Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Özet

Burada, farelerde yuvarlak spermatid enjeksiyonu (ROSI) gerçekleştirmek için bir yöntem sunuyoruz, umut verici klinik uygulamaları olan ve embriyonik gelişimin altında yatan mekanizmaları araştırmak için faydalı bir teknik.

Özet

Haploid genetik içerikleri ile karakterize edilen yuvarlak spermatidler, olgun spermatozoanın öncü hücrelerini temsil eder. Yenilikçi yuvarlak spermatid enjeksiyonu (ROSI) tekniği sayesinde, oositler başarılı bir şekilde döllenebilir ve canlı fetüslere dönüştürülebilir. 1995 yılında ulaşılan çığır açan bir dönüm noktasında, ROSI teknolojisi ile ilk fare fetüsü doğdu. ROSI o zamandan beri embriyonik gelişimi yöneten karmaşık mekanizmaları çözmek için çok önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır ve fare neslinin hızlandırılması ve genetiği değiştirilmiş farelerin üretimi de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda önemli bir potansiyele sahiptir. 1996 yılında, ROSI teknolojisi ile ilk insan fetüsü doğduğunda bir dönüm noktasına ulaşıldı. Bununla birlikte, bu yöntemin klinik uygulamaları dalgalı bir başarı ve başarısızlık modeli göstermiştir. Bugüne kadar, ROSI teknolojisi, öncelikle düşük doğum verimliliği ve fetal güvenliğin yetersiz doğrulanması nedeniyle klinik uygulamada yaygın bir uygulama bulamamıştır. Bu makale, temel araştırmalara ve potansiyel klinik uygulamalarına yeni bir ışık tutmayı amaçlayan, farelerde ROSI gerçekleştirmenin kesin yöntemlerinin kapsamlı bir açıklamasını sunmaktadır.

Giriş

Spermatogenezin son aşaması, yuvarlak bir spermatidin, farklı baş, boyun ve uzun kuyruk yapıları ile karakterize edilen tam gelişmiş bir spermatozoona dönüşümünü içerir¹. Bu dönüşüm, çekirdekte kromatinin yoğunlaşması, histonların protamin ile yer değiştirmesi, akrozom oluşumu, mitokondriyal kılıf gelişimi, sentriol göçü ve kaybı, kuyruk yapısı oluşumu ve hücresel kalıntıların uzaklaştırılması gibi hücre morfolojisindeki önemli değişiklikleri kapsar².

1992 yılında, ilk insan fetüsü intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) teknolojisi ile başarıyla doğdu³. O zamandan beri araştırmacılar, oositleri döllemek ve canlı gebelikleri sürdürmek için olgun spermatozoa ile aynı haploid genetik bileşimi paylaşan yuvarlak spermatidleri kullanma potansiyelini araştırıyorlar ^2,4. Daha sonra, 1996 yılında, yuvarlak spermatid enjeksiyonu (ROSI) teknolojisi ile gebe kalan ilk insan fetüsü teslim edildi ^5,6. Farelerde ICSI ve ROSI içeren çalışmaların, fare oosit zarının enjeksiyon işlemi sırasında hasara yatkınlığı nedeniyle insanlardakilerin gerisinde kaldığını belirtmekte fayda var. Bu sorun, Piezo membran kırma cihazının piyasaya sürülmesiyle başarıyla çözüldü. Sonuç olarak, 1995 yılında ROSI teknolojisi ile tasarlanan ilk fare doğdu. Ek olarak, diğer çeşitli hayvanlarda ROSI ile ilgili araştırmalar da devam etmektedir ^7,8.

