JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, zSpRY-ABE8e kullanarak kesin bir zebra balığı hastalığı modeli oluşturmak için PAM sınırlaması olmadan verimli adenin baz düzenlemesinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar.

Özet

CRISPR / Cas9 teknolojisi, insan genetik hastalıklarının modellenmesi, hastalık patogenezinin incelenmesi ve ilaç taraması için zebra balıklarının değerini artırmıştır, ancak protospacer bitişik motif (PAM) sınırlamaları, tek nükleotid varyantlarının (SNV'ler) neden olduğu insan genetik bozukluklarının doğru hayvan modellerini oluşturmanın önündeki en büyük engeldir. Şimdiye kadar, geniş PAM uyumluluğuna sahip bazı SpCas9 varyantları zebra balıklarında verimlilik göstermiştir. Zebra balığında optimize edilmiş SpRY aracılı adenin baz editörü (ABE), zSpRY-ABE8e ve sentetik olarak modifiye edilmiş gRNA'nın uygulanması, PAM kısıtlaması olmadan verimli adenin-guanin baz dönüşümü sağlamıştır. Burada açıklanan, zSpRY-ABE8e kullanan zebra balıklarında PAM sınırlaması olmadan verimli adenin baz düzenlemesi için bir protokoldür. Zebra balığı embriyolarına zSpRY-ABE8e mRNA ve sentetik olarak modifiye edilmiş gRNA'nın bir karışımı enjekte edilerek, TSR2 ribozom olgunlaşma faktörünün (tsr2) patojenik bir bölgesini simüle eden hassas bir mutasyonla bir zebra balığı hastalık modeli oluşturuldu. Bu yöntem, hastalık mekanizmalarını ve tedavilerini incelemek için doğru hastalık modellerinin oluşturulması için değerli bir araç sağlar.

Giriş

Yanlış veya saçma sapan mutasyonlara neden olan tek nükleotid varyantları (SNV'ler), insan genomu1'deki en yaygın mutasyon kaynağıdır. Belirli bir SNV'nin patojenik olup olmadığını belirlemek ve patogenezine ışık tutmak için kesin hayvan modelleri gereklidir2. Zebra balığı, insanlarla yüksek derecede fizyolojik ve genetik homoloji, kısa bir gelişimsel döngü ve patojenik özellikler ve mekanizmaların araştırılması ve ilaç taraması için avantajlı olan güçlü üreme yeteneği sergileyen iyi insan hastalığı modelleridir3.

Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) / Cas9 sistemi, zebra balığı4 de dahil olmak üzere çeşitli türlerin genom düzenlenmesinde yaygın olarak uygulanmıştır. gRNA rehberliğinde, CRISPR / Cas9 sistemi hedef bölgede DNA çift sarmallı kırılmalar (DSB'ler) üretebilir, bu da hedef bölgenin homolojiye yönelik onarım (HDR) yolu aracılığıyla donör DNA şablonlarıyla rekombinasyonu yoluyla tek baz ikamesine izin verir. Bununla birlikte, bu baz replasman yönteminin etkinliği oldukça düşüktür, çünkü hücresel DNA onarım işlemi esas olarak genellikle yerleştirme ve silme (indel) mutasyonlarının eşlik ettiği homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) yolu tarafından gerçekleştirilir5. Neyse ki, CRISPR / Cas9 tabanlı tek tabanlı düzenleme teknolojisi, DSB'leri tetiklemeden daha verimli tek tabanlı düzenlemeye olanak tanıyan temel editörleri kullanarak bu sorunu önemli ölçüde hafifletir. İki ana baz editör sınıfı, adenin baz editörleri (ABE'ler) ve sitozin baz editörleri (CBE'ler), A · için baz ikame düzenlemesini uygulamak üzere geliştirilmiştir. T'den G· C ve C·G'den T·'ye A, sırasıyla 6,7,8,9,10,11. Bu dört tip baz ikamesi, insan patojenik varyantlarının% 30'unu kapsar12. PmCDA1, BE sistemi, CBE4max, ABE7.10 ve ABE8e dahil olmak üzere her iki temel editör sınıfının zebra balıklarında çalıştığı bildirilmiştir; BE4max ve ABE8e'nin özellikle yüksek düzenleme aktivitesi 13,14,15,16,17,18,19 elde ettiği bildirilmiştir.

Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes ve S. canis dahil olmak üzere farklı türlerden Cas9 proteinleri, zebra balığı gen düzenlemesinde uygulanmış, Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) en yaygın olarak20,21,22,23 olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, SpCas9 yalnızca düzenlenebilir aralığını sınırlayan ve ilgilenilen patojenik alanın yakınında uygun bir sekansın bulunamamasına neden olabilen bir NGG protospacer bitişik motifi (PAM) olan hedef bölgeleri tanıyabilir24. Hedef aralığı genişletmek için, yönlendirilmiş evrim ve yapı kılavuzlu tasarım yoluyla farklı PAM'leri tanımak için çeşitli SpCas9 varyantları tasarlanmıştır. Bununla birlikte, hayvanlarda, özellikle zebra balıklarında, SNV ile ilişkili hastalık araştırmalarında zebra balıklarının uygulanmasını sınırlayan az sayıda varyant etkilidir25,26,27,28. Son zamanlarda, SpCas9, SpG ve SpRY'nin daha az katı PAM kısıtlamalarına sahip iki varyantının (SpG için NGN ve SpRY için NNN, NRN'yi NYN'den daha yüksek bir tercihle) insan hücrelerinde ve bitkilerde yüksek düzenleme aktivitesi sergilediği bildirilmiştir 29,30,31,32. Daha sonra, SpG ve SpRY'nin yanı sıra SpRY aracılı CBE'ler ve SpRY aracılı ABE'ler gibi bir dizi aracılı temel editörünün, zebra balığı modellerinin SNV ile ilişkili hastalıkların mekanik çalışmasında ve ilaç taramasında uygulanmasını artıracakolan zebra balıklarında çalıştığı bildirilmiştir 18,33,34,35 . Ayrıca, i-Silence, ATG'den GTG'ye veya ACG36'ya ABE aracılı başlangıç kodonu dönüşümü yoluyla etkili ve doğru bir gen nakavt stratejisi olarak önerilmiştir. i-Silence stratejisi ve SpRY aracılı temel editör zSpRY-ABE8e'nin kombinasyonu, hastalık modellemesi18 için yeni bir yöntem sağlar. Bu protokol, i-Silence stratejisini kullanarak bir tsr2 (M1V) modeli oluşturmak için zebra balığında zSpRY-ABE8e kullanarak gen düzenlemenin nasıl gerçekleştirileceğini gösterir. Zebra balığı modellerinde ortaya çıkan düzenleme verimliliği ve fenotipler değerlendirilmiş ve analiz edilmiştir.

Protokol

Bu çalışma, Güney Çin Normal Üniversitesi Bakım ve Kullanım Komitesi'nin yönergelerine sıkı sıkıya bağlı kalınarak gerçekleştirilmiştir.

1. Sentetik olarak modifiye edilmiş gRNA ve zSpRY-ABE8e mRNA'nın hazırlanması

  1. gRNA'yı önceki yayınlara göre tasarlayın37,38.
    1. zSpRY-ABE8e, NRN PAM için NYN PAM'dan daha yüksek bir tercih gösterdiğinden (burada R, A veya G ve Y, C veya T'dir)18 olduğundan, tercihen PAM dizisi olarak NRN'yi seçin. Hedef adenin nükleotidinin oldukça aktif düzenleme penceresinde olduğundan emin olun (protospacer boyunca üçüncü ila dokuzuncu nükleotid).
  2. Her iki ucunda 2′-O-metil-3′-fosforothioat (MS) ile modifiye edilmiş EasyEdit sgRNA'yı (EE gRNA) sipariş edin (Şekil 1).
    NOT: EE gRNA, RNaz içermeyen suda çözülmeli ve -80 ° C'de depolanmalıdır.
  3. zSpRY-ABE8e plazmid18'i doğrusallaştırın.
    1. 6 μg plazmidi XbaI enzimi (Malzeme Tablosu) ile 3 saat boyunca 37 ° C'de bir metal banyosunda doğrusallaştırın.
    2. DNA saflaştırma kitini kullanarak doğrusallaştırılmış plazmidi (bkz. Malzeme Tablosu) üreticinin talimatlarına göre saflaştırın.
  4. In vitro transkripsiyon kitini kullanarak mRNA'yı transkripte edin (Malzeme Tablosu).
    1. zSpRY-ABE8e mRNA'yı, üreticinin talimatlarına göre şablon olarak doğrusallaştırılmış plazmid ile transkripte edin.
      NOT: mRNA ve gRNA içeren tüm operasyonlar RNaz içermeyen laboratuvar malzemelerinin kullanılmasını gerektirir.
  5. mRNA'yı üreticinin talimatlarına göre saflaştırmak için RNA saflaştırma kitini (Malzeme Tablosu) kullanın.
    NOT: Sitotoksisiteyi önlemek için etanol salınımdan önce kurutulmalı ve mRNA hemen kullanılmazsa -80 ° C'de saklanmalıdır.

