Dr Bill Cashdollar Sitometrisi Core verdiği destek için teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li> Işlemine başlamadan önce, aşağıdaki öğeleri toplanmış ve hazırlanmış olması gerekir: <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Buz </li><li> , Tek renk kontrolleri boyanması için boyama hücreleri ve 12 x 75 mm akış tüpler için 15 ml konik tüpler. </li><li> Tampon Boyama: fosfat tamponlu salin (PBS) +% 3 fetal buzağı serumu (FCS) </li><li> Pipetler </li><li> Fc blok (gerekiyorsa) ve boyama antikorlar. Antikorlar optimal boyama titre edilmesi gerekir. </li><li> Tazminat boncuk </li><li> Süspansiyon tamponu: Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) + 25 mM HEPES +% 3 FCS </li><li> Tripan mavi ve hemasitometre </li><li> Hücre süzgeç (40 mikron naylon) </li><li> Toplama borular: İki tür toplama tüpleri kullanılabilir) 12 x 75 mm polistiren tüpleri (300 ul FCS ve 25 mM HEPES içeren) veya b) 15 ml konik tüpler (1 ml FCS + 25 mM HEPES içeren). Yüksek serum konsantrasyonu ile herhangi bir zengin orta sıralaması hücrelerinin toplanması için kullanılabilir. </li></ol></li><li> Başlangıç ​​hücre popülasyonu tek bir hücre süspansiyonu oluşturur. </li><li> İsteğe bağlı tamamlayıcı incelmesi ya da manyetik sıralama gibi bir toplu arıtma yöntemi ile istenilen hücre popülasyonu için zenginleştirin. Zenginleştirme adım ana avantajı sıralama süresini kısaltır. </li><li> Hücreleri tampon boyama ile bir kez yıkayın. </li><li> Süpernatantı atın ve verimli boyama için 50 x 10 6 bir konsantrasyon tampon boyama hücrelerin tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> İsteğe bağlı: FCR yüksek düzeylerde ifade hücreleri için uygun bir engelleme yöntemi kullanılarak reseptörlerini bloke. Tercih edilen bir yöntem 10-15 dakika buz üzerinde FcγR bağlanır mAb kullanılmasıdır. Bu antikorlar, ticari olarak mevcuttur. </li><li> Istenilen hücre popülasyonu leke ve boyama tamponu ile iki yıkar takip karanlıkta buz üzerinde 20-30 dakika boyunca inkübe uygun mAb (önceden belirlenmiş konsantrasyon) ekleyin. İsteğe Bağlı: propidium iyodür gibi hayati bir boya, Boyama, ölü hücrelerden ayırt etmek (5) dahil edilebilir. Çok renkli boyama kullanılacak ise, tek renk kontrolleri gereklidir. Biz üretici protokolünü kullanarak tek renk kontrolleri hazırlamak için BD CompBeads kullanın. </li><li> Doğrudan konjuge antikorları kullanarak değilse, uygun ikincil antikor veya Streptavidin konjuge kullanarak 7. adımı tekrarlayın. </li><li> Yıkadıktan sonra, kültür ortamı hücreleri tekrar süspansiyon ve Tripan mavi gibi hayati bir boya kullanarak hücre konsantrasyonunu belirlemek. </li><li> Hücre konsantrasyonu 15-20 ayarlayın x 10 6 / ml. Sıralama sırasında araç yapışmasına neden olabilir form kümeleri, bir süzgeç vasıtasıyla hücrelerin filtre hücre popülasyonlarının. </li><li> Set up ve hücre sıralayıcı optimize. Bir akış sitometresinin kurma süreci üretime bağlı olarak çeşitli ve uygun şekilde eğitilmiş personel tarafından yapılması gerekiyor. Genel öneriler aşağıdaki gibidir: <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Sıralanabilir hücre tipine bağlı olarak uygun nozul seçin. </li><li> Steril türlü enstrüman sterilize edin. </li><li> Lazerler işleyen doğrulamak için boncuk aleti kalite kontrolünü yapmak ve doğru bir sıralama. </li><li> Gerekli toplama cihazı takın ve yan akışları kurmak. </li><li> (BD FACS Aria üç lazerler ve dokuz renk algılayabilir) kullanılabilir floresan etiketleri belirlemek için cihazın lazer ve dedektör bakın. </li><li> Bir kere floresan etiketler hücre sıralayıcı ne olacağı belirlenir, tazminat (aşağıda açıklandığı gibi) yapılabilir. </li></ol></li><li> Negatif kontrol örneği ve tek pozitif kontroller kullanarak tazminat gerçekleştirin. Tazminat spektrum üst üste iki dedektör arasındaki kaldırmak için gereklidir. Tazminat aptal kanıt değildir ile ilgili ve ne kadar parlak bir belirli belirteçler leke ve loş ve negatif popülasyonları arasındaki zayıf çözünürlüğü neden düşük otofloresans hücrelerin floresans olumsuz etkilenir. En iyi sonuç için, deneysel tasarım, düşük ifade veya bilinen bir boyanma paterni zorunda değilsiniz işaretleri ile parlak fluorochromes kullanarak içermelidir. Hücre popülasyonlarının