Şu anda, ROSI ile ilgili araştırmalar temel olarak aşağıdaki hususlar etrafında yoğunlaşmaktadır: klinik uygulama, mekanizma açıklaması ve ROSI teknolojisinin daha geniş uygulamaları ile birlikte gelişimsel verimliliği artırmaya yönelik stratejiler. Klinik uygulamalar bağlamında, 1996 yılında ROSI aracılığıyla ilk ROSI insan fetüsünün doğumuna rağmen, ilerleme bir dizi başarı ve başarısızlıkla işaretlenmiştir ^9,10,11,12. Bugüne kadar, ROSI teknolojisi, büyük ölçüde düşük verimliliği ve ROSI teknolojisi ile tasarlanan fetüslerin güvenliği ile ilgili daha fazla doğrulama ihtiyacı nedeniyle yaygın bir klinik uygulama elde edememiştir. Eksik istatistikler, küresel olarak, 200'den az insan ROSI ile gebe kalmış fetüsün teslim edildiğini göstermektedir. ROSI teknolojisinin potansiyelini anlamada bir dönüm noktası, 2015 yılında Tanaka ve meslektaşlarının ROSI teknolojisi aracılığıyla 14 fetüsün başarılı bir şekilde doğduğunu bildirdiklerinde meydana geldi ve klinik uygulamasına ve uygulanabilirliğine yeniden güven aşıladı^13,14. ROSI teknolojisi, özellikle obstrüktif olmayan azospermi hastalarında üreme biyolojisi zorluklarını ele almak için önemli bir umut vaat etmektedir. Klinik uygulamalarına ek olarak, ROSI, embriyonik gelişimin karmaşık mekanizmalarını incelemek için değerli bir araç olarak hizmet eder 15,16,17.

Tam embriyonik gelişimin sağlanmasında ROSI'nin düşük verimliliğine katkıda bulunan altta yatan faktörleri araştırmak için çok sayıda hayvan çalışması yapılmıştır. Bu faktörler, yardımlı oosit aktivasyonu (AOA) yöntemlerinin seçimini ve zamanlamalarını, genomik stabilitedeki anormallikleri ve özellikle epigenetik modifikasyonlardaki anormallikleri kapsar. Yuvarlak spermatidlerin, çeşitli fizyolojik yönlerden olgun spermatozoadan önemli ölçüde farklı olan olgunlaşmamış germ hücreleri olduğunu bilmek önemlidir. Mizuki Sakamoto ve meslektaşları, yuvarlak spermatidlerden türetilen H3K27me3'ün, daha az erişilebilir olan ve ROSI embriyolarında bozulmuş gen ekspresyonuna yol açan kromatin ile ilişkili olduğunu belirtti¹⁸. Jing Wang ve meslektaşları tarafından yapılan ilgili bir çalışmada, pronükleer aşamalarda ROSI embriyolarındaki yeniden programlama kusurları, ağırlıklı olarak minör zigotik genom aktivasyonundan sorumlu genlerin bir kohortunun yanlış ekspresyonu ile ilişkilendirilmiştir¹⁹. Ayrıca, seçici bir ökromatik histon lizin metiltransferaz 2 inhibitörü olan A366'nın eklenmesinin, genel gelişim oranını potansiyel olarak yaklaşık iki kat artırabileceğini buldular.

Fare, embriyonik gelişimi incelemek için en değerli model hayvanlardan biri olarak duruyor. Bu makale, fareler üzerinde ROSI'nin nasıl gerçekleştirileceğini detaylandırmaktadır. Bu kapsamlı protokol, uygun farelerin seçimini, ayrıntılı yumurtlama indüksiyon prosedürlerini, AOA tekniklerini, enjeksiyon tekniklerini ve vekil farelerin hazırlanmasını kapsar. Ayrıca, iki enjeksiyon rejiminin doğum verimliliği üzerindeki etkilerinin karşılaştırmalı bir analizini sunuyoruz: AOA'yı takiben ROSI (A-ROSI; birinci rejim) ve ROSI'yi takiben AOA (ROSI-A; ikinci rejim). Araştırmacıları, fare ROSI deneylerini daha hassas bir şekilde yürütmeye teşvik etmeyi, klinik uygulamaları ve embriyonik gelişim mekanizmalarının temel araştırmaları için daha sağlam destek sunmayı amaçlıyoruz.

Protokol

Bu deneyde kullanılan B6D2F1 (C57BL/6 x DBA/2), C57BL/6 ve ICR fareleri Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd.'den (Pekin, Çin) satın alındı. Tüm hayvan tedavileri, Jilin Üniversitesi Birinci Hastanesi Deney Hayvanları Etik Kurulu tarafından onaylanan deneysel prosedürlere ve standartlara bağlı kalmıştır (onay numarası: 20200435).