2. Mikroenjeksiyon cam kılcal damarların hazırlanması

  1. Mikropipet çektirme sistemini kurun ve en az 30 dakika önceden ısıtın.
  2. Borosilikat cam kılcal damarları (1 mm dış çap ve 0,58 mm iç çaplı) üreticinin talimatlarına göre eritmek için gereken ısı değerini belirlemek için bir rampa testi yapın.
  3. Bir program seçin ve parametre değerlerini girmek için klavyedeki sayıya tıklayın. Cam kılcal damarları çekmek için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: ısı = rampa test değeri, çekme = 50, hız = 100, zaman = 50 ve basınç = 30.
  4. Kılcal boruyu olukta olduğundan emin olarak takın. Programı çalıştırmak için PULL START/STOP tuşuna basın.
  5. Çekilen kılcal damarları, boşluklar içeren köpüğe yerleştirerek ve iğneyi asılı tutarak koruyun.

3. zSpRY-ABE8e mRNA ve EE gRNA karışımının zebra balığı embriyolarına mikroenjeksiyonu

  1. Enjeksiyondan önceki gece üreme tankları kurun. Bir bölücü yerleştirin, her tanka iki dişi ve bir erkek AB suşu zebra balığı (3-18 aylık) yerleştirin ve kapakla örtün. Cinsiyet ayrımları için önceki yayınlara bakınız39.
    NOT: Daha fazla embriyo elde etmek için, en az 1 haftadır üremeyen balıkları seçin.
  2. Enjeksiyondan önceki ertesi sabah, zSpRY-ABE8e mRNA ve EE gRNA'yı buz üzerinde çözün. mRNA ve gRNA'yı sırasıyla 400 ng / μL ve 200 ng / μL'lik nihai konsantrasyonlara karıştırın.
    1. RNase içermeyen uçlar ve tüpler kullanarak tüm prosedürü buz üzerinde gerçekleştirin ve eldivenlerle kullanın.
  3. Pnömatik mikroenjektörünü yapılandırın. Hava pompasının kısmi basınç valfini kapatın ve önce ana valfi açın, gaz silindirini sökün ve kısmi basınç valfinin basıncını 0,2 MPa / 29 psi'ye ayarlayın.
    1. Pnömatik mikroenjektörü açın, modu TIMER olarak ayarlayın ve başlangıç parametresi basınç değerini 20,0 psi ve TIMER değerini 0,040 s olarak ayarlayın.
  4. Çekilen cam kılcal damarların iğnelerini stereomikroskop altında dikkatlice kırmak için ince forseps kullanın, iğnelerin koryonun ve yumurtanın delinmesini kolaylaştırmak için bir açıyla kesildiğinden emin olun.
    NOT: İğnenin kırılma noktasının doğru yerde olması ve yumurtayı delecek kadar güçlü, ancak yumurtaya verilen zararı en aza indirecek kadar ince olması gerekir.
  5. zSpRY-ABE8e mRNA ve gRNA karışımını, kılcal damardaki kabarcıkları önleyerek bir mikroyükleyici pipet ucu kullanarak cam kılcal damarın ucuna ekleyin. İğneyi mikromanipülatöre takın ve bir mikrokapak kullanılarak enjeksiyon başına 2 nL karışım üretildiğinden emin olmak için enjektörün basıncını ve TIMER değerini yapılandırın.
  6. Üreme tanklarının bölücülerini çıkarın ve balığın 10-15 dakika üremesine izin verin. Yumurtaları bir süzgeç kullanarak toplayın ve yumurtaların hücre aşamasını ve kalitesini stereomikroskop altında inceleyin. Düzenleme verimliliğini artırmak için enjeksiyon için tek hücreli durumda yumurtaları seçin.
  7. Yumurtaları% 1.5'lik bir agaroz enjeksiyon plakasına hizalayın ve düzenleme verimliliğini artırmak için karışımın 2 nL'sini mikroskop altında embriyoların sarısına değil, hücresine enjekte edin. Kontrol grubu olarak en az 15 yumurta tutun.
  8. Yumurtaları Petri kaplarında toplamak için 1x E3 tamponu kullanın ve bunları 28 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin. Ölü yumurtaları çıkarın ve döllenmeden 48 saat sonrasına (hpf) kadar her 12 saatte bir kültür tamponunu değiştirin.

