어 동맥초를 양측으로 배치합니다. 형광 투시 시각화 및 로드맵 지침에 따라 마이크로 카테터는 뇌의 후방 순환 동맥으로 진행됩니다. 혈관 조영술은 표적 동맥의 폐색을 확인하기 위해 반대쪽 척추 동맥을 주입하여 수행됩니다. 폐쇄형 카테터가 고정된 기간 동안 제자리에 남아 있는 상태에서 혈압은 기계적 또는 약리학적 수단을 통해 혈압 조작을 엄격하게 적정할 수 있도록 지속적으로 기록됩니다. 폐색 간격이 끝나면 마이크로 카테터가 제거되고 동물은 규정 된 재관류 기간 동안 전신 마취하에 유지됩니다. 급성 연구의 경우, 동물은 안락사되고 목이 잘립니다. 뇌를 채취 및 처리하여 광학 현미경으로 경색 부피를 측정하고 다양한 조직병리학적 염색 또는 공간 전사체 분석으로 추가로 평가합니다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중 동안 혈압 매개변수의 영향에 대한 보다 철저한 전임상 연구에 활용할 수 있는 재현 가능한 모델을 제공합니다. 또한 허혈성 뇌졸중 환자의 치료를 개선할 수 있는 새로운 신경 보호 중재의 효과적인 전임상 평가를 용이하게 합니다.

서문

허혈성 뇌졸중(IS)은 전 세계적으로 사망 및 장기 장애의 주요 원인이며 사회가¹세가 됨에 따라 유병률이 증가할 것으로 예상됩니다. 급성 중재 및 2차 예방 전략에서 상당한 진전이 있었지만 보조 신경 보호 치료는 2,3,4,5,6,7을 따르지 않았습니다. 뇌졸중 병리학에 대한 추가 연구가 필요한데, 그 이유는 치료법이 효과적일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는 메커니즘이 잘 이해되지 않았기 때문이다. 이는 주로 뇌졸중 환자 집단의 이질적인 특성에 기인하며, 이들 중 다수는 분석을 혼란스럽게 하는 수많은 동반 질환을 가지고 있습니다¹. 연구의 한계를 나타내는 한 가지 요인은 인간 중추 신경계에서 조직을 샘플링하는 데 따른 엄청난 이환율로 인해 생물 의학 연구의 황금 표준인 조직 수준 데이터가 없다는 것입니다. 특히, 살아있는 사람의 혈관 조직 채취는 뇌졸중을 유발할 수 있으므로 혈관 조직은 일반적으로 부검에서만 얻어지며, 이는 일반 인구를 과소 대표하고 수반되는 진단을 받은 노인 환자의 경우 더 진행된 질병으로 치우쳐 있습니다.

이러한 경우 충분한 인간 데이터를 활용할 수 없는 경우 동물 모델이 데이터 격차를 해소할 수 있습니다. 연구에 사용되는 대부분의 대형 동물은 대뇌동맥에 대한 직접적인 혈관내 접근을 방지하는 rete mirabil을 갖는 유제류이기 때문에 뇌졸중의 대형 동물 모델은 제한적입니다 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . 토끼는 두개내 병리를 포함한 심혈관 질환의 조사에 오랜 역사를 가지고 있다 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. 토끼는 혈관내 카테터 삽입을 할 수 있을 만큼 충분히 크고 다른 대형 포유류에서 두개내 접근을 배제하는 rete mirabil이 없기 때문에 뇌혈관 질환에 대한 이상적인 모델을 제시합니다 9,15,16,17. 이들은 이전에 마이크로카테터(microcatheter)를 이용한 두개내 동맥의 정밀하고 잘 제어된 폐색을 통해 IS의 조사에 특별히 활용되었다¹⁸.