1. İlgili reaktiflerin hazırlanması

1. Bazı reaktifleri ticari olarak edinin ve kalan reaktifleri kendiniz hazırlayın.
   1. Tedarikçiden yuvarlak spermatidlerin (RS), spermatozoaların ve oositlerin in vitro işlenmesi için bir tampon sistem olan_M2'yi edinin.
   2. Daha önce yayınlanan protokol^20'yi izleyerek AOA için Ca²⁺ içermeyen CL Chatot, CA Ziomek ve BD Bavister (CZB) ortamını hazırlayın.
   3. Embriyo kültürü için amino asitler (KSOMaa) çözeltisi ile desteklenmiş potasyum simpleks optimize edilmiş ortamı tedarikçiden temin edin.
   4. 0.1 g hyaluronidazı 1 mL embriyo suyunda çözerek% 0.1 (1 g / L) çalışma konsantrasyonuna sahip hyaluronidaz hazırlayın. 10 μL konsantre depolama çözeltisi alın ve 1 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilen 990 mL_M2 içinde çözün.
   5. Ortalama moleküler ağırlığı 360.000 ve kütle konsantrasyonu %12 olan polivinilpirolidonu (PVP), 1.2 g PVP'yi 10 mL_M2'de çözerek hazırlayın. Elde edilen çözelti 1 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
   6. -20 ° C'de 18 μL DMSO içinde çözünür sitokalasin B (CB) stok çözeltisini (2 μL) saklayın. 5 μL konsantre depolama çözeltisi alın ve 995 mL_M2 içinde çözün. Elde edilen çözelti 1 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.

2. Oositlerin hazırlanması

1. 6-8 haftalık dişi B6D2F1 farelerini en az 1 hafta boyunca yeni ortamlarına alıştırın. Öğleden sonra 5'te 7.5 IU hamile kısrak serum gonadotropini (PMSG) ile intraperitoneal olarak enjekte edin, ardından 48 saat sonra 7.5 IU insan koryonik gonadotropini (HCG) izleyin. Enjeksiyondan sonra erkek farelerle temas olmadığından emin olun.
   NOT: Belirtilen saat (17:00) zorunlu değildir. Sadece iş rahatlığı içindir. Saat 17:00'den sonraki 14 saat, oositlerin hazır olduğu ve enjeksiyonun yapıldığı sabah 7'dir, bu nedenle enjeksiyon zamanı sabah için planlanır. Enjeksiyonun başlama zamanı laboratuvarın günlük programına göre ayarlanabilir.
2. 14 saatlik HCG enjeksiyonundan sonra, servikal dislokasyon yöntemini kullanarak fareleri ötenazi yapın. Karın boşluğunu açın ve uterusu bulun. Rahim boyunca yumurtalıkları tanımlayın ve yumurtalıkların yakınındaki fallop tüplerini makas kullanarak kesin. Aynı işlemi diğer tarafta da tekrarlayın ve fallop tüplerini önceden 37 °C'de önceden ısıtılmış olan M_2'ye yerleştirin.
3. Dik bir mikroskop (10x) altında, fallop tüpünün şeffaf ve şişmiş bir görünüm gösteren genişlemiş kısmını bulun. Fallop tüpünü sabitlemek için 1 mL'lik bir şırınga kullanın, genişlemiş kısmı keserek oosit koronal kümülüs komplekslerini (OCCC'ler) toplayın.
4. OCCC'leri %0.1 hyaluronidaz içeren önceden ısıtılmış M₂ çalışma solüsyonuna yerleştirin ve oral bir pipetten hafifçe üfleyerek granüloza hücrelerini çıkarın.
   NOT: OCCC'leri kısa bir süre, gerekirse yaklaşık 2 dakika% 0.1 hyaluronidaz içinde tutun.
5. Granüloza hücrelerini çıkardıktan sonra, oositi KSOMaa'ya aktarın, 3 kez durulayın ve daha sonra kullanmak üzere bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin (37 ° C,% 5 CO₂).

