Un modèle modifié d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne transcrânienne pour étudier les résultats de l’AVC chez des souris âgées

Résumé

Ce protocole démontre un modèle unique d’AVC chez la souris avec un infarctus de taille moyenne et un excellent taux de survie. Ce modèle permet aux chercheurs en AVC préclinique de prolonger la durée de l’ischémie, d’utiliser des souris âgées et d’évaluer les résultats fonctionnels à long terme.

Résumé

Dans la recherche expérimentale sur l’AVC, l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO) avec un filament intraluminal est largement utilisée pour modéliser l’AVC ischémique chez la souris. Le modèle MCAO filamentaire présente généralement un infarctus cérébral massif chez les souris C57Bl/6 qui inclut parfois du tissu cérébral dans le territoire alimenté par l’artère cérébrale postérieure, ce qui est en grande partie dû à une incidence élevée d’atrésie de l’artère communicante postérieure. Ce phénomène est considéré comme un contributeur majeur au taux de mortalité élevé observé chez les souris C57Bl/6 lors de la récupération à long terme après un MCAO filamentaire. Ainsi, de nombreuses études sur les accidents vasculaires cérébraux chroniques exploitent des modèles MCAO distals. Cependant, ces modèles ne produisent généralement un infarctus que dans la région du cortex et, par conséquent, l’évaluation des déficits neurologiques post-AVC pourrait être un défi. Cette étude a permis d’établir un modèle de MCAO transcrânien modifié dans lequel le MCA au niveau du tronc est partiellement occlus, soit de façon permanente, soit transitoirement via une petite fenêtre crânienne. Étant donné que l’emplacement de l’occlusion est relativement proche de l’origine de l’ACM, ce modèle génère des lésions cérébrales à la fois dans le cortex et le striatum. La caractérisation approfondie de ce modèle a démontré un excellent taux de survie à long terme, même chez les souris âgées, ainsi que des déficits neurologiques facilement détectables. Par conséquent, le modèle murin MCAO décrit ici représente un outil précieux pour la recherche expérimentale sur l’AVC.

Introduction

Près de 800 000 personnes subissent un accident vasculaire cérébral aux États-Unis chaque année, et la plupart de ces accidents vasculaires cérébraux sont de nature ischémique¹. La restauration rapide du flux sanguin cérébral à l’aide d’un activateur tissulaire du plasminogène (tPA) et/ou d’une thrombectomie est actuellement le traitement le plus efficace pour les patients victimes d’un AVC. Cependant, la récupération complète des fonctions neurologiques à long terme est rare ^2,3. Ainsi, la recherche d’une nouvelle thérapie de l’AVC qui cible l’amélioration fonctionnelle est un domaine de recherche intense qui nécessite des modèles animaux d’AVC cliniquement pertinents.

Le modèle d’AVC ischémique le plus courant chez les rongeurs utilise l’occlusion intraluminale de l’artère cérébrale moyenne (MCAO) pour induire un accident vasculaire cérébral. Dans ce modèle, initialement développé par Zea Longa en 1989, un filament de nylon est introduit dans l’artère carotide interne (ICA) pour bloquer le flux sanguin vers l’artère cérébrale moyenne (MCA)⁴. Cependant, ce modèle a des limites. Tout d’abord, lorsque le filament est inséré dans l’ICA, le flux sanguin vers l’artère cérébrale postérieure (ACP) peut également être partiellement bloqué, en particulier chez la souris. De manière critique, l’artère communicante postérieure (PcomA), une petite artère qui relie la circulation cérébrale antérieure et postérieure, est souvent sous-développée dans certaines souches de souris, telles que C57Bl/6, la souche principalement utilisée dans la recherche expérimentale sur les accidents vasculaires cérébraux. On pense que cette perméabilité de la PcomA contribue à la variabilité de la taille des lésions chez la souris après un accident vasculaire cérébral⁵. En effet, lorsque le flux sanguin vers l’ACP chute brusquement pendant l’ACMO, et que l’APE n’est pas en mesure de fournir un flux sanguin collatéral suffisant, l’infarctus de l’AVC peut s’étendre sur le territoire de l’ACP. De plus, dans ce modèle, une longue durée d’ischémie entraîne un risque plus élevé de mortalité chez la souris. Par conséquent, une courte durée MCAO de 30 à 60 minutes est généralement utilisée chez la souris. Cependant, la plupart des patients victimes d’un AVC éprouvent quelques heures d’ischémie avant le traitement de reperfusion. Ainsi, un modèle d’AVC chez la souris avec une durée prolongée d’ischémie est d’une grande pertinence clinique.

