1. Bakım: Mikroskop altında Gözlem Kültürleri <ol><li> 37 ° C inkübatör embriyonik kök hücrelerinin bir tabak çıkarın ve mikroskop getirmek. </li><li> Genel kültür kalitesini değerlendirmek için, 2X veya 5X büyütme kullanarak, düşük güç koloniler uyun. Aşağıdaki Not: normal orta renk, herhangi bir görünür kirlenme, genel koloni boyutu, kalite ve yoğunluk olmaması, ve başka herhangi bir gözlem. </li><li> Orta renk değişiklikleri gözlemleyin. PH değişikliği ve embriyonik kök hücreleri ile bir gecelik inkübasyondan sonra orta besinlerin tükenmesi nedeniyle, orta bir &quot;saman&quot; renk kırmızı bir renk tonu değişecektir. Orta mor belirirse, temel bir pH değişimi meydana gelmiştir. Orta derece sarı görünüyorsa, orta asitlendirilmiş vardır. Çok sarı orta, iyi ya da kirlenme çok kalabalık koloniler sonucu olabilir. Orta her zaman açıkça görünmelidir. Orta hücre enkaz belli bir seviyesi normal olmasına rağmen, bulanık görünür asla. Yüksek düzeyde bir hücre enkaz görülürse, kültür sağlıklı değildir ve kontamine olabilir. </li><li> Kültürleri, bakım veya Pasajlanması gerek duymuyorsanız, onlar (bkz. Bölüm 2) beslenebilir biyolojik güvenlik kabini alınabilir. </li><li> Kültürleri, yaklaşık% 10 koloniler ayırt daha fazla içeriyorsa, hücreler diferansiye alanların (bkz. Bölüm 3) el kaldırarak &quot;temizlenmiş&quot; olmalıdır. </li><li> Kültürlerin büyük ya da yoğun koloniler içeren veya MEF besleyici tabaka fazla 12 gün ise, hücreler (bkz. bölüm 4) geçişli olmalıdır. </li></ol> 2. Besleme embriyonik kök Hücreler <ol><li> Steril bir biyolojik güvenlik kabini, kültür çanağı kapağı kaldırın ve harcanan orta aspire. Pipet ucu plakası doğrudan kuyuları içinde başka herhangi bir bölümünün temas etmesine izin vermeyin. Kontaminasyon herhangi bir endişeniz varsa, yeni bir steril pipet değiştirin. </li><li> Steril bir damlalıklı cam kullanarak, her bir kuyu için ısıtılmış embriyonik kök hücre kültür ortamı uygun miktarda ekleyebilirsiniz. 6 plaka kültürleri için, ortalama 2.5 ml orta ekleyin. </li><li> 37 ° C ve% 5 CO 2 kalmasını inkübatör plaka dönün. </li></ol> 3. Embriyonik kök Hücre Kültürleri Farklılaşma çıkarma <ol><li> Kalıplama alkol brülör kontrollü ateşte ipuçları toplama araçlarına 9 inç cam Pasteur pipetler dönüştürün. Pipet ucu bulaşmasını önlemek için mühürlü ve kültür çanağı plastik çizilmesini önlemek için yuvarlak olduğunu emin olun. Toplama araçları kullanımı, biyolojik güvenlik kabini UV ışık kaynağı kullanılarak veya muhafaza toplama önce sterilize edin. </li><li> Diferansiye alanların çıkarın. Farklılaşma, genellikle sadece bir kısmını genellikle kenarlarında veya merkezi izole noktalar olarak embriyonik kök hücre kolonisi oluşur. Bir koloni sadece bir bölüm ayırt ise, sadece farklılaştırılmış alanda kaldırılması gerekir. Farklılaşma plakası genellikle bir &quot;yapışkan&quot; sayfasında kaldırın, ve koloni toplama aracı ile bir çizgi çizerek farklılaşmış hücrelerin ilk koloninin geri kalanından ayırmak için yararlı olur. </li><li> Koloninin parçalara ayrılır sonra hafifçe istenmeyen hücreleri ayırmak için plaka boyunca toplama aracı kayma. Bu süreçte kolonileri arasında çok MEF besleyici tabaka kazınması için özen gösterin. </li><li> Farklılaşmış hücrelerin tüm plaka (orta yüzen) kaldırıldığında, biyolojik güvenlik kabini kültür dönün. Farklılaşmış hücrelerin bulunduğu orta aspire edin ve taze embriyonik kök hücre kültür ortamı ile değiştirin. </li></ol> 4. Pasajlanması embriyonik kök Hücreler Enzim Kuluçka <ol><li> Steril bir biyolojik güvenlik kabini, 6-iyi bir kültür çanağı kapağı çıkarın ve geçişli olmak için kuyulardan harcanan orta aspirat. Pipet ucu plakası doğrudan kuyuları içinde başka herhangi bir