3. Yuvarlak spermatidlerin ve spermatozoaların hazırlanması

1. Sırasıyla erkek C57BL / 6 farelerinin (8-10 hafta) testis ve epididiminden yuvarlak spermatidleri ve spermatozoaları toplayın.
   1. Spermatozoa için, fareleri servikal çıkık ile ötenazi yapın. Karın boşluğunu açın, epididimi testisin yanına yerleştirin ve makasla nazikçe çıkarın.
   2. Epididimi_M2 ortamına yerleştirin ve spermatozoanın dik mikroskop altında (10x) dışarı akmasına izin vermek için 1 mL'lik bir şırınga kullanarak hafifçe eksize edin.
   3. Akan spermatozoa ve_M2 süspansiyonunu 0.5 mL_M2 içeren bir tüpün dibine sifonlayın ve spermatozoanın doğal olarak yukarı akışa akmasına izin verin. Bunları daha sonra kullanmak üzere bir kenara koyun.
   4. Yuvarlak spermatidler için, testisleri karın boşluğundan çıkarın ve_M2'ye yerleştirin. Beyaz zarı 1 mL'lik bir şırınga kullanarak nazikçe kesin ve kıvrımlı seminifer tübülleri dik bir mikroskop (10x) altında sıkın.
   5. İki adet 1 mL şırınga kullanarak seminifer tübülleri dikkatlice çıkarın. Süspansiyonu ve filtreyi 400 gözenekli bir elek (38 μm) ile çıkarın.
2. Filtrelenmiş hücreleri santrifüjleyin, süpernatanı atın ve boyama için 200 μL Hoechst 33342 ekleyin, ardından 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
3. Yuvarlak spermatidleri diğer hücre tiplerinden ayırt etmek için floresanla aktive edilen hücre sıralaması (FACS) yapın. Lekeli hücreleri bir akış sitometri tüpüne yerleştirin ve yuvarlak bir spermatid taraması yapın.
   1. Akış sitometri makinelerinin farklı modelleri farklı düzenleyici parametrelere sahiptir ve çalışma sırasında teknik destek ile iletişim kurabilir. İlk adım olarak, voltajı ayarlayın ve hücre popülasyonunu ileri saçılmaya (FSS) ve yan saçılmaya göre seçin (SSC; Ek Tablo 1'e bakınız).
   2. İkinci adım için, FSC'ye göre hücre yapışıklıklarını çıkarın ve darbe genişliğini tetikleyin.
   3. Üçüncü adım olarak, hedef haploid yuvarlak spermatidleri seçin. Hoechst 33342 DNA'ya bağlanır ve farklı ploidiye sahip hücreler farklı floresan yoğunlukları sergiler. Uyarma dalga boyunu 355 olarak ayarlayın. Yuvarlak spermatidleri sıralamak için 355 dalga boyu lazer altında 460/50 ve 670/30 olmak üzere iki algılama kanalı seçin. Daha sonra, sıralanan yuvarlak spermatidleri daha sonra kullanmak üzere 4 ° C'lik bir buzdolabında saklayın.
      NOT: Mikroskop altında morfolojilerine göre yuvarlak spermatidleri doğrudan seçmek de mümkündür, ancak seçim doğruluğunu sağlamak için eğitim gereklidir.

