Injeção de espermátide redonda em camundongo

Resumo

Aqui, apresentamos um método para realizar a injeção redonda de espermátides (ROSI) em camundongos, uma técnica com aplicações clínicas promissoras e utilidade para investigar os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento embrionário.

Resumo

As espermátides redondas, caracterizadas por seu conteúdo genético haplóide, representam as células precursoras dos espermatozóides maduros. Através da técnica inovadora de injeção redonda de espermátides (ROSI), os oócitos podem ser fertilizados com sucesso e desenvolvidos em fetos viáveis. Em um marco inovador alcançado em 1995, o primeiro feto de camundongo nasceu por meio da tecnologia ROSI. Desde então, o ROSI emergiu como uma ferramenta fundamental para desvendar os intrincados mecanismos que regem o desenvolvimento embrionário e possui um potencial significativo em várias aplicações, incluindo a aceleração da geração de camundongos e a produção de camundongos geneticamente modificados. Em 1996, um marco foi alcançado quando o primeiro feto humano nasceu por meio da tecnologia ROSI. No entanto, as aplicações clínicas desse método têm mostrado um padrão flutuante de sucesso e fracasso. Até o momento, a tecnologia ROSI não encontrou ampla aplicação na prática clínica, principalmente devido à sua baixa eficiência de nascimento e validação insuficiente da segurança fetal. Este artigo fornece um relato abrangente dos métodos precisos de realização de ROSI em camundongos, com o objetivo de lançar uma nova luz sobre a pesquisa básica e suas potenciais aplicações clínicas.

Introdução

O estágio final da espermatogênese envolve a transformação de uma espermátide redonda em um espermatozóide totalmente desenvolvido, caracterizado por estruturas distintas de cabeça, pescoço e cauda alongada¹. Essa transformação engloba mudanças significativas na morfologia celular, como a condensação da cromatina no núcleo, a substituição de histonas por protamina, a formação de acrossomos, o desenvolvimento da bainha mitocondrial, a migração e perda de centríolos, a formação da estrutura da cauda e a remoção de resíduos celulares².

Em 1992, o primeiro feto humano nasceu com sucesso por meio da tecnologia de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI)³. Desde então, os pesquisadores têm explorado o potencial de utilizar espermátides redondas, que compartilham a mesma composição genética haplóide dos espermatozóides maduros, para fertilizar oócitos e sustentar gestações viáveis ^2,4. Posteriormente, em 1996, o primeiro feto humano concebido por meio da tecnologia de injeção redonda de espermátides (ROSI) foi entregue ^5,6. Vale a pena notar que os estudos envolvendo ICSI e ROSI em camundongos ficaram atrás daqueles em humanos devido à suscetibilidade da membrana do oócito do camundongo a danos durante o processo de injeção. Este problema foi resolvido com sucesso com a introdução do dispositivo de quebra de membrana Piezo. Consequentemente, em 1995, nasceu o primeiro mouse concebido por meio da tecnologia ROSI. Além disso, pesquisas sobre ROSI em vários outros animais também estão em andamento ^7,8.

Atualmente, a pesquisa sobre ROSI se concentra principalmente nos seguintes aspectos: aplicação clínica, elucidação de mecanismos e estratégias para aumentar a eficiência do desenvolvimento, juntamente com aplicações mais amplas da tecnologia ROSI. No contexto das aplicações clínicas, apesar do nascimento do primeiro feto humano ROSI por meio de ROSI em 1996, o progresso foi marcado por uma série de sucessos e fracassos 9,10,11,12. Até o momento, a tecnologia ROSI não alcançou uma implementação clínica generalizada, em grande parte devido à sua baixa eficiência e à necessidade de validação adicional em relação à segurança de fetos concebidos por meio da tecnologia ROSI. Estatísticas incompletas indicam que, globalmente, menos de 200 fetos humanos concebidos por ROSI nasceram. Um ponto de virada na compreensão do potencial da tecnologia ROSI ocorreu em 2015, quando Tanaka e colegas relataram o nascimento bem-sucedido de 14 fetos por meio da tecnologia ROSI, incutindo confiança renovada em sua aplicação clínica e viabilidade^13,14. A tecnologia ROSI é uma promessa substancial para enfrentar os desafios da biologia reprodutiva, particularmente em pacientes com azoospermia não obstrutiva. Além de suas aplicações clínicas, o ROSI serve como uma ferramenta valiosa para estudar os intrincados mecanismos do desenvolvimento embrionário^{15 , 16 , 17} .