bölümünün temas etmesine izin vermeyin. </li><li> Steril bir damlalıklı cam kullanarak, geçişli olması için her iyi ısıtılmış kollajenaz IV 1 ml ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 37 ° C inkübatör plaka dönün. </li></ol> Kazıma ve embriyonik kök Hücreler havuzu <ol start="4"><li> Kollajenaz hücreleri kuluçka sonra, mikroskop altında koloniler gözlemliyoruz. Enzim koloni kenarları ince ama gözlemlenebilir bir değişikliğe neden gerekir. </li><li> Biyolojik güvenlik kabini, enzim yavaşça her kuyudan aspirat ve 2.0 mL embriyonik kök hücre kültür ortamı ile değiştirin. </li><li> İpucu kültür plaka ve hafifçe kendinize doğru bir 5 ml damlalıklı cam ile ilk kuyuda 2.0 mL orta sürebilir. Yavaş yavaş orta bırakırken plakasının altına pipetlemeyin dik tutarak yavaşça iyi genelinde pipetlemeyin ucu kayma. </li><li> Kazıma ve pipetti tekrarlayın.ng hareketi 3-4 kez, tüm kolonilerin kadar iyi çıkarıldı. Pipetleyin hafifçe adet çok küçük koloniler kesiliyor önlemek için. Hücrelerin ilk kuyudan söküldükten, iyi içindekilerin terk edip de sonraki hücreleri kazıyarak başlamak. </li><li> geçişli kuyulardan tüm kazınarak, havuz orta steril 15 ml konik tüp her iyi koloni parçaları içeren. </li><li> Embriyonik kök hücre kültür ortamı, her bir kuyunun 1 ml ekleyerek kazınarak kuyu durulayın. Durulayın ve konik tüp transfer toplayın. </li><li> Koloni parçaları istediğiniz boyuta kadar kırmak için tüp hafifçe pipetleyin hücreler. </li><li> 5 dakika için 200 x g. hücreleri Santrifüj </li></ol> Embriyonik kök Hücre Hücreler Kaplama <ol start="12"><li> Embriyonik kök hücreler santrifüj olmasına rağmen, yeni bir 6-iyi MEF besleyici plaka hazırlar. : Hücre hattı, yeni bir geçit sayısı, ve geçiş tarihini uygun embriyonik kök hücre bilgisi plaka etiketleyin. Kuyulardan MEF orta aspire ve her kuyuya 1.0 ml PBS ekleyin. Yavaşça girdap kuyuları etrafında tampon ve PBS yıkayın aspire. Her kuyuya 1.5 mL embriyonik kök hücre kültür ortamı ekleyin ve plaka kenara koyun. </li><li> Embriyonik kök hücreler santrifüj bittiğinde, biyolojik güvenlik kabini geri tüp getirmek. Gevşekçe paketlenmiş hücre pelletini rahatsız etmemek için dikkatli olmak, süpernatantı aspire edin. </li><li> 1 ml embriyonik kök hücre kültür ortamı için iyi kaplama için yeterli ortamı ile pelet hücrelerin tekrar 6 yeni kuyu bölme, 6 ml orta pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Yavaşça ve eşit MEF besleyici plaka iyi hazırlanmış her hücre süspansiyonu 1 ml ekleyin. </li><li> Plaka 37 ° C inkübatör içine yerleştirin ve dikkatle kuyu boyunca hücreler eşit olarak dağıtmak için ileri geri plaka ve yan tarafına kaydırın. </li><li> Hücrelerin ° C gecede 37 takmak için izin verin. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Farklılaşmamış embriyonik kök hücreleri küçük, sıkıca paketlenmiş, ve genellikle daha büyük, daha fazla yayılmasını hücreleri oluşur. Farklılaşma, bir koloni (Şekil 1A) içinde veya koloniler (Şekil 3B) arasında oluşabilir. Farklı morhopologies, mikroskop altında düşük büyütme altında görülebilir. Şekil 2A görüldüğü gibi iyi bir hücre morfolojisi, bir tek tabaka yetişen küçük, sıkışık hücre içerir. Hücreler herhangi bir farklılaşma küçük, temiz, tanımlı kenarları olmalıdır. Şekil 2B gösterilen hücreler Pasajlanması için hazır ve Şekil 2C gösterilen hücreler kalabalık. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Embriyonik kök kültürleri Farklılaşma (A) bir koloni farklılaşma (B) kolonileri arasında ayrım. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Morfolojileri embriyonik kök kültürleri görülmektedir. (A) iyi bir hücre morfolojisi (B), (C) kalabalık hücreleri Pasajlanması için hazır embriyonik kök hücreler.