동맥 혈압이 평균 혈압 주위에서 변동하는 정도인 절대 혈압 또는 혈압 변동성(BPV)의 조절을 통한 혈압(BP) 조절은 혈압 또는 혈압이 잘 조절되지 않는 환자에서 더 나쁜 결과가 보고된 후 IS 환자의 새로운 잠재적 치료 표적입니다 19,20,21,22. 변화가 어떻게 IS 환자의 나쁜 결과로 이어지는지에 대한 기계론적 조사가 부족합니다. 이는 부분적으로 조직 수준 데이터를 얻고 인간에서 잘 제어된 분석을 수행하는 데 어려움이 있기 때문입니다. BP 또는 BPV를 조절하는 개입을 테스트하려면 이러한 한계를 극복하기 위해 동물 모델을 활용해야 합니다. 이 보고서는 BP¹⁸의 지속적인 동맥 내 측정과 함께 후대뇌 동맥의 제어된 폐색을 사용하여 이전에 검증된 IS의 토끼 모델의 성공적인 페어링을 설명합니다. 여기에 제시된 방법은 BP의 정확한 측정 및 제어가 달성될 수 있는 시스템에 검증되고 재현 가능한 뇌졸중 모델을 적용하여 뇌졸중 병태생리학에 대한 이전 접근 방식을 개선합니다. 이 정제된 모델에서 경색 부담은 채취된 뇌의 시술 후 조직병리학적 염색으로 평가할 수 있으며, 이는 다양한 염색 및 공간 전사체학과 같은 고급 분석에도 적용할 수 있습니다. 또한, 폐색된 후방 순환 동맥도 생존 절차 후 이환율 분석을 위해 평가되도록 선택할 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회(유타 대학교 IACUC 프로토콜 번호 21-09021)의 승인을 받았습니다. 성숙한 뉴질랜드 흰 토끼는 상업 공급 업체에서 얻습니다.

1. 동물 획득

1. 제도적 프로토콜에 따라 도착 후 필요한 기간 동안 동물을 적응시키고 표준 차우 식단으로 동물 사육장에 동물을 사회적으로 수용합니다. 우리 기관의 적응 기간은 2 주입니다.

2. 마취 및 모니터링

1. 부프레노르핀(0.03 mg/kg)을 근육주사하고 약 30분 후 케타민(25-35 mg/kg)과 자일라진(3 mg/kg)을 근육주사하여 전신기관내 마취를 유도한다. 기관내관을 통해 투여되는 산소에 1%-5% 이소플루란으로 마취를 유지하십시오. 유도하는 동안 100% FiO2를 사용한 다음 100%_SpO2를 유지하는 가장 낮은_FiO2로 적정합니다.
   참고: 뇌졸중이 뇌졸중 유도 과정의 유일한 방해가 되도록 동물의 움직임을 방지하기 위해 중단 없는 마취가 필요합니다. 이것은 또한 부적절한 마취로 인해 발생할 수 있는 동요로 인한 혈압의 급증을 방지합니다. 일관된 산소 공급은 비슷한 스트로크를 달성하기 위해 제어하는 데에도 중요합니다. 이러한 조치는 모두 아래에 설명된 대표적인 결과에서 설명됩니다.
2. 발가락에 유해한 자극을 가하여 적절한 마취 깊이를 확인하십시오. 건조를 예방하기 위해 눈에 수의학 눈 연고를 바르십시오.
3. 귀에 부착된 맥박 산소 측정기로 산소 포화도를 모니터링합니다. 귀 정맥에 혈관 카테터를 사용하여 정맥 주사를 받으십시오. 봉합사 또는 접착 투명 필름 드레싱으로 고정되었는지 확인하십시오. 혈관 경련을 완화하려면 마취 유도 후 귀 안쪽에 0.25인치의 경피 니트로글리세린을 놓습니다.
4. 유지 보수액에 1cc/kg/h의 속도로 생리 식염수를 제공하십시오. 식도 온도 프로브를 배치하여 체온을 모니터링합니다. 동물 아래에 온난화 담요를 놓고 필요에 따라 정상 체온 (33-37 ° C)을 유지하십시오.

3. 수술 준비

1. 토끼를 형광투시 호환 수술대에 앙와위 자세로 놓습니다. 후속 혈관 조영술 보기를 위한 위치를 최적화하여 머리를 확장합니다. 토끼는 계측 후 혈관 경련을 일으키기 쉬운 절묘하게 민감한 동맥을 가지고 있습니다.
2. 전기 가위를 사용하여 두 사타구니 부위에서 털을 제거하십시오. 다음으로, 양측 대퇴 동맥 맥박을 촉진하여 양측으로 트리밍하여 적절한 클리어런스를 확인합니다. 클로르헥시딘과 알코올의 스크럽으로 피부를 준비한 다음 일반적인 멸균 방식으로 피부를 드레이프하십시오.
3. 1% 리도카인 2mL를 양측 사타구니 부위에 피하 주사하여 국소 마취를 시행합니다. 리도카인을 주사한 부위에 10번 칼날로 5cm 수술 절개를 합니다. 무딘 절개를 사용하여 신경혈관 다발을 노출시킵니다(그림 1A). 필요한 경우 절개를 확장하여 접근할 수 있을 만큼 충분히 큰 동맥 부분을 적절하게 노출시킵니다.
4. 신경 혈관 다발을 분리하면 혈관 경련을 예방하기 위해 동맥에 1 % 리도카인 몇 방울을 떨어 뜨립니다. 집게를 사용하여 정맥과 인접한 신경에서 동맥을 부드럽게 분리하십시오. 정맥의 얇은 벽과 비교하여 근육 벽의 특징적인 모양으로 동맥을 식별하십시오. 동맥은 더 밝은 혈액을 가지고 있고 정맥은 더 어두운 혈액을 포함합니다.

