Injection ronde de spermatide de souris

Résumé

Ici, nous présentons une méthode d’injection de spermatides rondes (ROSI) chez la souris, une technique aux applications cliniques prometteuses et utile pour étudier les mécanismes sous-jacents au développement embryonnaire.

Résumé

Les spermatides rondes, caractérisées par leur contenu génétique haploïde, représentent les cellules précurseurs des spermatozoïdes matures. Grâce à la technique innovante de l’injection de spermatides rondes (ROSI), les ovocytes peuvent être fécondés avec succès et développés en fœtus viables. Dans une étape révolutionnaire franchie en 1995, le premier fœtus de souris est né grâce à la technologie ROSI. ROSI est depuis devenu un outil essentiel pour démêler les mécanismes complexes régissant le développement embryonnaire et présente un potentiel important dans diverses applications, notamment l’accélération de la génération de souris et la production de souris génétiquement modifiées. En 1996, une étape importante a été franchie lorsque le premier fœtus humain est né grâce à la technologie ROSI. Cependant, les applications cliniques de cette méthode ont montré un schéma fluctuant de succès et d’échec. À ce jour, la technologie ROSI n’a pas trouvé d’application généralisée dans la pratique clinique, principalement en raison de sa faible efficacité à la naissance et de sa validation insuffisante de l’innocuité fœtale. Cet article fournit un compte rendu complet des méthodes précises de réalisation de ROSI chez la souris, dans le but d’apporter un nouvel éclairage sur la recherche fondamentale et ses applications cliniques potentielles.

Introduction

La dernière étape de la spermatogenèse implique la transformation d’une spermatide ronde en un spermatozoïde pleinement développé, caractérisé par des structures distinctes de la tête, du cou et de la queue allongée¹. Cette transformation englobe des changements significatifs dans la morphologie cellulaire, tels que la condensation de la chromatine dans le noyau, le remplacement des histones par la protamine, la formation d’acrosomes, le développement de la gaine mitochondriale, la migration et la perte de centrioles, la formation de la structure de la queue et l’élimination des résidus cellulaires².

En 1992, le premier fœtus humain est né avec succès grâce à la technologie d’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI)³. Depuis lors, les chercheurs ont exploré le potentiel de l’utilisation de spermatides rondes, qui partagent la même composition génétique haploïde que les spermatozoïdes matures, pour féconder les ovocytes et maintenir des grossesses viables ^2,4. Par la suite, en 1996, le premier fœtus humain conçu par injection de spermatides rondes (ROSI) a été mis au monde ^5,6. Il convient de noter que les études portant sur l’ICSI et le ROSI chez la souris étaient à la traîne par rapport à celles menées chez l’homme en raison de la sensibilité de la membrane de l’ovocyte de souris aux dommages pendant le processus d’injection. Ce problème a été résolu avec succès avec l’introduction du dispositif de rupture de membrane piézoélectrique. C’est ainsi qu’en 1995, la première souris conçue grâce à la technologie ROSI est née. De plus, des recherches sur ROSI chez divers autres animaux sont également en cours ^7,8.

À l’heure actuelle, la recherche sur ROSI se concentre principalement sur les aspects suivants : l’application clinique, l’élucidation des mécanismes et les stratégies visant à améliorer l’efficacité du développement, ainsi que des applications plus larges de la technologie ROSI. Dans le cadre des applications cliniques, malgré la naissance du premier fœtus humain ROSI par ROSI en 1996, les progrès ont été marqués par une série de succès et d’échecs 9,10,11,12. À ce jour, la technologie ROSI n’a pas été mise en œuvre clinique à grande échelle, en grande partie en raison de sa faible efficacité et de la nécessité d’une validation supplémentaire de l’innocuité des fœtus conçus par la technologie ROSI. Des statistiques incomplètes indiquent qu’à l’échelle mondiale, moins de 200 fœtus humains conçus par ROSI ont été mis au monde. Un tournant dans la compréhension du potentiel de la technologie ROSI s’est produit en 2015 lorsque Tanaka et ses collègues ont rapporté la naissance réussie de 14 fœtus grâce à la technologie ROSI, suscitant une confiance renouvelée dans son application clinique et sa^{faisabilité13,14}. La technologie ROSI est très prometteuse pour relever les défis de la biologie de la reproduction, en particulier chez les patients atteints d’azoospermie non obstructive. En plus de ses applications cliniques, ROSI est un outil précieux pour étudier les mécanismes complexes du développement embryonnaire 15,16,17.

De nombreuses études animales ont été menées pour étudier les facteurs sous-jacents contribuant à la faible efficacité de ROSI dans l’obtention d’un développement embryonnaire complet. Ces facteurs englobent le choix des méthodes d’activation assistée des ovocytes (AOA) et leurs calendriers, les anomalies de la stabilité génomique et, en particulier, les anomalies des modifications épigénétiques. Il est important de reconnaître que les spermatides rondes sont des cellules germinales immatures, différant considérablement des spermatozoïdes matures dans divers aspects physiologiques. Mizuki Sakamoto et ses collègues ont indiqué que H3K27me3, dérivé de spermatides rondes, est associé à une chromatine moins accessible et entraîne une altération de l’expression génique chez les embryons ROSI¹⁸. Dans une étude connexe menée par Jing Wang et ses collègues, les défauts de reprogrammation chez les embryons ROSI aux stades pronucléaires étaient principalement associés à la mauvaise expression d’une cohorte de gènes responsables de l’activation mineure du génome zygotique¹⁹. Ils ont également constaté que l’introduction d’un inhibiteur sélectif de la lysine méthyltransférase 2 des histones euchromatiques, A366, pourrait potentiellement augmenter le taux de développement global d’environ deux fois.

La souris est l’un des animaux modèles les plus précieux pour l’étude du développement embryonnaire. Cet article explique comment effectuer ROSI sur des souris. Ce protocole complet comprend la sélection des souris appropriées, les procédures détaillées d’induction de l’ovulation, les techniques d’AOA, les techniques d’injection et la préparation de souris porteuses. De plus, nous présentons une analyse comparative des effets de deux schémas d’injection sur l’efficacité à la naissance : l’AOA suivi de ROSI (A-ROSI ; premier régime) et le ROSI suivi d’AOA (ROSI-A ; deuxième régime). Notre objectif est d’encourager les chercheurs à mener des expériences ROSI sur des souris avec une plus grande précision, en offrant un soutien plus solide à leur application clinique et à la recherche fondamentale sur les mécanismes de développement embryonnaire.

Protocole

Les souris B6D2F1 (C57BL/6 x DBA/2), C57BL/6 et ICR utilisées dans cette expérience ont été achetées de Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd. (Beijing, Chine). Tous les traitements d’animaux ont été soumis aux procédures expérimentales et aux normes approuvées par le Comité d’éthique des animaux d’expérimentation du premier hôpital de l’Université de Jilin (numéro d’approbation : 20200435).

1. Préparation des réactifs pertinents

1. Achetez certains réactifs dans le commerce et préparez vous-même les réactifs restants.
   1. Procurez-vous M₂, un système tampon pour le traitement in vitro des spermatides rondes (RS), des spermatozoïdes et des ovocytes auprès du fournisseur.
   2. Préparez le milieu sans Ca²⁺ C.L. Chatot, C.A. Ziomek et B.D. Bavister (CZB) pour l’AOA en suivant le protocole²⁰ précédemment publié.
   3. Procurez-vous la solution de milieu optimisé pour le potassium simplex complété par des acides aminés (KSOMaa) pour la culture d’embryons auprès du fournisseur.
   4. Préparez la hyaluronidase, à une concentration de travail de 0,1 % (1 g/L), en dissolvant 0,1 g de hyaluronidase dans 1 mL d’eau embryonnaire. Prendre 10 μL de solution de stockage concentrée et dissoudre dans 990 mL de M₂, qui peut être conservé à 4 °C pendant 1 semaine.
   5. Préparez la polyvinylpyrrolidone (PVP), d’un poids moléculaire moyen de 360 000 et d’une concentration massique de 12 %, en dissolvant 1,2 g de PVP dans 10 mL de M₂. La solution obtenue peut être conservée à 4 °C pendant 1 semaine.
   6. Conserver la solution mère de cytochalasine B (CB) (2 μL), soluble dans 18 μL de DMSO à -20 °C. Prélever 5 μL de la solution de stockage concentrée et dissoudre dans 995 mL de M₂. La solution obtenue peut être conservée à 4 °C pendant 1 semaine.

2. Préparation des ovocytes

1. Acclimatez les souris femelles B6D2F1, âgées de 6 à 8 semaines, à leur nouvel environnement pendant au moins 1 semaine. Injecter par voie intrapéritonéale 7,5 UI de gonadotrophine sérique de jument gestante (PMSG) à 17 h, suivie de 7,5 UI de gonadotrophine chorionique humaine (HCG) 48 h plus tard. Assurez-vous qu’aucun contact avec des souris mâles n’a lieu après l’injection.
   REMARQUE : L’heure indiquée (17 h) n’est pas obligatoire. C’est juste pour la commodité du travail. Les 14 heures après 17 heures sont à 7 heures, lorsque les ovocytes sont prêts et que l’injection est effectuée, de sorte que l’heure d’injection est programmée pour le matin. L’heure de début de l’injection peut être ajustée en fonction de l’horaire quotidien du laboratoire.
2. Après 14 h d’injection d’HCG, euthanasier les souris en utilisant la méthode de luxation cervicale. Ouvrez la cavité abdominale et localisez l’utérus. Identifiez les ovaires le long de l’utérus et sectionnez les trompes de Fallope près des ovaires à l’aide de ciseaux. Répétez la même procédure de l’autre côté et placez les trompes de Fallope dans M₂, qui est préchauffé à 37 °C à l’avance.
3. Sous un microscope droit (10x), localisez la partie élargie de la trompe de Fallope, montrant un aspect transparent et gonflé. À l’aide d’une seringue de 1 ml, fixez la trompe de Fallope tout en coupant la partie agrandie en recueillant les complexes coronaux de l’ovocyte.
4. Placez les OCCC dans la solution opératoire M₂ préchauffée contenant 0,1 % d’hyaluronidase et retirez les cellules de la granulosa en soufflant doucement à travers une pipette buccale.
   REMARQUE : Conservez les OCCC dans de l’hyaluronidase à 0,1 % pendant une courte durée, environ 2 min, si nécessaire.
5. Après avoir retiré les cellules de la granulosa, transférez l’ovocyte dans KSOMaa, rincez-le 3 fois et placez-le dans un incubateur de dioxyde de carbone pour une utilisation ultérieure (37 °C, 5 % de CO₂).

3. Préparation des spermatides rondes et des spermatozoïdes

1. Prélever des spermatides rondes et des spermatozoïdes dans les testicules et l’épididyme de souris mâles C57BL/6 (8 à 10 semaines), respectivement.
   1. Pour les spermatozoïdes, euthanasier les souris par luxation cervicale. Ouvrez la cavité abdominale, localisez l’épididyme près du testicule et excisez doucement avec des ciseaux.
   2. Placer l’épididyme dans un milieu M₂ et exciser doucement à l’aide d’une seringue de 1 mL pour permettre aux spermatozoïdes de s’écouler sous un microscope droit (10x).
   3. Siphonnez les spermatozoïdes qui s’écoulent et la suspension de M₂ au fond d’un tube contenant 0,5 mL de M₂, permettant aux spermatozoïdes de s’écouler naturellement vers l’amont. Mettez-les de côté pour une utilisation ultérieure.
   4. Pour les spermatides rondes, retirez les testicules de la cavité abdominale et placez-les en M₂. Coupez doucement la membrane blanche à l’aide d’une seringue de 1 mL et pressez les tubes séminifères alvéolés sous un microscope vertical (10x).
   5. Exciser soigneusement les tubes séminifères à l’aide de deux seringues de 1 ml. Extraire la suspension et filtrer à l’aide d’un tamis de 400 mailles (38 μm).
2. Centrifuger les cellules filtrées, jeter le surnageant et ajouter 200 μL de Hoechst 33342 pour la coloration, suivie d’une incubation à 37 °C pendant 10 min.
3. Effectuez un tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour distinguer les spermatides rondes des autres types de cellules. Placez les cellules colorées dans un tube de cytométrie en flux et effectuez un dépistage circulaire des spermatides.
   1. Différents modèles d’appareils de cytométrie en flux ont des paramètres réglementaires différents et peuvent être communiqués au support technique pendant le fonctionnement. Dans un premier temps, ajustez la tension et sélectionnez la population de cellules en fonction de la diffusion directe (FSS) et de la diffusion latérale (SSC ; voir le tableau supplémentaire 1).
   2. Pour la deuxième étape, supprimez les adhérences cellulaires conformément à la norme FSC et déclenchez la largeur d’impulsion.
   3. Dans un troisième temps, sélectionnez les spermatides rondes haploïdes cibles. Hoechst 33342 se lie à l’ADN, et les cellules avec une ploïdie différente présentent des intensités de fluorescence différentes. Réglez la longueur d’onde d’excitation sur 355. Sélectionnez deux canaux de détection, 460/50 et 670/30, sous laser de longueur d’onde 355 pour trier les spermatides rondes. Ensuite, conservez les spermatides rondes triées dans un réfrigérateur à 4 °C pour une utilisation ultérieure.
      REMARQUE : Il est également possible de sélectionner directement au microscope des spermatides rondes en fonction de leur morphologie, mais une formation est nécessaire pour garantir la précision de la sélection.

4. Injection de spermatides rondes (ROSI)

1. Effectuez la procédure ROSI à l’aide d’un microscope inversé avec un système de micromanipulation.
2. Lors de l’étape de préparation initiale, fabriquer les aiguilles de maintien et d’injection selon la procédure décrite précédemment²¹. Maintenez le diamètre intérieur de l’aiguille d’injection entre 6 et 7 μm, conçue pour l’extraction des spermatides rondes, et pour l’aiguille de maintien, ayez un diamètre intérieur de 20 μm pour fixer l’ovocyte.
3. Dans l’étape de préparation suivante, créez un récipient d’injection en plaçant 10 μL de gouttelettes M₂ contenant du CB pour ramollir les ovocytes et 10 μL de gouttelettes M₂ pour stocker les spermatides rondes. Utilisez des gouttelettes PVP pour humidifier et nettoyer les aiguilles d’injection.
   REMARQUE : L’ajout de CB ici n’est pas une étape nécessaire, mais l’ajout de CB peut grandement améliorer le taux de survie après l’injection.
4. Extrayez les spermatides rondes à l’aide d’une aiguille d’injection.
5. Faites pivoter l’ovocyte à l’aide d’une aiguille de maintien, en positionnant le corps polaire de l’ovocyte à 12 heures ou à 6 heures.
6. Placez l’aiguille d’injection avec précaution à la position 3 heures sur l’ovocyte, en adhérant fermement à la zone pellucide. Utilisez un appareil PiezoXpert pour créer un trou dans la zone pellucide. Ajustez la force de petite à grande, ce qui correspond à environ une intensité = 5 et une vitesse = 15 ici.
7. Faites avancer doucement l’aiguille d’injection à travers la zone pellucide et pénétrez horizontalement dans l’ovocyte. Lorsqu’il passe au centre de l’ovocyte, appliquez un piézo (intensité = 1 et vitesse = 1), entraînant la rupture de la membrane de l’ovocyte et l’injection progressive de la spermatide ronde dans le cytoplasme de l’ovocyte.
8. Retirez l’aiguille d’injection et aspirez une petite quantité de membrane de l’ovocyte près de l’ouverture pour la sceller. Cette étape est cruciale, car l’absence de scellement entraînerait une fuite cytoplasmique et la mort des ovocytes.
   REMARQUE : Il convient de noter que ROSI exigeait l’AOA avant ou après l’injection de spermatides rondes, dont nous avons discuté dans les sections suivantes.

5. Injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI)

1. Effectuez les mêmes étapes pour l’ICSI que pour le ROSI, la seule différence étant le diamètre de l’aiguille d’injection ICSI, qui mesure 9-10 μm.
2. Placez les spermatozoïdes sur une piste PVP pour réduire leur vitesse de nage et faciliter l’extraction des spermatozoïdes.
3. Effectuez la séparation de la tête et de la queue des spermatozoïdes pour l’ICSI. Aspirez les spermatozoïdes de la queue et positionnez le cou des spermatozoïdes précisément à l’embouchure de l’aiguille d’injection. Appliquez un piézo (plusieurs piézos peuvent être utilisés au besoin, intensité = 5 et vitesse = 15) pour séparer la tête et la queue des spermatozoïdes.

6. Activation assistée de l’ovocyte (AOA)

1. Selon le protocole, préparez un milieu CZB sans calcium ni magnésium.
2. Utiliser du chlorure de strontium hexahydraté (SrCl₂6H₂O), d’un poids moléculaire de 266,62, à une concentration de 10 mM. Pour le préparer, dissoudre 0,26662 g de SrCl₂6H₂O dans 1 mL d’eau embryonnaire. Au moment de l’utilisation, ajouter 10 μL de solution de stockage concentrée à 990 μL de milieu CZB exempt de Ca²⁺ et utiliser immédiatement.
3. Placez les ovocytes dans le milieu CZB exempt de Ca²⁺ contenant SrCl₂6H₂O pour l’activation ; chaque gouttelette a un volume de 20 μL, et 20 ovocytes sont placés à chaque fois. Incuber pendant 20 min.
4. Simultanément, établissez un groupe pour l’activation de la parthénogenèse sans injecter de spermatides rondes ou de spermatozoïdes. Il convient de noter que le groupe d’activation de la parthénogenèse est montré sans analyse statistique, et que le groupe témoin est l’ICSI.