Numerosos estudos em animais foram conduzidos para investigar os fatores subjacentes que contribuem para a baixa eficiência do ROSI em alcançar o desenvolvimento embrionário completo. Esses fatores abrangem a escolha de métodos de ativação assistida de oócitos (AOA) e seus tempos, anormalidades na estabilidade genômica e, particularmente, anormalidades nas modificações epigenéticas. É importante reconhecer que as espermátides redondas são células germinativas imaturas, diferindo significativamente dos espermatozóides maduros em vários aspectos fisiológicos. Mizuki Sakamoto e colegas indicaram que H3K27me3, derivado de espermátides redondas, está associado à cromatina que é menos acessível e leva a uma expressão gênica prejudicada em embriões ROSI¹⁸. Em um estudo relacionado de Jing Wang e colegas, defeitos de reprogramação em embriões ROSI nos estágios pró-nucleares foram predominantemente associados à expressão incorreta de uma coorte dos genes responsáveis pela ativação do genoma zigótico menor¹⁹. Eles também descobriram que a introdução de um inibidor seletivo da histona lisina metiltransferase 2 eucromática, A366, poderia potencialmente aumentar a taxa geral de desenvolvimento em aproximadamente duas vezes.

O camundongo é um dos animais modelo mais valiosos para estudar o desenvolvimento embrionário. Este artigo explica como realizar o ROSI em camundongos. Este protocolo abrangente abrange a seleção de camundongos adequados, procedimentos detalhados de indução da ovulação, técnicas de AOA, técnicas de injeção e a preparação de camundongos substitutos. Além disso, apresentamos uma análise comparativa dos efeitos de dois regimes de injeção na eficiência do nascimento: AOA seguido de ROSI (A-ROSI; primeiro regime) e ROSI seguido de AOA (ROSI-A; segundo regime). Nosso objetivo é incentivar os pesquisadores a realizar experimentos de ROSI em camundongos com maior precisão, oferecendo suporte mais robusto para sua aplicação clínica e a pesquisa fundamental de mecanismos de desenvolvimento embrionário.

Protocolo

Os camundongos B6D2F1 (C57BL / 6 x DBA / 2), C57BL / 6 e ICR usados neste experimento foram adquiridos da Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd. (Pequim, China). Todos os tratamentos com animais aderiram aos procedimentos e padrões experimentais aprovados pelo Comitê de Ética em Animais Experimentais do Primeiro Hospital da Universidade de Jilin (número de aprovação: 20200435).

1. Preparação dos reagentes relevantes

1. Adquira alguns reagentes comercialmente e prepare os reagentes restantes.
   1. Obtenha o M₂, um sistema tampão para processamento in vitro de espermátides redondas (RS), espermatozóides e oócitos do fornecedor.
   2. Prepare o meio C.L. Chatot, C.A. Ziomek e B.D. Bavister (CZB) livre de Ca 2⁺ para AOA seguindo o protocolo^{publicado anteriormente 20}.
   3. Obtenha o meio otimizado de potássio simplex suplementado com aminoácidos (KSOMaa) para cultura de embriões do fornecedor.
   4. Prepare a hialuronidase, com uma concentração de trabalho de 0,1% (1 g / L), dissolvendo 0,1 g de hialuronidase em 1 mL de água embrionária. Pegue 10 μL de solução concentrada de armazenamento e dissolva em 990 mL de M₂, que pode ser armazenado a 4 ° C por 1 semana.
   5. Prepare polivinilpirrolidona (PVP), com peso molecular médio de 360.000 e concentração mássica de 12%, dissolvendo 1,2 g de PVP em 10 mL de M₂. A solução resultante pode ser conservada a 4 °C durante 1 semana.
   6. Conservar a solução-mãe de citocalasina B (CB) (2 μL), solúvel em 18 μL de DMSO a -20 °C. Pegue 5 μL da solução concentrada de armazenamento e dissolva em 995 mL de M₂. A solução resultante pode ser conservada a 4 °C durante 1 semana.

2. Preparação de oócitos

1. Aclimatar camundongos B6D2F1 fêmeas, com idade entre 6 e 8 semanas, ao novo ambiente por pelo menos 1 semana. Injete por via intraperitoneal 7,5 UI de gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG) às 17h, seguida de 7,5 UI de gonadotrofina coriônica humana (HCG) 48 h depois. Certifique-se de que nenhum contato com camundongos machos ocorra após a injeção.
   NOTA: O horário especificado (17h) não é obrigatório. É apenas para conveniência de trabalho. As 14 horas após as 17h são 7h, quando os oócitos estão prontos e a injeção é realizada, portanto, o horário da injeção está programado para a manhã. A hora de início da injeção pode ser ajustada de acordo com a programação diária do laboratório.
2. Após 14 h de injeção de HCG, eutanasiar os camundongos usando o método de luxação cervical. Abra a cavidade abdominal e localize o útero. Identifique os ovários ao longo do útero e corte as trompas de falópio perto dos ovários usando uma tesoura. Repita o mesmo procedimento do outro lado e coloque as trompas de falópio em M₂, que é pré-aquecido a 37 °C com antecedência.
3. Sob um microscópio vertical (10x), localize a parte aumentada da trompa de Falópio, mostrando uma aparência transparente e inchada. Use uma seringa de 1 mL para prender a trompa de Falópio enquanto corta a parte aumentada, coletando complexos de cumulus coronal de oócitos (OCCCs).
4. Coloque os OCCCs na solução operacional M₂ pré-aquecida contendo 0,1% de hialuronidase e remova as células da granulosa soprando suavemente através de uma pipeta oral.
   NOTA: Mantenha os CCCs em hialuronidase a 0,1% por um curto período, aproximadamente 2 min, se necessário.
5. Após remover as células da granulosa, transfira o oócito para KSOMaa, enxágue 3x e coloque em uma incubadora de dióxido de carbono para uso posterior (37 ° C, 5% CO₂).

3. Preparação de espermátides redondas e espermatozóides

1. Coletar espermátides redondas e espermatozóides do testículo e epidídimo de camundongos C57BL/6 machos (8-10 semanas), respectivamente.
   1. Para espermatozóides, eutanasiar os camundongos por luxação cervical. Abra a cavidade abdominal, localize o epidídimo próximo ao testículo e excise suavemente com uma tesoura.
   2. Coloque o epidídimo em meio M₂ e excise suavemente usando uma seringa de 1 mL para permitir que os espermatozóides fluam sob um microscópio vertical (10x).
   3. Sifão os espermatozóides que fluem e a suspensão de M₂ no fundo de um tubo contendo 0,5 mL de M₂, permitindo que os espermatozóides fluam rio acima naturalmente. Deixe-os de lado para uso posterior.
   4. Para espermátides redondas, remova os testículos da cavidade abdominal e coloque-os em M₂. Corte suavemente a membrana branca usando uma seringa de 1 mL e esprema os túbulos seminíferos enrolados sob um microscópio vertical (10x).
   5. Extirpar cuidadosamente os túbulos seminíferos usando duas seringas de 1 mL. Extrair a suspensão e filtrar com um peneiro de 400 malhas (38 μm).
2. Centrifugar as células filtradas, rejeitar o sobrenadante e adicionar 200 μL de Hoechst 33342 para coloração, seguido de incubação a 37 °C durante 10 min.
3. Realize a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) para distinguir espermátides redondas de outros tipos de células. Coloque as células coradas em um tubo de citometria de fluxo e faça uma triagem redonda de espermátide.
   1. Diferentes modelos de máquinas de citometria de fluxo têm diferentes parâmetros regulatórios e podem ser comunicados com suporte técnico durante a operação. Como primeiro passo, ajuste a tensão e selecione a população de células de acordo com a dispersão direta (FSS) e a dispersão lateral (SSC; consulte a Tabela Suplementar 1).
   2. Para a segunda etapa, remova as aderências celulares de acordo com o FSC e acione a largura do pulso.
   3. Como terceiro passo, selecione as espermátides haploides redondas alvo. Hoechst 33342 liga-se ao DNA e células com diferentes ploidia exibem diferentes intensidades de fluorescência. Defina o comprimento de onda de excitação para 355. Selecione dois canais de detecção, 460/50 e 670/30, sob laser de comprimento de onda 355 para classificar espermátides redondas. Em seguida, conservar as espermátides redondas separadas num frigorífico a 4 °C para utilização posterior.
      NOTA: Também é possível selecionar diretamente espermátides redondas com base em sua morfologia ao microscópio, mas é necessário treinamento para garantir a precisão da seleção.

4. Injeção redonda de espermátide (ROSI)

1. Realize o procedimento ROSI usando um microscópio invertido com um sistema de micromanipulação.
2. Na etapa inicial de preparação, faça as agulhas de retenção e injeção de acordo com o procedimento descrito anteriormente²¹. Mantenha o diâmetro interno da agulha de injeção entre 6-7 μm, projetada para a extração de espermátides redondas, e para a agulha de retenção, tenha um diâmetro interno de 20 μm para prender o oócito.
3. Na etapa de preparação subsequente, crie um recipiente de injeção colocando 10 μL de gotículas M₂ contendo CB para amolecer os oócitos e 10 μL de gotículas M₂ para armazenar espermátides redondas. Use gotículas de PVP para umedecer e limpar as agulhas de injeção.
   NOTA: Adicionar CB aqui não é uma etapa necessária, mas adicionar CB pode melhorar muito a taxa de sobrevivência após a injeção.
4. Extraia as espermátides redondas usando uma agulha de injeção.
5. Gire o oócito com uma agulha de retenção, posicionando o corpo polar do oócito na posição de 12 ou 6 horas.
6. Coloque a agulha de injeção cuidadosamente na posição de 3 horas no oócito, aderindo firmemente à zona pelúcida. Use um dispositivo PiezoXpert para criar um orifício na zona pelúcida. Ajuste a força de pequeno para grande, que é aproximadamente intensidade = 5 e velocidade = 15 aqui.
7. Avance suavemente a agulha de injeção através da zona pelúcida e entre no oócito horizontalmente. Ao passar pelo centro do oócito, aplique um piezo (intensidade = 1 e velocidade = 1), resultando na ruptura da membrana do oócito e na injeção gradual da espermátide redonda no citoplasma do oócito.
8. Retire a agulha de injeção e aspire uma pequena quantidade da membrana do oócito perto da abertura para selá-la. Esta etapa é crucial, pois a falha na vedação resultaria em vazamento citoplasmático e morte do oócito.
   NOTA: Vale a pena notar que o ROSI exigiu AOA antes ou depois da injeção de espermátides redondas, que discutimos nas seções subsequentes.

5. Injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI)

1. Execute as mesmas etapas para ICSI e para ROSI, com a única diferença sendo o diâmetro da agulha de injeção de ICSI, que mede 9-10 μm.
2. Coloque espermatozóides em uma pista de PVP para reduzir sua velocidade de natação e facilitar a extração de espermatozóides.
3. Realize a separação da cabeça e cauda dos espermatozóides para ICSI. Aspire os espermatozóides da cauda e posicione o pescoço dos espermatozóides precisamente na boca da agulha de injeção. Aplique um piezo (vários piezo podem ser usados conforme necessário, intensidade = 5 e velocidade = 15) para separar a cabeça e a cauda dos espermatozóides.

6. Ativação assistida de oócitos (AOA)

1. De acordo com o protocolo, prepare um meio CZB sem cálcio e magnésio.
2. Utilizar cloreto de estrôncio hexa-hidratado (SrCl₂6H₂O), com um peso molecular de 266,62, a uma concentração de 10 mM. Para prepará-lo, dissolva 0,26662 g de SrCl₂6H₂O em 1 mL de água embrionária. No momento do uso, adicione 10 μL de solução de armazenamento concentrado a 990 μL de meio CZB livre de Ca²⁺ e use imediatamente.
3. Colocar os ovócitos no meio CZB livre de Ca²⁺ contendo SrCl₂6H₂O para ativação; cada gota tem um volume de 20 μL e 20 oócitos são colocados de cada vez. Incubar por 20 min.
4. Simultaneamente, estabeleça um grupo para ativação da partenogênese sem injetar espermátides redondas ou espermatozóides. Deve-se notar que o grupo de ativação da partenogênese é mostrado sem análise estatística, e o grupo controle é ICSI.

7. Transferência de embriões

1. Alojar os camundongos machos e fêmeas ICR ligados em uma proporção de 1:2. Na manhã seguinte, examine os camundongos fêmeas quanto à presença de um tampão vaginal e selecione aqueles com tampão vaginal para transplante.
2. Injete os embriões transferidos que consistem em embriões de 2 células na manhã anterior e transfira-os na tarde seguinte.
3. Faça uma incisão nas costas da rata, exponha a gordura branca e os ovários e localize a parte aumentada da trompa de Falópio sob um microscópio vertical (10x).
4. Use uma seringa de 1 mL para criar uma abertura na parte aumentada da trompa de Falópio e aspire os embriões através de uma pipeta oral. Introduza suavemente os embriões na direção do útero. Suturar a ferida, utilizando modelos 4 x 10 de agulhas curvas com linha, com espessura de 5-0 (0,09-0,11 mm). A sutura é feita em duas camadas, sendo uma camada para o peritônio e uma camada para a pele externa.
5. Para camundongos substitutos, realize cesarianas com base no cronograma experimental. Eutanasiar os camundongos pelo método de luxação cervical, desinfetar com álcool e abrir a cavidade abdominal. Abra o útero com cuidado e rapidez e abra a cavidade amniótica para mostrar o feto e a placenta. Retire o cordão umbilical e corte do lado próximo ao feto; O feto foi alimentado pelo mesmo período de camundongos lactantes.
   NOTA: Devido à necessidade de calcular as taxas de natalidade, a cesariana é mais precisa em relação à capacidade de produção. No parto natural, a prole pode ser comida pela mãe, resultando em estatísticas imprecisas. A cesariana é realizada em camundongos substitutos transplantados no estágio inicial, e a cesariana por eutanásia é realizada antes do parto.

8. Análise estatística

1. Use o GraphPad Prism 5 para analisar. Os dados são expressos em média ± DP; P < 0,05 indica diferença estatística e P < 0,01 indica diferença estatística significativa.

Resultados

Iniciamos nossa investigação examinando o efeito do AOA na capacidade de desenvolvimento dos embriões. Uma ilustração esquemática do desenho experimental é mostrada na Figura 1A. Antes da injeção de espermatozóides, os oócitos foram submetidos a AOA (A-ICSI) ou permaneceram sem tratamento (ICSI). Dados detalhados sobre o desenvolvimento embrionário são apresentados na Tabela 1. Os resultados não revelaram diferenças significat...

Discussão

Ativação assistida de oócitos
Um pré-requisito crítico para ROSI é a AOA, uma vez que as espermátides redondas sozinhas não podem iniciar a ativação do oócito. Atualmente, o método mais estabelecido em camundongos envolve o uso de cloreto de estrôncio^23,24, enquanto a aplicação humana mais avançada emprega ativação elétrica^13,14. O m...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl22H2O	Sigma	C7902	Preparation of CZB
Glucose	Sigma	G6152	Preparation of CZB
HEPES-Na (basic)	Sigma	H3784	Preparation of CZB
Hoechst 33342	Beyotime	C1025	FACS
human chorionic gonadotropin (HCG)	Ningbo Second Hormone Company	HCG	Ovulation promoting drugs
Hyaluronidase	Sigma	H3506	Removing granulosa cells around the oocyte
KCl	Sigma	P5405	Preparation of CZB
KH2PO4	Sigma	P5655	Preparation of CZB
KSOMaa	Caisson Labs	IVL04-100ML	Potassium simplex optimized medium supplemented with amino acids
L-glutamine	Sigma	G8540	Preparation of CZB
M2	Sigma	M7167-50ML	Operating fluid
MgSO47H2O	Sigma	M1880	Preparation of CZB
Na2-EDTA2H2O	Sigma	E5134	Preparation of CZB
NaCl	Sigma	S5886	Preparation of CZB
NaHCO3	Sigma	S5761	Preparation of CZB
Na-lactate 60% syrup d = 1.32 g/L	Sigma	L7900	Preparation of CZB
Na-pyruvate	Sigma	P4562	Preparation of CZB
Piezo drill tips (ICSI)	Eppendorf	piezoXpert	Piezoelectric membrane rupture
pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	Ningbo Second Hormone Company	PMSG	Ovulation promoting drugs
PVA	Sigma	P8136	Preparation of CZB