4. Yuvarlak spermatid enjeksiyonu (ROSI)

1. ROSI prosedürünü bir mikromanipülasyon sistemi ile ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak gerçekleştirin.
2. İlk hazırlık adımında, daha önce açıklanan prosedüre²¹ göre tutma ve enjeksiyon iğneleri yapın. Enjeksiyon iğnesinin iç çapını, yuvarlak spermatidlerin çıkarılması için tasarlanmış 6-7 μm arasında tutun ve tutma iğnesi için, oositi sabitlemek için 20 μm'lik bir iç çapa sahip olun.
3. Sonraki hazırlık adımında, oositleri yumuşatmak için CB içeren 10 μL_M2 damlacıkları ve yuvarlak spermatidleri depolamak için 10 μL_M2 damlacıkları yerleştirerek bir enjeksiyon kabı oluşturun. Enjeksiyon iğnelerini nemlendirmek ve temizlemek için PVP damlacıkları kullanın.
   NOT: Buraya CB eklemek gerekli bir adım değildir, ancak CB eklemek enjeksiyondan sonra hayatta kalma oranını büyük ölçüde artırabilir.
4. Bir enjeksiyon iğnesi kullanarak yuvarlak spermatidleri çıkarın.
5. Oositin polar gövdesini saat 12 veya saat 6 konumuna getirerek oositi bir tutma iğnesi ile döndürün.
6. Enjeksiyon iğnesini, zona pellucida'ya sıkıca yapışarak oosit üzerindeki saat 3 konumuna dikkatlice yerleştirin. Zona pellucida'da bir delik oluşturmak için bir PiezoXpert cihazı kullanın. Gücü küçükten büyüğe ayarlayın, bu yaklaşık olarak yoğunluk = 5 ve burada hız = 15'tir.
7. Enjeksiyon iğnesini zona pellucida'dan yavaşça ilerletin ve oositi yatay olarak girin. Oositin merkezini geçtiğinde, bir piezo uygulayın (yoğunluk = 1 ve hız = 1), bu da oosit zarının yırtılmasına ve yuvarlak spermatidin oositin sitoplazmasına kademeli olarak enjekte edilmesine neden olur.
8. Enjeksiyon iğnesini geri çekin ve kapatmak için açıklığın yakınında küçük bir miktar oosit zarını aspire edin. Bu adım çok önemlidir, çünkü sızdırmazlığın yapılmaması sitoplazmik sızıntıya ve oosit ölümüne neden olur.
   NOT: ROSI'nin, sonraki bölümlerde tartıştığımız yuvarlak spermatidlerin enjeksiyonundan önce veya sonra AOA'ya ihtiyaç duyduğunu belirtmekte fayda var.

5. İntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI)

1. ICSI için ROSI ile aynı adımları uygulayın, tek fark 9-10 μm ölçen ICSI enjeksiyon iğnesinin çapıdır.
2. Yüzme hızlarını azaltmak ve sperm ekstraksiyonunu kolaylaştırmak için spermatozoaları bir PVP pistine yerleştirin.
3. ICSI için spermatozoa başının ve kuyruğunun ayrılmasını gerçekleştirin. Spermatozoayı kuyruktan aspire edin ve spermatozoanın boynunu tam olarak enjeksiyon iğnesinin ağzına yerleştirin. Spermatozoanın başını ve kuyruğunu ayırmak için bir piezo (gerektiğinde birden fazla piezo kullanılabilir, yoğunluk = 5 ve hız = 15) uygulayın.

6. Yardımlı oosit aktivasyonu (AOA)

1. Protokole göre, kalsiyum ve magnezyum içermeyen bir CZB ortamı hazırlayın.
2. 10 mM konsantrasyonda moleküler ağırlığı 266.62 olan stronsiyum klorür hekzahidrat (SrCl_26H2O) kullanın. Hazırlamak için 0.26662 g SrCl₂6H₂O'yu 1 mL embriyo suyunda çözün. Kullanım sırasında, 990 μL Ca²⁺ içermeyen CZB ortamına 10 μL konsantre depolama solüsyonu ekleyin ve hemen kullanın.
3. Oositleri aktivasyon için SrCl 2^6H _2Oiçeren Ca₂+ içermeyen CZB ortamına yerleştirin; her damlacık 20 μL'lik bir hacme sahiptir ve her seferinde 20 oosit yerleştirilir. 20 dakika inkübe edin.
4. Eşzamanlı olarak, yuvarlak spermatidler veya spermatozoa enjekte etmeden partenogenez aktivasyonu için bir grup oluşturun. Partenogenez aktivasyon grubunun istatistiksel analiz yapılmadan gösterildiğine ve kontrol grubunun ICSI olduğuna dikkat edilmelidir.

