Edição de Base Eficiente sem PAM para Modelagem de Zebrafish de Doenças Genéticas Humanas com zSpRY-ABE8e

Resumo

Este protocolo descreve como realizar uma edição eficiente da base de adenina sem limitação de PAM para construir um modelo preciso de doença do peixe-zebra usando zSpRY-ABE8e.

Resumo

A tecnologia CRISPR/Cas9 aumentou o valor do peixe-zebra para modelar doenças genéticas humanas, estudar a patogênese de doenças e triagem de drogas, mas as limitações do motivo adjacente do protoespaçador (PAM) são um grande obstáculo para a criação de modelos animais precisos de doenças genéticas humanas causadas por variantes de nucleotídeo único (SNVs). Até agora, algumas variantes SpCas9 com ampla compatibilidade PAM mostraram eficiência em peixes-zebra. A aplicação do editor de base de adenina (ABE) otimizado mediado por SpRY, zSpRY-ABE8e, e gRNA modificado sinteticamente em zebrafish permitiu uma conversão eficiente da base adenina-guanina sem restrição de PAM. Descrito aqui é um protocolo para edição eficiente de base de adenina sem limitação de PAM em zebrafish usando zSpRY-ABE8e. Injetando uma mistura de mRNA zSpRY-ABE8e e gRNA sinteticamente modificado em embriões de zebrafish, um modelo de doença do peixe-zebra foi construído com uma mutação precisa que simulou um sítio patogênico do fator de maturação do ribossomo TSR2 (tsr2). Este método fornece uma ferramenta valiosa para o estabelecimento de modelos de doença precisos para o estudo de mecanismos e tratamentos de doenças.

Introdução

Variantes de nucleotídeo único (SNVs) que causam mutações missense ou nonsense são a fonte mais comum de mutações no genoma humano¹. Para determinar se um determinado SNV é patogênico e esclarecer sua patogênese, modelos animais precisos são necessários². Os peixes-zebra são bons modelos de doenças humanas, exibindo um alto grau de homologia fisiológica e genética com humanos, um ciclo de desenvolvimento curto e forte capacidade reprodutiva, o que é vantajoso para pesquisas de características e mecanismos patogênicos, bem como triagem de drogas³.

O sistema CRISPR/Cas9 t....

Protocolo

Este estudo foi conduzido em estrita conformidade com as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso da Universidade Normal do Sul da China.

1. Preparação de gRNA sinteticamente modificado e mRNA zSpRY-ABE8e

1. Projetar o gRNA de acordo com publicações anteriores^37,38.
   1. Selecione preferencialmente NRN como a sequência PAM, pois zSpRY-ABE8e mostra uma preferência maior por NRN PAM do que NYN PAM (onde R é A ou G, e Y é C ou T)¹⁸. Certifique-se de que o nucleotídeo de adenina alvo esteja na janela de edição altamente ativa (terceiro ao ....

Resultados

A mutação do TSR2 tem sido relatada como causadora da anemia de Diamond Blackfan (DBA)⁴². Aqui, um modelo de zebrafish DBA foi construído com uma mutação tsr2 (M1V) usando a estratégia i-Silence. A adenina do códon inicial do zebrafish tsr2 foi convertida com sucesso em guanina usando zSpRY-ABE8e (Figura 3).

A análise EditR dos resultados do sequenciamento de Sanger mostrou que havia uma sobreposição A/G.......

Discussão

Este protocolo descreve a construção de um modelo de doença do zebrafish usando o editor base zSpRY-ABE8e. Em comparação com o caminho HDR tradicional para substituição de base, este protocolo pode alcançar uma edição de base mais eficiente e reduzir a ocorrência de indels. Ao mesmo tempo, este protocolo envolve a implementação da estratégia recentemente proposta de nocaute genético i-Silence em peixes-zebra. Em conjunto, o zSpRY-ABE8e aumentará a aplicação de modelos de peixe-zebra na pesquisa de doen?.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	1.5% Agarose used to make an injection plate
Borosilicate Glass Capillaries	Harvard Apparatus	BS4 30-0016
Cell culture dishes	Falcon	351029
ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit	Vazyme	C115	Kit for Infusion clone
Codon optimization service	Sangon Biotech
Drummond Microcaps	Drummond Microcaps	P1299-1PAK	Length:32 mm, capacity:0.5 μL
EasyEdit gRNA service	GenScript
Fine Forceps	Fine Scientific Instrument	11254-20	Used to break meedle
Flaming/Brown Micropipette Puller	Stutter Instrument	P-97	Used to pull the glass capillaries
HotStart Taq PCR StarMix	Genstar	A033-101	Used for PCR reaction
Intelligent artificial climate box	TENLIN	PRX-1000A	Used to culture zebrafish embryos
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512	Used to fix zebrafish when photographing
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
mMACHINE kit
Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2	Vazyme	C214-01	Kit for site-directed mutagenesis
Pneumatic Microinjector	ZGene Biotech	ZGPCP-1500 PLUS
pT3TS-zSpCas9	Addgene	46757
RNeasy FFPE kit	Qiagen	73504	Kit for RNA purification
Sanger Sequencing service	Sangon Biotech
Sodium hydroxide, granular	Sangon	A100173-0500	NaOH used for genome extraction
Stereo Microscope	Olympus	SZX10	Used for photograph of phenotype
SZ Series Zoom Stereo Microscope	CNOPTEC	SZ650
T3 mMESSAGE	Ambion	AM1348	Kit for in vitro transcription
TIANprep Mini Plasmid Kit	TIANGEN	DP103-03	Kit for plasmid extraction kit
TIANquick Mini Purification Kit	TIANGEN	DP203-02	Kit for purification for linearized plasmid
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521	Used to anesthetize zebrafish
Tris (hydroxymethyl) aminomethane	Sangon	A600194-0500	Component of Tris·HCl used for genome extraction
XbaI	New England Biolabs	R0145S	Restriction endonuclease used for plasmid linearization