Hücre döngüsü sessizesi hematopoetik kök hücrelerin önemli bir özelliğidir. Bu protokol, sessiz insan HSC'lerinin yakın fizyolojik koşullar altında in vitro davranışını anlamaya yardımcı olur. Bu protokolü kullanarak araştırmacılar, hücre döngüsü durumunu düzenleyen çeşitli bileşiklerin, besin maddelerinin veya proteinlerin etkisini ve HSC'lerin farklılaştırılmasını hayvan modelleri kullanmadan ölçeklenebilir bir şekilde test edebilir.
Anti-kanser ilaçları, sessiz HSC'lerin ve bisiklet atalarının hayatta kalması üzerinde çeşitli etkilere sahiptir. Bu protokol, sessiz HSC'leri yedekleyen ajanları veya sessiz lökemik kök hücrelere seçici olarak zarar veren ajanları bulmayı mümkün kılar. Prosedürü gösteren kişi Takubo Laboratuvarı'ndan kıdemli bir araştırma görevlisi olan Hiroshi Kobayashi olacak.
Başlamak için, mililitre sodyum palmitat başına 16 miligram, mililitre sodyum oleat başına 30 miligram ve cam tüplerdeki metanolde mililitre kolesterol başına dört miligram çözün. Lipit çözeltilerini negatif 30 santigrat derecede saklayın ve kullanmadan önce çözün. Taze bir cam tüpte, mililitre palmitat başına 100 mikrogram, mililitre oleat başına 100 mikrogram ve mililitre kolesterol başına 20 mikrogram son konsantrasyonu elde etmek için lipid çözeltilerini karıştırın.
Azot gazını lipit çözeltisi ile geçirerek metanol buharlaştır. Cam tüpü 37 santigrat derecede bir su banyosunda ısıtarak kalan metanolleri tamamen buharlaştır. HEPES ve glutamin ile DMEM/F-12 ortamı hazırlayın.
Mililitre başına sırasıyla 50 birim ve 50 mikrogramlık son konsantrasyon için penisilin ve streptomisin sülfat ekleyin. Ortam en az iki ay boyunca dört santigrat derecede saklanabilir. HEPES ve glutamin ile DMEM/F-12 ortamına BSA'nın %4'ünü ekleyin, ardından sodyum hidroksit çözeltisi kullanarak ortamın pH'ını 7,6'ya ayarlayın.
Ortamı lipitlerle birlikte cam tüpe ekleyin. Lipitleri sonication ile tamamen çözün. Sonication sonra ortam opak ise, sonication süresini uzatın.
BSA ve lipitler çözüldüğünde, numuneler eksi 80 santigrat derecede saklanmalı ve iki ay içinde kullanılmalıdır. DMEM/F-12'ye 0.001X insülin, transferrin, sodyum selenit ve etanol amin karışımı ekleyin ve ardından karışık ortamı 0.22 mikrometre filtre kullanarak filtreleyin. Kullanmadan önce, kültür ortamına her mililitre başına üç nanogramlık son konsantrasyonda insan kök hücre faktörü veya SCF ve insan trombopoietin veya TPO ekleyin.
Sitokinlerle önceden hazırlanmış kültür medyasının 200 mikrolitresini düz alt 96 kuyu plakalarına aktarın. Ortamın buharlaşmasını önlemek için, kullanılmayan tüm kuyuları 100 ila 200 mikrolitre PBS ile doldurun. Sıralanmış hematopoetik kök hücreleri veya HSC'leri mikroliter başına 60 hücrede sitokin olmadan kültür ortamlarında yeniden biriktirin.
Her kuyuya 600 hücre aliquot. 300'den az hücre daha büyük teknik varyasyona yol açacak ve besin yoksunluğu veya elverişsiz sitokinlerin veya kemokinlerin birikmesi nedeniyle tek bir kuyuda 1.000'den fazla hücrenin kültlenmesi önlenmelidir. Hücreleri% 5 karbondioksit ve% 1 oksijen atmosferinde 37 santigrat derecede nemlendirilmiş çok gazlı bir inkübatörde kültüre edin.
Arınmış HSC'leri yedi gün boyunca kültleştirdikten sonra, hücrelerin% 80'ine kadar marker CD34 pozitif ve CD38 negatif fenotipler gösterdi. Toplam hücre sayısı sitokin konsantrasyonuna bağlı. Hücre döngüsüne daha yüksek SCF ve TPO indüklenen giriş konsantrasyonları, çoğalma ve farklılaşma.
CD34 pozitif, CD38 negatif, CD90 pozitif ve CD45 RA negatif fenotipleri ile karakterize fenotipik HSC sayısı SCF veya TPO konsantrasyonları ile orantılı olarak artarken, toplam hücreler arasındaki sıklık azaldı. Kültürlü erişkin kemik iliği HSC'lerinin üç aylık naklinden sonra, rekonsyon, insan CD45 pozitif murin, CD45 negatif Ter119 negatif hücrelerinin periferik kanında sıklıklarının bir fonksiyonu olarak değerlendirilebilir. CD19 pozitif B hücreleri, CD13 negatif, CD33 pozitif miyeloid hücreler ve CD3 pozitif T hücreleri dahil olmak üzere üç soy, taze çözülmüş veya kültürlenmiş HSC'lerle nakledilen NOG farelerinde yeniden inşa edildi.
Kültürü takiben, HSC'ler gerçek zamanlı PCR ve RNA dizilimi gibi gen ekspresyon profillemesine tabi tutulabilir. İmmün eksikliği olan farelere transplantasyon kullanılarak fonksiyonel doğrulama da yapılabilir. Araştırmacılar, sitokin konsantrasyonlarını ayarlayarak bisiklet ve sessiz HSC'leri tanımlanmış koşullar altında doğrudan karşılaştırabilirler.
Bu, in vivo ayarlarını test etmesi zor olan sessiz HSC'ye özgü kendini yenileme programlarını, stres direnci mekanizmalarını ve metabolik özellikleri anlamaya yardımcı olacaktır.