4. 동맥 접근

1. 동맥이 분리 된 후 직각 집게를 혈관 아래로 통과시킵니다. 기구로 두 개의 혈관 루프를 잡고 동맥 아래로 부드럽게 통과시킵니다. 노출된 용기의 상류 및 하류 끝에 각각 하나씩 배치합니다.
2. 혈관 루프를 당겨 동맥을 부드럽게 견인하십시오. 이 시점에서 혈관에 잔여 조직이 있는지 검사하고 부드럽게 해부하여 제거합니다(그림 1B). 이렇게 하면 성공적인 액세스 가능성이 높아집니다.
3. 접근을 위해 22G 혈관 카테터를 사용하십시오. 카테터 자체를 내부 바늘 위로 약간 전진시키면 완전히 장착되었을 때 종종 달라붙고 접근을 시도하는 동안 장치가 빠질 수 있습니다.
4. 혈관을 해부하고 혈관 카테터를 준비한 후 혈관에 리도카인을 다시 떨어 뜨립니다. 동맥이 눈에 띄게 확장되어 Seldinger 기술을 사용하여 외장에 성공적으로 접근하고 배치 할 가능성이 높아집니다.
5. 하류 혈관 루프에 부드러운 견인력을 적용하여 유출을 줄임으로써 동맥을 충혈시킵니다. 이것은 또한 접근 시도를 위해 선박을 안정화시킵니다. 혈관 카테터의 바늘을 노출된 동맥 부분의 중앙으로 천천히 전진시킵니다(그림 1C). 혈관 카테터와 그 허브의 챔버에서 혈액이 번쩍이는 것이 보이면 바늘을 통해 동맥 내강으로 카테터를 전진시킵니다.
6. 접근 시도가 실패하면 상류 선박 루프에 견인력을 적용하여 지혈을 달성하십시오. 혈관 카테터를 식염수로 세척하고 추가 시도를 위해 도입기 바늘에 교체하십시오.
7. 혈관 카테터가 혈관 내 허브에 성공적으로 배치되면 Cope 마이크로와이어를 혈관 카테터 내강을 통해 대동맥으로 전진시킵니다(그림 1D). 와이어 위의 혈관 카테터를 제거하고 5 프렌치 슬림 친수성 덮개로 교체합니다(그림 1E).
8. 3방향 밸브를 열어 사이드암 튜브를 통해 동맥혈이 돌아오는지 확인합니다. 0.9% 식염수로 피복을 세척하고 세척하는 동안 밸브를 잠급니다.
9. 추가 3-0 실크 봉합사로 시스 허브를 인접한 피부에 고정합니다. 반대쪽 대퇴 동맥에 대해 이 과정을 반복합니다. 더 높은 효율성을 달성하기 위해 두 명의 작업자가 각각 하나의 동맥에 집중하면서 동시에 작업할 수 있습니다.