4. EditR ile temel düzenlemenin verimlilik analizi

  1. 48 hpf'de, sırasıyla PCR tüplerine rastgele seçilmiş altı enjekte edilmiş embriyo ve altı rastgele seçilmiş kontrol embriyosundan oluşan üç havuz toplayın. Kalan E3 arabelleğini aspire etmek için bir pipet kullanın.
  2. PCR tüplerine 40 μL 50 mM NaOH ekleyin. Tüpleri 20 dakika boyunca 95 ° C'de metal bir banyoya koyun ve ardından 15 s boyunca girdap.
  3. 1 M Tris'in 4 μL'sini ekleyin· NaOH'yi nötralize etmek için her tüpe HCl (pH 8.0). Damlacıkları tüp duvarından çıkarmak için oda sıcaklığında 10 s boyunca 2.000 x g'de kısaca santrifüj. Süpernatantı yeni PCR tüplerine toplayın ve -20 ° C'de saklayın.
  4. gRNA hedef bölgelerinin yukarı ve aşağı yönünde uygun primerler tasarlayın. 50 μL hacimli PCR reaksiyonları için şablon olarak yukarıdaki süpernatantın 1 μL'sini kullanın. Bu çalışmada PCR için kullanılan primerler Ek Tablo 1'de listelenmiştir.
  5. Doğru ve spesifik bantları sağlamak için bir DNA agaroz jeli elektroforezi uygulayın, ardından daha önce tarif edildiği gibi Sanger dizilimi yapın40.
  6. Sanger sıralama verilerini EditR (1.0.10) programı41 ile analiz edin.
    1. Sıralama dosyasını (ab1 biçimi) ".ab1 Dosyasını Yükle" kutusuna yükleyin.
    2. 20 bp gRNA dizisini 5′-3′ oryantasyonunda "gRNA dizisini girin" kutusuna girin.
    3. Sıralama dosyasını açın (ab1 formatı) ve 20 bp gRNA dizisinin başladığı ve bittiği baz konumlarını onaylayın. "5′ start" ve "3′ end" kutularına karşılık gelen taban konumunu girin.
    4. Temel düzenleme verimliliğini elde etmek için Tahmini Düzenleme'ye tıklayın. Düzensiz zirveleri veya indelleri önlemek için gRNA hedef dizisinin yakınındaki dizileme verilerinin kalitesini kontrol edin.
      NOT: Genel olarak, düzensiz pikler PCR tavlama sıcaklığı ayarlanarak etkili bir şekilde giderilebilir.

Sonuçlar

TSR2 mutasyonunun Diamond Blackfan anemisine (DBA) neden olduğu bildirilmiştir42. Burada, i-Silence stratejisi kullanılarak tsr2 (M1V) mutasyonu ile bir DBA zebra balığı modeli oluşturuldu. Zebra balığı tsr2'nin başlangıç kodonunun adenini, zSpRY-ABE8e kullanılarak başarıyla guanin'e dönüştürüldü (Şekil 3).

Sanger dizileme sonuçlarının EditR analizi, tsr2 başlangıç kodonunun a...