L’objectif global de cette procédure est de modéliser l’AVC ischémique chez des souris qui ont un infarctus de taille moyenne et un excellent taux de survie. Ce modèle MCAO transcrânien aborde les caractéristiques critiques de l’AVC clinique, car une ischémie prolongée peut être réalisée, et les souris âgées tolèrent bien ce modèle, ce qui permet d’évaluer à long terme la récupération fonctionnelle.

Protocole

Toutes les procédures décrites dans ce travail sont menées conformément aux directives du NIH pour le soin et l’utilisation des animaux dans la recherche, et le protocole a été approuvé par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Institut Duke (IACUC). De jeunes souris mâles (âgées de 8 à 10 semaines) et âgées (22 mois) C57Bl/6 ont été utilisées pour la présente étude. Un aperçu de ce protocole est illustré à la figure 1.

1. Préparation chirurgicale

1. Examinez la souris à la recherche d’anomalies grossières et de déficits comportementaux.
   REMARQUE : Avant la chirurgie, il est important que les chirurgiens portent un EPI (équipement de protection individuelle) approprié, y compris un masque chirurgical, un bonnet, des gants et une blouse.
2. Pesez la souris ; programmer le ventilateur (voir le tableau des matériaux) en fonction du poids corporel.
3. Placez la souris dans une boîte d’induction d’anesthésie de 4 po x 4 po x 7 po. Allumez le débitmètre d’oxygène (voir le tableau des matériaux), réglé sur 30, et le débitmètre de protoxyde d’azote, réglé sur 70. Allumez le vaporisateur avec 5% d’isoflurane.
4. Insérez le fil guide dans le cathéter intraveineux (IV) de 20 G.
5. Sortez la souris de la boîte à induction lorsque sa fréquence respiratoire est réduite à 30-40 respirations par minute.
6. Posez la souris sur le banc d’opération en position couchée sur le dos. Tirez la langue de la souris et tenez-la avec les doigts de la main gauche. Insérez un laryngoscope (voir le tableau des matériaux) dans la bouche de l’animal pour visualiser la corde vocale.
7. Stabilisez le menton de la souris sur le laryngoscope à l’aide du majeur droit. Libérez la main gauche pour tenir le cathéter IV de 20 G.
8. Insérez légèrement le fil-guide dans la corde vocale, puis poussez lentement le cathéter IV 20 G dans la trachée jusqu’à ce que la partie aile du cathéter soit au même niveau que l’extrémité du nez.
   REMARQUE : Si la souris est en mouvement, n’insérez pas le fil. Cela peut provoquer un traumatisme de la trachée et des saignements.
9. Allumez le ventilateur (voir le tableau des matériaux) et connectez-le au cathéter IV de 20 G intubé dans la souris. Réduisez la concentration d’isoflurane à 1,5 % et assurez-vous que les deux poumons sont ventilés mécaniquement.
   REMARQUE : N’oubliez pas de réduire la concentration d’isoflurane. Sinon, la souris recevra une surdose d’anesthésie.
10. Appliquez une pommade oculaire sur les deux yeux et injectez 5 mg/kg de carprofène par voie sous-cutanée.
11. Gardez la souris en position latérale avec la zone temporale droite vers le haut. Maintenir la température rectale à 37 °C à l’aide d’un coussin chauffant (35 °C) et d’une lampe chauffante commandée par un régulateur de température (voir tableau des matériaux).
12. Rasez la surface entre l’œil droit et l’oreille et désinfectez la zone chirurgicale au moins trois fois avec des tampons d’iode et d’alcool.