5. 자궁 경부 혈관 조영술 및 두개 내 접근

1. 형광 투시 시각화에서 왼쪽 대퇴골초를 통해 삽입된 0.035인치 글라이드와이어 위로 4프렌치 글라이드 카테터를 전진시킵니다. 활공 카테터의 끝을 근위 왼쪽 척추 동맥에 위치시킵니다. 와이어를 제거하고 헤파린 처리 된 0.9 % 식염수로 카테터를 씻어냅니다.
2. 왼쪽 척추 동맥에 요오드화 조영제를 저배율로 직접 주입하여 혈관 조영술을 수행하여 전체 머리와 목을 시각화합니다(그림 2A). 전체 혈관 구조를 시각화하기 위해 크레센도하는 저압 주입으로 시작하여 조영제 주입을 조절합니다.
   참고: 이 혈관 조영술 이미지는 올바른 척추 동맥을 효율적으로 선택하기 위한 로드맵 안내에 사용되므로 오른쪽 척추 동맥 아래로 역류를 시각화하기 위한 충분한 주사가 필요합니다. 혈관 경련이나 더 심한 부상을 최소화하려면 부드러운 주사가 필요합니다. 또한 과도한 힘이나 부피는 깊은 마취 상태에서도 동물의 일시적인 움직임을 유도할 수 있습니다.
3. 왼쪽 척추 주사의 경우 생리 식염수에 희석한 50% 조영제를 3cc 주사기에서 부드러운 크레센도로 주사합니다. 일반적으로 1-2cc의 희석된 조영제를 주입하면 충분합니다. 우측 척추 동맥과 우측 쇄골하 동맥으로의 역류를 확인하여 적절한 주입량을 결정합니다. 이 주사 동안 후방 대뇌 및 상부 소뇌 동맥에 유의하십시오.이 동맥 중 하나는 마이크로 카테터로 폐색하는 표적이 될 것입니다.
4. 0.010인치 마이크로와이어가 있는 2.4 프렌치 흐름 유도 마이크로카테터를 준비합니다. 마이크로 와이어의 끝 부분에 C 자 모양을 만듭니다. 로드맵 지침에 따라 4 프렌치 글라이드 카테터 내부의 마이크로카테터를 오른쪽 대퇴골초를 통해 와이어를 통해 오른쪽 척추 동맥으로 전진시킵니다. 카테터 유발 혈관 경련의 성향으로 인해 장치 조작 시간과 수행되는 카테터 시도 횟수를 최소화하십시오.
5. 오른쪽 척추 동맥의 자궁 경부 부분을 통해 마이크로 카테터를 전진시킵니다. V2에서 V3 세그먼트로의 급격한 회전을 가장 잘 통과시키려면 마이크로와이어가 끝 부분까지 다시 근위부에 있는 동안 마이크로카테터만 전진시킵니다. 이 시점에서 마이크로와이어로 유도하는 것은 종종 척추 동맥의 작은 측면 가지의 선택을 유발하고 상당한 혈관 경련의 원인이 될 수 있습니다.
6. V2에서 V3으로 급격한 회전을 통과 한 후, 마이크로 카테터는 종종 근위 기저 동맥으로 쉽게 전달됩니다. 이 시점에서 마이크로 와이어를 전진시키고 원하는 후방 대뇌 또는 상부 소뇌 동맥을 선택하십시오. 마이크로 카테터 주사는 두개 내 동맥의 연약한 특성을 감안할 때 권장되지 않습니다.
7. 마이크로와이어를 통해 마이크로카테터를 표적 동맥으로 전진시킵니다. 근위 위치는 원점에서의 각도로 인해 일반적으로 뒤쪽에서 통신하는 것이 가장 안전하므로 선택하십시오. 상부 소뇌 동맥에서 더 깊은 위치가 가능합니다(그림 2B).
8. 표적 동맥의 폐색을 확인하기 위해 왼쪽 척추 동맥 카테터를 머리 위로 고배율로 주입하여 혈관 조영술을 반복합니다(그림 2B-C). 최적의 이미징을 위해 3cc 주사기에 최대 강도의 대비를 주입하십시오. 일반적으로 모든 두개내 동맥의 적절한 혼탁을 위해 1cc 이하가 필요합니다.
9. 형광 투시 시각화 하에서 마이크로카테터에서 마이크로와이어를 부드럽게 제거하여 안정적인 위치를 확인합니다. 마이크로카테터의 허브에 마개를 놓고 마개를 닫아 역행 혈류로 인한 혈액 손실을 방지합니다. 왼쪽 척추 카테터를 제거하여 왼쪽 대퇴골 접근 덮개를 사용할 수 있도록 합니다.
10. 이어지는 폐색 기간 동안 간헐적 형광 투시 이미지를 획득하여 폐색 마이크로카테터의 안정적인 위치를 확인합니다. 60-240분 범위의 후대뇌동맥 폐색 기간의 결과는 이전에^{발표되었습니다 18}.