Tartışmalar

Bu protokol, zSpRY-ABE8e temel editörünü kullanarak bir zebra balığı hastalık modelinin oluşturulmasını açıklar. Temel değiştirme için geleneksel HDR yolu ile karşılaştırıldığında, bu protokol daha verimli temel düzenleme sağlayabilir ve indel oluşumunu azaltabilir. Aynı zamanda, bu protokol zebra balıklarında yakın zamanda önerilen i-Silence gen nakavt stratejisinin uygulanmasını içerir. Birlikte ele alındığında, zSpRY-ABE8e, zebra balığı modellerinin hastalık araştırmalarınd...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Liwen Bianji'den (Edanz) Dr. Barbara Garbers'a bu el yazmasının taslağının İngilizce metnini düzenlediği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Guangdong Eyaleti Anahtar Alan Araştırma ve Geliştirme Programı (2019B030335001), Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2019YFE0106700), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32070819, 31970782) ve Guangdong Eyaleti Sucul Ekonomik Hayvanlar için Patojenik Biyoloji ve Epidemiyoloji Anahtar Laboratuvarı Araştırma Fonu Programı (PBEA2020YB05) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA95391.5% Agarose used to make an injection plate
Borosilicate Glass Capillaries Harvard ApparatusBS4 30-0016
Cell culture dishes Falcon351029
ClonExpress Ultra One Step Cloning KitVazymeC115Kit for Infusion clone 
Codon optimization serviceSangon Biotech
Drummond MicrocapsDrummond MicrocapsP1299-1PAKLength:32 mm, capacity:0.5 μL
EasyEdit gRNA serviceGenScript
Fine ForcepsFine Scientific Instrument11254-20Used to break meedle
Flaming/Brown Micropipette Puller Stutter InstrumentP-97Used to pull the glass capillaries
HotStart Taq PCR StarMixGenstarA033-101Used for PCR reaction
Intelligent artificial climate boxTENLINPRX-1000AUsed to culture zebrafish embryos
MethylcelluloseSigma-AldrichM0512Used to fix zebrafish when photographing
Microloader pipette tips Eppendorf5242956003
mMACHINE kit 
Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2VazymeC214-01Kit for site-directed mutagenesis
Pneumatic MicroinjectorZGene BiotechZGPCP-1500 PLUS
pT3TS-zSpCas9Addgene46757
RNeasy FFPE kit Qiagen73504Kit for RNA purification
Sanger Sequencing serviceSangon Biotech
Sodium hydroxide, granularSangonA100173-0500NaOH used for genome extraction
Stereo MicroscopeOlympus SZX10Used for photograph of phenotype
SZ Series Zoom Stereo MicroscopeCNOPTECSZ650
T3 mMESSAGEAmbionAM1348Kit for in vitro transcription 
TIANprep Mini Plasmid KitTIANGENDP103-03Kit for plasmid extraction kit
TIANquick Mini Purification KitTIANGENDP203-02Kit for purification for linearized plasmid
TricaineSigma-AldrichE10521Used to anesthetize zebrafish
Tris (hydroxymethyl) aminomethaneSangonA600194-0500Component of Tris·HCl used for genome extraction
XbaINew England BiolabsR0145SRestriction endonuclease used for plasmid linearization

Referanslar

  1. Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
  2. Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
  3. Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
  4. Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
  5. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  6. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  7. Nishida, K., et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 353 (6305), (2016).
  8. Gaudelli, N. M., et al. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).
  9. Liu, Z., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nature Communications. 9, 2717 (2018).
  10. Levy, J. M., et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).
  11. Liu, Z., et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nature Communications. 9, 2338 (2018).
  12. Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).
  13. Qin, W., et al. Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome. BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).
  14. Tanaka, S., et al. In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. Scientific Reports. 8, 11423 (2018).
  15. Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish. Cells. 9 (7), 1690 (2020).
  16. Zhang, Y., et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 8, 118 (2017).
  17. Rosello, M., et al. Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish. eLife. 10, 65552 (2021).
  18. Liang, F., et al. SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish. Nature Communications. 13, 3421 (2022).
  19. Qin, W., Lu, X., Lin, S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system. Methods. 150, 19-23 (2018).
  20. Feng, Y., et al. Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9. G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).
  21. Liu, Y., et al. Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM. Cells. 10 (8), 2099 (2021).
  22. Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
  23. Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).
  24. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  25. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  26. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  27. Endo, M., et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants. 5, 14-17 (2019).
  28. Li, J., et al. Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility. Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).
  29. Ren, Q., et al. PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox. Nature Plants. 7, 25-33 (2021).
  30. Xu, Z., et al. SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition. Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).
  31. Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. 368 (6488), 290-296 (2020).
  32. Li, J., et al. Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).
  33. Vicencio, J., et al. Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. Nature Communications. 13, 2601 (2022).
  34. Rosello, M., et al. Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo. Nature Communications. 13, 3435 (2022).
  35. Cornean, A., et al. Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction. eLife. 11, 72124 (2022).
  36. Wang, X., et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).
  37. Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
  38. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  39. Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
  40. Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
  41. Kluesner, M. G., et al. EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing. The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).
  42. Gripp, K. W., et al. Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28. American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).
  43. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  44. Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
  45. Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geri ekmeSay 192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır