Yaşlı Farelerde İnme Sonuçlarını İncelemek için Modifiye Transkraniyal Orta Serebral Arter Oklüzyon Modeli

Özet

Bu protokol, orta büyüklükte bir enfarktüse ve mükemmel bir hayatta kalma oranına sahip benzersiz bir fare vuruşu modeli gösterir. Bu model, klinik öncesi inme araştırmacılarının iskemi süresini uzatmasına, yaşlı fareleri kullanmasına ve uzun vadeli fonksiyonel sonuçları değerlendirmesine olanak tanır.

Özet

Deneysel inme araştırmalarında, farelerde iskemik inmeyi modellemek için intraluminal filamentli orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) yaygın olarak kullanılmaktadır. Filament MCAO modeli tipik olarak, C57Bl / 6 farelerinde, bazen posterior serebral arter tarafından sağlanan bölgede beyin dokusunu içeren büyük bir serebral enfarktüs sergiler, bu da büyük ölçüde posterior komünikan arter atrezisinin yüksek insidansına bağlıdır. Bu fenomenin, filament MCAO'dan sonra uzun süreli inme iyileşmesi sırasında C57Bl / 6 farelerinde gözlenen yüksek ölüm oranına önemli bir katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Bu nedenle, birçok kronik inme çalışması distal MCAO modellerinden yararlanmaktadır. Bununla birlikte, bu modeller genellikle sadece korteks bölgesinde enfarktüs üretir ve sonuç olarak, inme sonrası nörolojik defisitlerin değerlendirilmesi zor olabilir. Bu çalışma, gövdedeki MCA'nın küçük bir kraniyal pencere yoluyla kalıcı veya geçici olarak kısmen tıkandığı modifiye edilmiş bir transkraniyal MCAO modeli oluşturmuştur. Oklüzyon yeri MCA'nın orijinine nispeten yakın olduğundan, bu model hem kortekste hem de striatumda beyin hasarı oluşturur. Bu modelin kapsamlı karakterizasyonu, yaşlı farelerde bile mükemmel bir uzun süreli sağkalım oranının yanı sıra kolayca tespit edilebilen nörolojik defisitler göstermiştir. Bu nedenle, burada açıklanan MCAO fare modeli, deneysel inme araştırması için değerli bir araçtır.

Giriş

ABD'de her yıl yaklaşık 800.000 kişi felç geçirmektedir ve bu felçlerin çoğu doğası gereği iskemiktir¹. Doku plazminojen aktivatörü (tPA) ve/veya trombektomi ile serebral kan akışının zamanında restorasyonu şu anda inme hastaları için en etkili tedavidir; Bununla birlikte, uzun dönemde nörolojik fonksiyonların tam olarak iyileşmesi nadirdir ^2,3. Bu nedenle, fonksiyonel iyileşmeyi hedefleyen yeni inme tedavisinin araştırılması, klinik olarak ilgili hayvan inme modellerini gerektiren yoğun bir araştırma alanıdır.

Kemirgenlerde en sık görülen iskemik inme modeli, inmeyi indüklemek için intraluminal orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) kullanır. İlk olarak 1989 yılında Zea Longa tarafından geliştirilen bu modelde, orta serebral artere (MCA) kan akışını engellemek için internal karotis artere (ICA) bir naylon filament ^sokulur4. Ancak, bu modelin sınırlamaları vardır. İlk olarak, filament ICA'ya yerleştirildiğinde, posterior serebral artere (PCA) giden kan akışı, özellikle farelerde kısmen bloke edilebilir. Kritik olarak, ön ve arka serebral dolaşımı birbirine bağlayan küçük bir arter olan posterior komünikan arter (PcomA), ağırlıklı olarak deneysel inme araştırmalarında kullanılan suş olan C57Bl / 6 gibi bazı fare suşlarında sıklıkla az gelişmiştir. PcomA'nın bu açıklığının, inme^5'ten sonra farelerde lezyon boyutundaki değişkenliğe katkıda bulunduğuna inanılmaktadır. Gerçekten de, PCA'ya kan akışı MCAO sırasında hızla düştüğünde ve PcomA yeterli kollateral kan akışı sağlayamadığında, inme enfarktüsü PCA'nın topraklarına genişleyebilir. Ayrıca, bu modelde, uzun süreli iskemi farelerde daha yüksek ölüm şansına yol açar. Sonuç olarak, farelerde tipik olarak 30-60 dakikalık kısa bir MCAO süresi kullanılır. Bununla birlikte, çoğu inme hastası reperfüzyon tedavisinden önce birkaç saat iskemi yaşar. Bu nedenle, uzun süreli iskemiye sahip bir fare vuruşu modeli yüksek klinik öneme sahiptir.

Bu prosedürün genel amacı, orta büyüklükte bir enfarktüse ve mükemmel bir sağkalım oranına sahip farelerde iskemik inmeyi modellemektir. Bu transkraniyal MCAO modeli, uzun süreli iskemi uygulanabildiğinden ve yaşlı fareler bu modeli iyi tolere ederek fonksiyonel iyileşmenin uzun vadeli değerlendirmesine izin verdiğinden, klinik inmenin kritik özelliklerini ele almaktadır.

Protokol

Bu çalışmada açıklanan tüm prosedürler, araştırmada hayvanların bakımı ve kullanımı için NIH yönergelerine uygun olarak yürütülür ve protokol, Duke Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma için genç (8-10 haftalık) ve yaşlı (22 aylık) erkek C57Bl/6 fareler kullanıldı. Bu protokole genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmektedir.

1. Cerrahi hazırlık

1. Fareyi büyük anormallikler ve davranışsal eksiklikler açısından inceleyin.
   NOT: Ameliyattan önce cerrahların cerrahi maske, bone, eldiven ve önlük dahil olmak üzere uygun KKD (koruyucu kişisel ekipman) giymeleri önemlidir.
2. Fareyi tartın; ventilatörü vücut ağırlığına göre programlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
3. Fareyi anestezi indüksiyon kutusunda 4 inç x 4 inç x 7 içine yerleştirin. 30'a ayarlanmış oksijen akış ölçeri ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 70'e ayarlanmış azot oksit akış ölçeri açın. Buharlaştırıcıyı% 5 izofluran ile açın.
4. Kılavuz teli 20 G intravenöz (IV) katetere yerleştirin.
5. Solunum hızı dakikada 30-40 nefese düştüğünde fareyi indüksiyon kutusundan çıkarın.
6. Fareyi sırtüstü pozisyonda cerrahi tezgahın üzerine yatırın. Farenin dilini dışarı çekin ve sol elin parmaklarıyla tutun. Ses telini görselleştirmek için hayvanın ağzına bir laringoskop (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
7. Sağ orta parmağınızı kullanarak fare çenesini laringoskop üzerinde sabitleyin. 20 G IV kateteri tutmak için sol elinizi serbest bırakın.
8. Kılavuz teli ses telinin içine hafifçe yerleştirin ve ardından 20 G IV kateteri kateterin kanat kısmı burun ucuyla aynı seviyeye gelene kadar yavaşça trakeaya itin.
   NOT: Fare hareket ediyorsa, kabloyu takmayın. Bu, soluk borusunda travmaya ve kanamaya neden olabilir.
9. Ventilatörü açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve farede entübe edilmiş 20 G IV kateter ile bağlayın. İzofluranı% 1.5'e düşürün ve her iki akciğerin de mekanik olarak havalandırıldığından emin olun.
   NOT: İzofluran konsantrasyonunu azaltmayı unutmayın. Aksi takdirde, fare aşırı dozda anestezi alacaktır.
10. Her iki göze göz merhemi sürün ve deri altına 5 mg/kg carprofen enjekte edin.
11. Fareyi sağ şakak bölgesi yukarı bakacak şekilde yanal konumda tutun. Bir ısıtma yastığı (35 °C) ve bir sıcaklık regülatörü tarafından kontrol edilen bir ısı lambası kullanarak rektal sıcaklığı 37 ° C'de tutun (bkz.
12. Sağ göz ve kulak arasındaki yüzey alanını tıraş edin ve cerrahi bölgeyi iyot ve alkollü çubuklarla en az üç kez dezenfekte edin.

2. MCAO ameliyatı

1. MCAO ameliyatı için steril alet paketini açın. Steril eldiven giyin ve cerrahi makas kullanarak sağ göz ile sağ kulak arasında 1 cm'lik bir cilt kesisi yapın.
   NOT: Her 15 dakikada bir cilt rengini, vücut ısısını ve ayak parmağını sıkıştırmaya verilen tepkiyi izleyin.
2. Temporal ve masseter kaslarını ortaya çıkarmak için alttaki fasyayı forseps ile inceleyin.
   NOT: Parotis bezine zarar vermemeye dikkat edin.
3. Temporal kasın alt kısmına dokunmak ve elmacık kemerinin yerini tespit etmek için forseps kullanın. Fasiyal sinirin dallarını dikkatlice kenara çekin.
4. Temporal kas üzerinde 5 mm'lik enine bir kesi kesmek için yüksek sıcaklıktaki bir koter halkasının ucunu kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).
5. Altta yatan elmacık kemerini incelemek ve maksilla ile elmacık kemikleri arasındaki eklemi ortaya çıkarmak için iki forseps kullanın.
6. Elmacık kemerinin 3 mm'lik bir kısmını kesmek için makas kullanın ve çıkarın. Masseter kasını kafa tabanından ayırın.
   NOT: Retroorbital sinüs ve yüzeyel temporal veni kırmamaya dikkat edin.
7. Trigeminal sinir dalları bir ekartör tarafından yanal olarak çekilecek şekilde, kraniyal kafatası tabanını ortaya çıkarmak için farklı yönlerde konumlandırılmış dört küçük ekartör uygulayın.
   NOT: Kraniyal tabanın dış yüzeyindeki bir sulkus, frontal ve temporal loblar arasındaki lateral fissürün yerini gösterir. MCA burada yatar (Şekil 2A) ve gövdesi ve dalları ince, şeffaf kafatasından görülebilir (Şekil 2B). Bu arterin diğer majör serebral arterlerle ilişkisi Şekil 2A'da gösterilmektedir.
8. MCA gövdesinin üzerindeki kafatasına ve rinal korteksin dalına proksimalde% 0.9 normal salin damlası uygulayın. Küçük bir kırık görünene kadar kafatasını inceltmek için elektrikli bir öğütücü kullanın.
   NOT: Kafatasına nüfuz edebileceğinden ve alttaki artere zarar verebileceğinden öğütücüyü kafatasına doğru itmeyin.
9. İnceltilmiş kafatasını kaldırmak ve çıkarmak için forsepsin ucunu kullanın. Sahte fareler için burada durun ve arteri bağlamayın.
   NOT: MCA gövdesi boyunca küçük bir dikdörtgen pencere oluşturulmuştur.
10. MCA'nın üzerine tek iplikli siyah örgülü ipek bir halka yerleştirin (Şekil 2C). 8-0 ekleyin MCA gövdesini kaldırmak için mikrocerrahi iğne ve iğnenin her iki ucunu ipek iplik ilmek düğümünün üstünde bırakarak dikişi (bkz. Malzeme Tablosu) iğnenin altına bağlayın (Şekil 2D).
11. Geçici MCAO için, MCAO başlangıcını temsil eden arteriyel kan akışını engellemek için ipek iplik düğümünü iğnenin altında hafifçe sıkın (Şekil 2E).
12. Sütürü tutmak için forseps kullanın ve iskeminin sonunda iğneyi yavaşça çıkarın (ör., 60 dakika veya daha uzun).
    NOT: İğne çıkarıldığında, ipek iplik düğümü MCA'dan kaydırılır ve beyin yeniden perfüze edilir (Şekil 2F).
13. Kalıcı MCAO için, atardamarın etrafındaki ipek iplik halkasını sıkıca sıkın ve iğneyi çıkarın. Fazla dikiş malzemelerini kesin ve çıkarın.
14. Cilt kesisine %0.25'lik bir damla bupivakain uygulayın ve aralıklı olarak 6-0 naylon sütür kullanarak kas ve cildi ayrı ayrı dikin (bkz. Cilt kesisinin yüzeyine antibiyotik merhem sürün.
    NOT: Cilt kesisi steril zımba veya yapıştırıcı ile de kapatılabilir.

3. Ameliyat sonrası bakım

1. Fareyi uyandırmak için izofluranı kapatın. Spontan solunum geri geldiğinde ventilatörün bağlantısını kesin.
2. Fareyi kontrollü bir sıcaklığa sahip bir kurtarma odasına ( Malzeme Tablosuna bakın) aktarın.
3. Fareyi doğrultma refleksi geri geldiğinde veya hareket etmeye başladığında ekstübe edin.
4. Fareyi sıcaklık ve nem kontrollü bir odada yakından izleyin. Tam bilinç kazandıktan sonra fareyi ev kafesine geri koyun (iyileşme süresi ~ 2 saat). 3 gün boyunca günde 5 mg / kg Carprofen'i deri altından uygulayın.

4. Lazer benek kontrast görüntüleme (LSCI)

1. MCAO'dan altı ve 24 saat sonra, anestezi uygulanmış fareyi stereotaksik çerçeveye monte edin. Başın üstünü tıraş edin ve üç alternatif iyot ve alkol çubuğuyla temizleyin.
   NOT: Anestezi, adım 1.3'te belirtildiği gibi gerçekleştirildi. LSCI, MCAO'dan önce de yapılır.
2. 3 cm'lik bir orta hat cilt kesisi yapın ve cildi kafatasından diseke edin. Kafatasının üst kısmını ortaya çıkarmak için dört küçük iğne ekartörü uygulayın.
3. Lazer benekli kamerayı ( Malzeme Tablosuna bakın) başın üzerine getirin ve kameranın odağını ayarlayın. Serebral kan akışını görüntüleyin.

5. 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür (TTC) boyama

1. Deneyin sonunda, tipik olarak inmeden sonraki 1, 3 veya 28. günlerde% 5 izofluran ile fareyi derinlemesine uyuşturun. Ağrı tepkisi olmadığından emin olmak için kuyruğu sıkıştırın.
2. Cerrahi bir makas kullanarak farenin kafasını kesin ve beyni toplayın. Beyni buz gibi tuzlu suda 20 dakika inkübe edin.
3. Beyni buz üzerinde bir beyin dilimleyici matrisine koyun ve beynin üzerine soğuk salin damlatın. İnce jilet kullanarak beyni 1 mm'lik dilimler halinde kesin.
4. Beyin dilimlerini aynı yönde% 2 TTC çözeltisi içeren bir tabağa daldırın (Malzeme Tablosuna bakınız). Çanağı karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika bekletin.
   NOT: Normal beyin dokusu kırmızılaşır ve iskemik doku beyaz kalır.
5. Beyin dilimlerini 24 saatlik fiksasyon için% 10 formaline aktarın. Beyin dilimlerini görüntüleyin ve enfarktüs alanını ölçün.

Sonuçlar

Cerrahi mikroskop altında doğrudan bir görünümle, iskemi sırasında MCA kan akışının engellendiği görsel olarak doğrulanabilir. Önceki çalışmamız, bir lazer Doppler monitörü⁶ kullanarak iskemik alanda% >80 kan akışında azalma olduğunu gösterdi. MCAO sonrası kan akımı değişikliklerini belirlemek için, iskemik hakaret ve reperfüzyonu daha fazla doğrulamak için LSCI kullanılabilir (Şekil 1). Nitekim, Şekil 3A'da, sağ

Tartışmalar

İlk transkraniyal MCA oklüzyon modeli 1981'de^{sıçanlarda kuruldu 11,12} ve ^1989'da yerini kraniektomisiz MCAO modeli^{aldı 4}. İlk transkraniyal MCA oklüzyonu, tüm elmacık arkının çıkarıldığı ve kasların lateral olarak çekildiği geniş bir cerrahi alana sahipti. Ameliyattan sonra lokal dokular şişti, bu da strese neden oldu ve hayvanlar için gıda alımını azalttı. Modifiye transkraniyal MCAO modelimizde, insizyon daha...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% bupivacaine	Hospira	NDC 0409-1159-18
0.9% sodium chloride	ICU Medical	NDC 0990-7983-03
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)	Sigma or any available vendor
20 G IV catheter	BD	381534	20 GA 1.6 IN
30 G needle	BD	305106
4-0 silk suture	Look	SP116	Black braided silk
8-0 suture with needle	Ethilon	2822G
Alcohol swabs	BD	326895
Anesthesia induction box	Any suitable vendor		Pexiglass make
Electrical grinder	JSDA	JD 700
High temperature cautery loop tip	Bovie	AA03
Isoflurane	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Laser doppler perfusion monitor	Moor Instruments	moorVMS-LDF1
Lubricant eye ointment	Bausch + Lomb	339081
Mouse rectal probe	Physitemp	RET-3
Nitrous Oxide	Airgas	UN1070
Otoscope	Welchallyn	728	2.5 mm Speculum
Oxygen	Airgas	UN1072
Povidone-iodine	CVS	955338
Recovery box	Brinsea	TLC eco
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	6100701	Injectable 50 mg/mL
Rodent ventilator	Harvard	Model 683
Temperature controller	Physitemp	TCAT-2DF
Triple antibioric & pain relief	CVS	NDC 59770-823-56
Vaporizer	RWD	R583S