6. 혈압 측정 및 조절

1. 하나의 대퇴골 접근 부위가 폐쇄성 두개내 마이크로카테터에 사용되지만 BP 측정을 위해 반대쪽 덮개를 사용합니다.
2. 3 프렌치 게이지 압저항 센서로 연속 동맥 혈압 판독값을 기록하고 대퇴골초를 통해 배치하고 센서 팁이 하부 흉부 대동맥에 올 때까지 전진합니다. 이 센서를 데이터 수집 하드웨어에 연결하고 관련 소프트웨어로 측정된 압력을 시각화하십시오. 압력 시각화 창에서 BP를 관찰합니다. BP 기록은 통계 소프트웨어에서 시각화하기 위해 스프레드시트로 내보낼 수 있습니다.
3. 또는 풍선 카테터를 사용하여 BP의 기계적 조작이 필요한 경우 사용 가능한 대퇴골초를 통해 4 French 5mm Fogarty 풍선 카테터를 전진시킵니다. 신장하 대동맥에 풍선을 놓습니다. 압력 추적을 위해 0.025 인치 내부 루멘을 사용하여 풍선의 상류에서 BP를 지속적으로 모니터링하고 풍선의 하류에서 BP를 지속적으로 모니터링하기 위해 외피에 연결되는 두 번째 BP 추적 라인에 대해 풍선의 4 프렌치 직경을 사용합니다.

7. 안락사와 조직 적출

1. 3시간 후에 폐색 마이크로카테터를 제거한 다음 추가로 원하는 기간 동안 동맥 혈압 측정 및 조절을 계속합니다. 3시간의 표준 회복 기간은 후속 조직학에서 완료된 경색의 시각화에 사용됩니다.
2. 규정 된 폐색 및 회복 시간을 완료 한 후, 동물이 마취의 외과 적 평면에 있는지 확인하고 안락사 (인산염 완충 용액으로 관류 고정, 심장 활동의 부재를 확인한 후 참수)를 수행하십시오. 또는 대퇴골초를 통해 관류액을 주입한 다음 경정맥, 하대정맥 또는 우심방을 절개하여 관류 고정을 수행합니다.
   참고: 관류는 유전자 발현 또는 바이오마커 값이 용액의 영향을 받을 수 있으므로 일부 사후 분석에 선호될 수 있습니다. 두 기술 모두 우리 그룹에서 성공적으로 수행되었습니다.
3. 뇌를 즉시 수확하는 급성 절차에서 안락사를 확인하고 동물의 목을 베십시오. 후두부 능선에서 시작하여 뇌가 손상되지 않을 때까지 전방으로 작업하면서 rongeurs를 사용하여 단편적인 방식으로 calvarium을 제거합니다. 뇌를 포르말린 또는 최적 절단 온도 용액에 넣고 원하는 조직 분석 유형에 따라 급속 동결합니다.

결과

이 모델을 사용한 초기 실험에서 우리 그룹은 14 마리 중 12 마리 (85.7 %)에서 후방 대뇌 또는 상부 소뇌 동맥 폐색의 원하는 결과를 성공적으로 달성했습니다. 실험을 위해 7 명의 남성과 7 명의 여성이 연구되었습니다. 평균 동물 체중은 3.6 kg (± 0.46 kg)이었다. 성공하지 못한 두 동물에서 심한 카테터 유발 혈관 경련으로 인해 두개 내 순환에 안전하게 접근 할 수 없었습니다. 한 토끼에서는 폐쇄성 ?...

토론

특히 급성 개입 및 2차 예방 전략의 발전을 고려할 때 IS 관리에 상당한 진전이 있었습니다. 그러나 IS 환자에 대한 치료를 개선하기 위해 더 많은 작업을 수행할 수 있습니다. IS 치료의 다른 측면, 특히 신경 보호 영역에서 제한된 진전은 조직 및 분자 수준에서 기계론적 과정에 대한 병태생리학적 이해의 한계에서 비롯된 것 같습니다. 인간의 영향력 있는 데이터는 비현실적이며 획득이 불가능할 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 Silk Suture	Ethicon	A184H
Buprenorphine	Sigma-Aldrich	B9275
Catheter	Terumo	CG415	4F glide catheter
Endovascular Pressure Sensor	Millar	SPR-524
Euthasol	Virbac	PVS111
Guidewire	Terumo	GR1804
Iohexol	ThermoFisher	466651000	Iodinated Contrast
Ketamine	Biorbyt	orb61131
LabChart Software	ADInstruments
Lidocaine	Spectrum	LI102
Microcatheter	Medtronic	EV3 105-5056	Marathon Microcatheter
Microwire	Medtronic	EV3 103-0608	Mirage Microwire
PowerLab	ADInstruments
Rabbit Brain 2mm Coronal Cutting Matrix	Ted Pella	15026
Saline	FisherScientific	23-535435
Sheath	Merit Medical	PSI-5F-11
Xylazine	ThermoFisher	J61430.14