7. Transfert d’embryons

1. Hébergez les souris mâles et femelles ICR ligaturées dans un rapport de 1:2. Le lendemain matin, examinez les souris femelles pour détecter la présence d’un bouchon vaginal et sélectionnez celles qui en ont un pour la transplantation.
2. Injectez les embryons transférés composés d’embryons à 2 cellules la veille au matin et transférez-les le lendemain après-midi.
3. Faites une incision sur le dos de la souris femelle, exposez la graisse blanche et les ovaires, et localisez la partie élargie de la trompe de Fallope à l’aide d’un microscope vertical (10x).
4. À l’aide d’une seringue de 1 ml, créez une ouverture dans la partie élargie de la trompe de Fallope et aspirez les embryons à l’aide d’une pipette buccale. Introduisez doucement les embryons en direction de l’utérus. Suturez la plaie, à l’aide de modèles 4 x 10 d’aiguilles incurvées avec fil, d’une épaisseur de 5-0 (0,09-0,11 mm). La suture est faite en deux couches, avec une couche pour le péritoine et une couche pour la peau externe.
5. Pour les souris de substitution, effectuez des césariennes en fonction du calendrier expérimental. Euthanasiez les souris par la méthode de la luxation cervicale, désinfectez avec de l’alcool et ouvrez la cavité abdominale. Ouvrez doucement et rapidement l’utérus et ouvrez la cavité amniotique pour montrer le fœtus et le placenta. Retirez le cordon ombilical et coupez-le du côté près du fœtus ; Le fœtus a été nourri par la même période que les souris allaitantes.
   REMARQUE : En raison de la nécessité de calculer les taux de natalité, la césarienne est plus précise en ce qui concerne la capacité de production. Lors de l’accouchement naturel, la progéniture peut être mangée par la mère, ce qui entraîne des statistiques inexactes. La césarienne est réalisée sur des souris porteuses transplantées à un stade précoce, et l’euthanasie par césarienne est réalisée avant l’accouchement.

8. Analyse statistique

1. Utilisez GraphPad Prism 5 pour analyser. Les données sont exprimées en ± ET moyennes ; P < 0,05 indique une différence statistique, et P < 0,01 indique une différence statistique significative.

Résultats

Nous avons commencé notre enquête en examinant l’effet de l’AOA sur la capacité de développement des embryons. Une illustration schématique de la conception expérimentale est présentée à la figure 1A. Avant l’injection de spermatozoïdes, les ovocytes subissaient soit un AOA (A-ICSI), soit restaient non traités (ICSI). Des données détaillées sur le développement embryonnaire sont présentées dans le tableau 1. Les résul...

Discussion

Activation assistée de l’ovocyte
Une condition préalable essentielle pour ROSI est l’AOA, car les spermatides rondes seules ne peuvent pas initier l’activation des ovocytes. À l’heure actuelle, la méthode la plus établie chez la souris implique l’utilisation de chlorure de strontium^23,24, tandis que l’application humaine la plus avancée utilise l’activation électrique^13,1...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl22H2O	Sigma	C7902	Preparation of CZB
Glucose	Sigma	G6152	Preparation of CZB
HEPES-Na (basic)	Sigma	H3784	Preparation of CZB
Hoechst 33342	Beyotime	C1025	FACS
human chorionic gonadotropin (HCG)	Ningbo Second Hormone Company	HCG	Ovulation promoting drugs
Hyaluronidase	Sigma	H3506	Removing granulosa cells around the oocyte
KCl	Sigma	P5405	Preparation of CZB
KH2PO4	Sigma	P5655	Preparation of CZB
KSOMaa	Caisson Labs	IVL04-100ML	Potassium simplex optimized medium supplemented with amino acids
L-glutamine	Sigma	G8540	Preparation of CZB
M2	Sigma	M7167-50ML	Operating fluid
MgSO47H2O	Sigma	M1880	Preparation of CZB
Na2-EDTA2H2O	Sigma	E5134	Preparation of CZB
NaCl	Sigma	S5886	Preparation of CZB
NaHCO3	Sigma	S5761	Preparation of CZB
Na-lactate 60% syrup d = 1.32 g/L	Sigma	L7900	Preparation of CZB
Na-pyruvate	Sigma	P4562	Preparation of CZB
Piezo drill tips (ICSI)	Eppendorf	piezoXpert	Piezoelectric membrane rupture
pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	Ningbo Second Hormone Company	PMSG	Ovulation promoting drugs
PVA	Sigma	P8136	Preparation of CZB