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).</li></ol>

Embriyonik kök hücreleri ile çalışırken Sterilite her zaman sağlanmalıdır. Biyolojik güvenlik kabini ve tüm ekipman kullanmadan önce temizleyin ve sterilize edin. Tüm reaktifler kullanmadan önce 0.22 mikron gözenek boyutu filtre kullanarak filtre edilmelidir. , Embriyonik kök hücre kültüründe antiboiotics kullanımı gerekli değildir ve kaçınılmalıdır. Ayrı bir ortamda belirli bir toplama istasyonu olarak ayarlanmış olmalıdır. Istasyonu için steril muhafaza UV ışık kaynağı, laminer akış kaputu, ya da biyolojik güvenlik kabini ile statik bir muhafaza (PCR iş istasyonu olarak) olabilir. Diferansiye alanların kaldırılır koloniler dikkat çekme istasyonu içindeki bir diseksiyon mikroskobu gereklidir. Statik muhafaza veya biyolojik güvenlik kabini ön cam panel, uygun hava akımı ve kısırlık ödün vermeden paneli üzerinden genişletmek için mikroskop Okülerin izin vermek için değiştirilmesi gerekir. Hücrelerin sağlıklı embriyonik kök hücre kültürleri korumak için, genellikle her 4-7 gün, en uygun zamanda geçişli olmalıdır. Şu anda koloniler maksimum boyutuna ulaştı ve birleştirme başlangıcı olabilir. Birleştirilmiş koloniler kültür farklılaşma oranını artırabilir. Bölünmüş oranları genelde, 01:03 ve 01:05 arasında kalan kaplama koloniler, büyüme oranı ve kültür koşulları sayısına göre. Overplated koloniler (split oranı çok düşük) muhtemelen erken birleştirme ve onların maksimum boyutuna ulaşmadan geçişli olması gerekir. 2 haftadan daha uzun bir MEF besleyici tabaka Kültürler farklılaşmamış büyüme ve proliferasyonunu destek olacak yeni MEFS geçişli olmalıdır. Farklılaşma doğal embriyonik kök hücre kültürleri oluşur, küçük bir miktar bekleniyor. Sık sık veya aşırı farklılaşma kültürler uygun bakım almazsanız oluşabilir. Hücrelerin her gün beslenmesi gerekir, pasajlar arasında aşırı çoğalma kaçınılmalıdır. Her zaman taze reaktifler kullanın. Bütün medya, MEFS ve reaktifler farklılaşmamış embriyonik kök hücre büyümesini önlemek için, 14 gün içinde kullanılmalıdır. Nakavt Serum Değiştirme, FBS ve MEFS, reaktiflerin lot kullanmadan önce taranmalıdır. Pasajlanması için önce kaldırılmaz farklılaşmış hücrelerin yeni kültürler transfer olacağını unutmayın. Ayrıca, hücreler 37 ° C mümkün olduğunca az tutmaya çalışın. Hücreleri hücrelerin uzun süre kuluçka edilecektir Isıtılmış bir mikroskop aşamasında çok yararlı olabilir (örneğin mikroskop sahnede veya biyolojik güvenlik kabini) kuluçka dışında geçirdikleri zamanı en aza indirin. Mikroskop altında embriyonik kök hücre kültürleri gözlemlemek, ilk kolonilerin görünümü bir düşük güç kullanarak (2x veya 5x) amacı genel kalitesi ve boyutu değerlendirir. Potansiyel olarak farklılaşmış hücreleri düşük güç görüldüğü takdirde, daha yüksek bir büyütme objektif (10X) ile farklılaştırılmış morfolojisi onaylayın. Çıkardıktan sonra hemen farklılaşma, kolonilerin kenarları tırtıklı veya bozuk görünebilir. Kalan farklılaşmamış hücreleri kurtarmak için izin taze orta gecede koloniler inkübe edin. Kültüründe farklılaşmanın etkisi olmadan, bu kalan koloniler normal sayısı hızla artmaya devam edecektir. Eğer mümkünse, düşük geçiş embriyonik kök hücreler kullanılarak deneyler başlar. Tüm büyük deney öncesi ve sonrası hücreleri Karyotip.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11965-092</td>
<td>For MEF medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Certified</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>Heat-inactivated 
For MEF medium</td>
</tr>
<tr>
<td>D-MEM/F-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Knockout&trade; Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10828-028</td>
<td>Pre-screen to ensure support of hES cells</td>
</tr>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>03-0002</td>
<td>Use at [4 ng/mL] final</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-081</td>
<td>200 mM (100X) 
Use at [1X] final
</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-250</td>
<td>Without Ca2+ or Mg2+</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase IV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17104-019</td>
<td>Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12</td>
</tr>
<tr>
<td>Gelatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1890</td>
<td>Type A, Porcine</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Defined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH300.70.01</td>
<td>For freezing medium</td>
</tr>
<tr>
<td>6-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>140675</td>
<td>For general culture</td>
</tr>
<tr>
<td>4-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>For thawing</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL glass pipets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-678-27E</td>
<td>Individually wrapped</td>
</tr>
<tr>
<td>15 mL conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430052</td>
<td>Polypropylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-678-20D</td>
<td>9&#x201D; glass</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