2. Chirurgie de l’ACMO

1. Ouvrez l’emballage de l’instrument stérile pour la chirurgie MCAO. Portez des gants stériles et faites une incision cutanée de 1 cm entre l’œil droit et l’oreille droite à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
   REMARQUE : Surveillez la couleur de la peau, la température corporelle et la réponse au pincement des orteils toutes les 15 minutes.
2. Disséquez le fascia sous-jacent avec une pince pour exposer les muscles temporaux et masséters.
   REMARQUE : Veillez à ne pas endommager la glande parotide.
3. Utilisez des pinces pour toucher la partie inférieure du muscle temporal et détecter l’emplacement de l’arcade zygomatique. Écartez délicatement les branches du nerf facial.
4. Utilisez l’extrémité d’une boucle de cautérisation à haute température (voir le tableau des matériaux) pour faire une incision transversale de 5 mm sur le muscle temporal.
5. Utilisez deux pinces pour disséquer l’arcade zygomatique sous-jacente et exposer l’articulation entre le maxillaire et les os zygomatiques.
6. Utilisez des ciseaux pour couper une partie de 3 mm de l’arcade zygomatique et retirez-la. Séparez le muscle masséter de la base du crâne.
   REMARQUE : Veillez à ne pas fracturer le sinus rétro-orbitaire et la veine temporale superficielle.
7. Appliquez quatre petits écarteurs positionnés dans des directions différentes pour exposer la base du crâne crânien, les branches nerveuses du trijumeau étant tirées latéralement par un écarteur.
   REMARQUE : Un sillon sur la surface externe de la base crânienne marque l’emplacement de la fissure latérale entre les lobes frontal et temporal. C’est là que se trouve l’ACM (figure 2A), et son tronc et ses branches sont visibles à travers le crâne mince et transparent (figure 2B). La relation de cette artère avec d’autres artères cérébrales majeures est illustrée à la figure 2A.
8. Appliquez une goutte de solution saline normale à 0,9 % sur le crâne au-dessus du tronc MCA et à proximité de la branche du cortex rhinal. Utilisez une meuleuse électrique pour éclaircir le crâne jusqu’à ce qu’une petite fracture soit visible.
   REMARQUE : Ne poussez pas la meuleuse contre le crâne, car elle pourrait pénétrer dans le crâne et blesser l’artère sous-jacente.
9. Utilisez la pointe de la pince pour soulever le crâne aminci et l’enlever. Pour les souris factices, arrêtez-vous ici et ne ligaturez pas l’artère.
   REMARQUE : Une petite fenêtre rectangulaire à travers le tronc MCA est formée.
10. Placez une boucle à un brin de soie tressée noire sur le dessus du MCA (Figure 2C). Insérez un 8-0 l’aiguille microchirurgicale pour soulever le tronc de l’ACM et attacher la suture (voir le tableau des matériaux) sous l’aiguille, en laissant les deux extrémités de l’aiguille sur le dessus du nœud de boucle de fil de soie (Figure 2D).
11. Dans le cas d’un MCAO transitoire, serrez légèrement le nœud de fil de soie sous l’aiguille pour bloquer le flux sanguin artériel (Figure 2E), ce qui représente l’apparition du MCAO.
12. Utilisez la pince pour maintenir la suture et retirez lentement l’aiguille à la fin de l’ischémie (p. ex., 60 minutes ou plus).
    REMARQUE : Lorsque l’aiguille est retirée, le nœud de fil de soie est retiré du MCA et le cerveau est reperfusé (Figure 2F).
13. Pour le MCAO permanent, serrez fermement la boucle de fil de soie autour de l’artère et retirez l’aiguille. Coupez et retirez l’excédent de matériaux de suture.
14. Appliquez une goutte de bupivacaïne à 0,25 % sur l’incision cutanée et suturez le muscle et la peau séparément à l’aide de sutures en nylon 6-0 par intermittence (voir le tableau des matériaux). Appliquez une pommade antibiotique à la surface de l’incision cutanée.
    REMARQUE : L’incision cutanée peut également être fermée avec des agrafes stériles ou de la colle.

3. Soins post-chirurgicaux

1. Éteignez l’isoflurane pour réveiller la souris. Débranchez le ventilateur lorsque la respiration spontanée est rétablie.
2. Transférez la souris dans une chambre de récupération (voir le tableau des matériaux) avec une température contrôlée.
3. Extubez la souris lorsque son réflexe de redressement est rétabli ou qu’elle commence à bouger.
4. Surveillez de près la souris dans une chambre à température et humidité contrôlées. Ramenez la souris dans la cage d’accueil après qu’elle ait repris conscience (période de récupération ~ 2 h). Administrer 5 mg/kg de carprofène par voie sous-cutanée par jour pendant 3 jours.

4. Imagerie par contraste de chatoiement laser (LSCI)

1. Six et 24 h après le MCAO, monter la souris anesthésiée sur le cadre stéréotaxique. Rasez le haut de la tête et nettoyez-le avec trois tampons alternés d’iode et d’alcool.
   REMARQUE : L’anesthésie a été effectuée comme mentionné à l’étape 1.3. Le LSCI est également réalisé avant le MCAO.
2. Faites une incision cutanée médiane de 3 cm et disséquez la peau du crâne. Appliquez quatre petits écarteurs d’aiguille pour exposer le sommet du crâne.
3. Déplacez la caméra laser (voir le tableau des matériaux) au-dessus de la tête et ajustez la mise au point de la caméra. Imagez le flux sanguin cérébral.

5. Coloration au chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC)

1. Anesthésiez profondément la souris avec de l’isoflurane à 5 % à la fin de l’expérience, généralement le jour 1, 3 ou 28 après l’AVC. Pincez la queue pour vous assurer qu’il n’y a pas de réponse à la douleur.
2. Décapitalisez la souris à l’aide d’un ciseau chirurgical et prélevez le cerveau. Incuber le cerveau dans une solution saline glacée pendant 20 minutes.
3. Placez le cerveau dans une matrice de tranche cérébrale sur de la glace et déposez une solution saline froide sur le cerveau. Coupez la cervelle en tranches de 1 mm à l’aide de fines lames de rasoir.
4. Plongez les tranches de cerveau dans la même orientation dans une boîte de solution à 2% TTC (voir le tableau des matériaux). Conservez le plat à l’obscurité à température ambiante pendant 15 min.
   REMARQUE : Le tissu cérébral normal devient rouge et le tissu ischémique reste blanc.
5. Transférer les tranches de cerveau à 10% de formol pendant 24 h de fixation. Imagez les coupes de cerveau et mesurez la zone de l’infarctus.

Résultats

Avec une vue directe sous un microscope chirurgical, il peut être confirmé visuellement que le flux sanguin MCA est bloqué pendant l’ischémie. Notre étude précédente a montré une réduction de >80% du flux sanguin dans la zone ischémique à l’aide d’un moniteur laser Doppler⁶. Afin de déterminer les changements de débit sanguin post-MCAO, le LSCI peut être utilisé pour confirmer davantage l’agression ischémique et la reperfusion (Figure 1). En ef...

Discussion

Le premier modèle d’occlusion MCA transcrânienne a été établi chez le rat en 1981 11,12^, et remplacé par le modèle MCAO sans craniectomie en^{1989 4}. L’occlusion transcrânienne initiale de l’ACM avait un large champ chirurgical, de sorte que l’ensemble de l’arcade zygomatique a été retiré et les muscles tirés latéralement. Les tissus locaux ont été enflés après la chirurgie, ce qui a causé du stress et une diminut...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% bupivacaine	Hospira	NDC 0409-1159-18
0.9% sodium chloride	ICU Medical	NDC 0990-7983-03
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)	Sigma or any available vendor
20 G IV catheter	BD	381534	20 GA 1.6 IN
30 G needle	BD	305106
4-0 silk suture	Look	SP116	Black braided silk
8-0 suture with needle	Ethilon	2822G
Alcohol swabs	BD	326895
Anesthesia induction box	Any suitable vendor		Pexiglass make
Electrical grinder	JSDA	JD 700
High temperature cautery loop tip	Bovie	AA03
Isoflurane	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Laser doppler perfusion monitor	Moor Instruments	moorVMS-LDF1
Lubricant eye ointment	Bausch + Lomb	339081
Mouse rectal probe	Physitemp	RET-3
Nitrous Oxide	Airgas	UN1070
Otoscope	Welchallyn	728	2.5 mm Speculum
Oxygen	Airgas	UN1072
Povidone-iodine	CVS	955338
Recovery box	Brinsea	TLC eco
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	6100701	Injectable 50 mg/mL
Rodent ventilator	Harvard	Model 683
Temperature controller	Physitemp	TCAT-2DF
Triple antibioric & pain relief	CVS	NDC 59770-823-56
Vaporizer	RWD	R583S