zSpRY-ABE8e를 사용한 인간 유전 질환의 Zebrafish 모델링을 위한 효율적인 PAM 없는 염기 편집

요약

이 프로토콜은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 정확한 제브라피쉬 질병 모델을 구성하기 위해 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌 염기 편집을 수행하는 방법을 설명합니다.

초록

CRISPR/Cas9 기술은 인간 유전 질환 모델링, 질병 발병기전 연구 및 약물 스크리닝을 위한 제브라피쉬의 가치를 높였지만, 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)로 인한 인간 유전 질환의 정확한 동물 모델을 만드는 데 있어 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 한계가 주요 장애물입니다. 지금까지 광범위한 PAM 호환성을 가진 일부 SpCas9 변종은 제브라피쉬에서 효율성을 보여주었습니다. 최적화된 SpRY 매개 아데닌 염기 편집기(ABE), zSpRY-ABE8e 및 합성 변형 gRNA를 제브라피쉬에 적용하면 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌-구아닌 염기 전환이 가능해졌습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 제브라피쉬에서 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌 염기 편집을 위한 프로토콜입니다. zSpRY-ABE8e mRNA와 합성 변형 gRNA의 혼합물을 제브라피쉬 배아에 주입하여 TSR2 리보솜 성숙 인자(tsr2)의 병원성 부위를 시뮬레이션하는 정확한 돌연변이로 제브라피쉬 질병 모델을 구성했습니다. 이 방법은 질병 메커니즘 및 치료법을 연구하기 위한 정확한 질병 모델을 확립하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

서문

미스센스 또는 넌센스 돌연변이를 유발하는 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)는 인간 게놈¹에서 가장 흔한 돌연변이 원인입니다. 특정 SNV가 병원성인지 여부를 확인하고 발병기전을 밝히기 위해서는 정확한 동물모델이 필요하다². 제브라피쉬는 인간과 높은 수준의 생리적, 유전적 상동성, 짧은 발달 주기, 강력한 생식 능력을 나타내는 우수한 인간 질병 모델로, 병원성 특성 및 메커니즘에 대한 연구와 약물 스크리닝에 유리합니다³.

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 시스템은 제브라피시⁴를 포함한 다양한 종의 게놈 편집에 널리 적용되었습니다. gRNA 유도를 통해 CRISPR/Cas9 시스템은 표적 부위에서 DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 생성할 수 있으며, 이는 상동성 지향 복구(HDR) 경로를 통해 표적 부위와 기증자 DNA 템플릿의 재조합을 통해 단일 염기 치환을 가능하게 합니다. 그러나, 이 염기 치환 방법의 효율은 매우 낮은데, 이는 세포 DNA 복구 과정이 주로 삽입 ....

프로토콜

본 연구는 화남사범대학 관리이용위원회의 지침을 엄격히 준수하여 수행되었다.

1. 합성 변형 gRNA 및 zSpRY-ABE8e mRNA 제조

1. 이전 간행물^37,38에 따라 gRNA를 설계합니다.
   1. zSpRY-ABE8e가 NYN PAM보다 NRN PAM에 대해 더 높은 선호도를 나타내므로(여기서, R은 A 또는 G이고, Y는 C 또는 T임)¹⁸, PAM 서열로서 NRN을 우선적으로 선택한다. 타겟 아데닌 뉴클레오티드가 고활성 편집 창(protospacer를 따라 세 번째에서 아홉 번째 뉴클레오티드)에 있는지 확인합니다.
2. 양쪽 끝에서 2′-O-메틸-3′-포스포로티오에이트(MS)로 변형된 EasyEdit sgRNA(EE gRNA)를 주문합니다(그림 1).
   참고: EE gRNA는 RNase가 없는 물에 용해되어 -80°C에서 보관해야 합니다.
3. zSpRY-ABE8e 플라스미드¹⁸을 선형화합니다.....

결과

TSR2의 돌연변이는 다이아몬드 블랙팬 빈혈(DBA)을 유발하는 것으로 보고되었습니다⁴². 여기에서 DBA 제브라피쉬 모델은 i-Silence 전략을 사용하여 tsr2(M1V) 돌연변이로 구성되었습니다. 제브라피쉬 tsr2의 시작 코돈의 아데닌은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 성공적으로 구아닌으로 전환되었습니다(그림 3).

Sanger 염기서열 분석 결?.......

토론

이 프로토콜은 기본 편집기 zSpRY-ABE8e를 사용하여 제브라피쉬 질병 모델을 구성하는 방법을 설명합니다. 염기 치환을 위한 기존 HDR 경로와 비교할 때 이 프로토콜은 보다 효율적인 염기 편집을 달성하고 인델 발생을 줄일 수 있습니다. 동시에, 이 프로토콜은 제브라피쉬에서 최근에 제안된 i-Silence 유전자 녹아웃 전략을 구현하는 것을 포함합니다. 종합하면, zSpRY-ABE8e는 질병 연구에서 제브라피쉬 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	1.5% Agarose used to make an injection plate
Borosilicate Glass Capillaries	Harvard Apparatus	BS4 30-0016
Cell culture dishes	Falcon	351029
ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit	Vazyme	C115	Kit for Infusion clone
Codon optimization service	Sangon Biotech
Drummond Microcaps	Drummond Microcaps	P1299-1PAK	Length:32 mm, capacity:0.5 μL
EasyEdit gRNA service	GenScript
Fine Forceps	Fine Scientific Instrument	11254-20	Used to break meedle
Flaming/Brown Micropipette Puller	Stutter Instrument	P-97	Used to pull the glass capillaries
HotStart Taq PCR StarMix	Genstar	A033-101	Used for PCR reaction
Intelligent artificial climate box	TENLIN	PRX-1000A	Used to culture zebrafish embryos
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512	Used to fix zebrafish when photographing
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
mMACHINE kit
Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2	Vazyme	C214-01	Kit for site-directed mutagenesis
Pneumatic Microinjector	ZGene Biotech	ZGPCP-1500 PLUS
pT3TS-zSpCas9	Addgene	46757
RNeasy FFPE kit	Qiagen	73504	Kit for RNA purification
Sanger Sequencing service	Sangon Biotech
Sodium hydroxide, granular	Sangon	A100173-0500	NaOH used for genome extraction
Stereo Microscope	Olympus	SZX10	Used for photograph of phenotype
SZ Series Zoom Stereo Microscope	CNOPTEC	SZ650
T3 mMESSAGE	Ambion	AM1348	Kit for in vitro transcription
TIANprep Mini Plasmid Kit	TIANGEN	DP103-03	Kit for plasmid extraction kit
TIANquick Mini Purification Kit	TIANGEN	DP203-02	Kit for purification for linearized plasmid
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521	Used to anesthetize zebrafish
Tris (hydroxymethyl) aminomethane	Sangon	A600194-0500	Component of Tris·HCl used for genome extraction
XbaI	New England Biolabs	R0145S	Restriction endonuclease used for plasmid linearization