7. Embriyo transferi

1. Bağlanmış ICR erkek ve dişi fareleri 1: 2 oranında barındırın. Ertesi sabah, dişi fareleri vajinal tıkaç varlığı açısından inceleyin ve nakil için vajinal tıkaç olanları seçin.
2. 2 hücreli embriyolardan oluşan transfer edilen embriyoları önceki sabah enjekte edin ve ertesi öğleden sonra transfer edin.
3. Dişi farenin sırtında bir kesi yapın, beyaz yağı ve yumurtalıkları ortaya çıkarın ve fallop tüpünün genişlemiş kısmını dik bir mikroskop altında (10x) bulun.
4. Fallop tüpünün genişlemiş kısmında bir açıklık oluşturmak için 1 mL'lik bir şırınga kullanın ve embriyoları oral bir pipet ile aspire edin. Embriyoları nazikçe uterus yönünde yerleştirin. 5-0 (0.09-0.11 mm) kalınlığında, 4 x 10 model kavisli iğne kullanarak yarayı dikin. Sütür, karın zarı için bir katman ve dış deri için bir katman olmak üzere iki katman halinde yapılır.
5. Taşıyıcı fareler için, deney programına göre sezaryen yapın. Fareleri servikal dislokasyon yöntemiyle ötenazi yapın, alkolle dezenfekte edin ve karın boşluğunu açın. Uterusu nazikçe ve hızlı bir şekilde kesin ve fetüsü ve plasentayı göstermek için amniyotik boşluğu açın. Göbek kordonunu çıkarın ve fetüse yakın taraftan kesin; Fetüs, aynı dönem emziren fareler tarafından beslendi.
   NOT: Doğum oranlarının hesaplanması ihtiyacı nedeniyle, sezaryen üretim kapasitesi açısından daha doğrudur. Doğal doğumda, yavrular anne tarafından yenebilir ve bu da yanlış istatistiklere neden olabilir. Erken evrede nakledilen vekil farelere sezaryen yapılır ve doğumdan önce ötenazi sezaryen yapılır.

8. İstatistiksel analiz

1. Analiz etmek için GraphPad Prism 5'i kullanın. Veriler ortalama ± SD cinsinden ifade edilir; P < 0.05 istatistiksel bir farkı gösterir ve P < 0.01 anlamlı bir istatistiksel farkı gösterir.

Sonuçlar

Araştırmamıza, AOA'nın embriyoların gelişim yetenekleri üzerindeki etkisini inceleyerek başladık. Deney tasarımının şematik bir gösterimi Şekil 1A'da gösterilmiştir. Spermatozoon enjeksiyonundan önce, oositlere AOA (A-ICSI) uygulandı veya tedavi edilmedi (ICSI) kaldı. Embriyonik gelişim ile ilgili detaylı veriler Tablo 1'de sunulmuştur. Sonuçlar, A-ICSI ve ICSI grupları arasında bölünme, blastosist veya doğum ora...

Tartışmalar

Yardımlı oosit aktivasyonu
ROSI için kritik bir ön koşul AOA'dır, çünkü yuvarlak spermatidler tek başına oosit aktivasyonunu başlatamaz. Şu anda, farelerde en yaygın yöntem stronsiyum klorür ^23,24 kullanımını içerirken, en gelişmiş insan uygulaması elektriksel aktivasyonu^{kullanır 13,14}. Oosit aktivasyonunun zamanlaması da büy?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl22H2O	Sigma	C7902	Preparation of CZB
Glucose	Sigma	G6152	Preparation of CZB
HEPES-Na (basic)	Sigma	H3784	Preparation of CZB
Hoechst 33342	Beyotime	C1025	FACS
human chorionic gonadotropin (HCG)	Ningbo Second Hormone Company	HCG	Ovulation promoting drugs
Hyaluronidase	Sigma	H3506	Removing granulosa cells around the oocyte
KCl	Sigma	P5405	Preparation of CZB
KH2PO4	Sigma	P5655	Preparation of CZB
KSOMaa	Caisson Labs	IVL04-100ML	Potassium simplex optimized medium supplemented with amino acids
L-glutamine	Sigma	G8540	Preparation of CZB
M2	Sigma	M7167-50ML	Operating fluid
MgSO47H2O	Sigma	M1880	Preparation of CZB
Na2-EDTA2H2O	Sigma	E5134	Preparation of CZB
NaCl	Sigma	S5886	Preparation of CZB
NaHCO3	Sigma	S5761	Preparation of CZB
Na-lactate 60% syrup d = 1.32 g/L	Sigma	L7900	Preparation of CZB
Na-pyruvate	Sigma	P4562	Preparation of CZB
Piezo drill tips (ICSI)	Eppendorf	piezoXpert	Piezoelectric membrane rupture
pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	Ningbo Second Hormone Company	PMSG	Ovulation promoting drugs
PVA	Sigma	P8136	Preparation of CZB