culture and maintenance of human embryonic stem cells  

İnsan embriyonik kök (embriyonik kök) hücreler, sağlıklı, farklılaşmamış kültürleri korumak için izlenmeli ve bakım gerekir. En azından, kültürler kayıp besin doldurmak ve istenmeyen farklılaşma faktörleri kültürleri tutmak için tam bir orta değişikliği yaparak her gün beslenen olmalıdır. Küçük bir miktar farklılaşma normaldir ve kök hücre kültürleri bekleniyor olmasına rağmen, kültür rutin elle kaldırma veya diferansiye alanların &quot;toplama&quot; temizlenir olmalıdır. Belirlenmesi ve embriyonik kök hücre kültürleri fazla farklılaşma kaldırarak hücrelerin sağlıklı bir nüfus bakımında temel teknikler vardır.

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

Bu protokol, sağlıklı, farklılaşmamış insan embriyonik kök (ES) hücreleri korumak için nasıl kullanılacağını gösterir.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürü ve Bakım

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

culture-and-maintenance-of-human-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

47.5K Görüntüleme.  Stemgent. Bu protokol, sağlıklı, farklılaşmamış insan embriyonik kök (ES) hücreleri korumak için nasıl kullanılacağını gösterir.

Video: Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücre (ES) yayılması

Biyoloji

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Mitokondrial Kompleksi Aktivite araştırmayı

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Manyetik Rezonans Görüntüleme için in vitro Etiketleme

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

İnsan Embriyonik Kök Hücreler Donma ve Çözülme

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Teratom Oluşumu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kader Haritalama

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...