ve yüksek olarak ifade edilir arasında iyi bir ayrım sağlayan belirleyicileri olanlar, kırmızı ya da mor lazerler tarafından heyecan gibi dimer fluorochromes kullanılmalıdır. <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Kappa ışık fare Ig zinciri, fare, sıçan / bir hamster için özel bir antikor birleştiğinde polistiren mikro tazminat boncuk, telafisi yapılabilir. Boncuklar, leke güçlü bir sinyal var ve deneysel numuneler, aynı fluorofor tek lekeli kontrolleri hazırlanması kolay bir yol sağlamak için kolaydır. </li><li> Forward scatter (FSC) ve yan dağılım (SSC) ve bir histogramı görüntülemek için iki değişkenli bir komplo içeren bir şablon ayarlamaKullanılacak her florokrom. </li><li> Negatif kontrol tüpü çalıştırın ve forward scatter (FSC) ve yan dağılım (SSC) ölçekte ilgi nüfusu yerleştirmek için ayarlayın. </li><li> Histogramın çok sol elini kısmı negatif nüfus veya otofloresans yere floresan PMT ayarlarını ayarlayın. </li><li> Negatif kontrol tüpü kaydedin. </li><li> Tek bir pozitif kontrol tüpleri çalıştırın ve her tüp için veri kaydı. </li><li> Histogram verileri olumlu kısmı, ve histogram negatif kısmını başka bir aralık kapı etrafında bir aralık kapı çizin. </li><li> Manuel tazminat ayarlayarak yapılır medyan medyan negatifleri eşit olana kadar pozitif (medyan ortalama logaritmik ölçekte daha merkezi eğilim daha iyi bir tahmin). Bu deneyde kullanılan florokrom etiket her biri için yapılmalıdır. </li><li> Medyan ayarlamak için, daha düşük veya yüksek her floresan parametre maç için medyan kadar mümkün olduğunca yakından spektral örtüşme değerleri ayarlayın. </li><li> Tazminat analiz yazılımı ile otomatik olarak yapılabilir. Otomatik tazminat deneyde kullanılan tüm fluorophores için cebirsel bir matris hesaplamak için tazminat kontrol kaydedilen verileri kullanır. Bu değerler, bir ana renk dedektör içine kanama olan birincil olmayan renk katkıları ortaya çıkarmak için kullanılır. </li></ol></li><li> Deneysel örnek sıralanabilir kaydedin ve ilgi nüfusu tanımlamak için yolluk araçları ve subsetting yöntemleri kullanabilirsiniz. <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> FSC vs SSC görüntüler ve kapı ilgi nüfusun bir yolluk aracı, çokgen, dikdörtgen, aralık veya kadranda bir nokta arsa ile deneysel şablonu ayarlayın. Scatter plot hücre hücre tipi farklı fiziksel özelliklerini görüntüler. </li><li> Floresan yolluk strateji belirlemenin en iyi yolu, floresan eksi bir (FMO) denetimleri kullanmak. FMO kontrol tüpü deneyde kullanılan tüm reaktifler, faiz biri için hariç dahildir. FMO loş lekeli nüfusları ve geniş negatif popülasyonları arasında ayrımcılık yardımcı olur. </li><li> FMO tüpler kapıları deney tüpü içinde nereye yerleştirileceğini belirlemek için kaydedilen verileri kullanın. </li></ol></li><li> Kapıları bir kez tespit edilmiştir, kapılar dış toplama tüpleri içine sıralamak için seçilebilir. Dört kapı (ya da popülasyonlar) bir defada mevcut enstrümantasyon göre düzenlenmiş olabilir. </li><li> 4 deneysel örnek tüp çalıştırın ° C, saptırma plakaları açın ve örnek sıralamak. 5 x 10 5 -1.5 x 10 6 hücre, 12 x 75 mm tüp ve 1.5 sıralanabilir x 10 6 - 4,5 x 10 6 hücre, 15 ml konik içine sıralanabilir . </li><li> Gerekli sayıda hücre elde edildikten sonra, elle sıralama durdurmak. </li><li> Sıralanmış hücre popülasyonlarının saflığını belirlemek için bir tür post-analiz gerçekleştirin. </li></ol> Temsilcisi sonuçları Biz burada fare dalak B ve CD4 T hücre sıralama (Şekil 1) sonuçları göstermiştir. Splenositlerin PE Texas Red-konjuge anti-fare B220, FITC-konjuge anti-fare TCRβ ve B hücreleri (B220 + TCRβ) ve CD4 T hücreleri (CD4 + TCRβ + tanımlamak için CD4 anti-fare Alexafluor-700-konjuge ile boyandı .) Sıralama BD FACS Aria aleti ile yapıldı. &gt; B hücre saflık sıralama sonra% 97 ve CD4 T hücre saflık&gt;% 98 idi. <img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Saflık dalak B hücreleri ve CD4 FACS sonra hücreler, T Fare splenositlerin anti-fare B220, TCRβ ve CD4 antikorları ile boyandı. B hücreleri için FACS B220 üzerinde yolluk BD FACS Aria kullanılarak gerçekleştirildi + TCRβ hücreleri (Şekil 1A, sol panelindeki, sağ alt kadranda). B hücreleri (Şekil 1A, sağ panel) saflığını belirlemek için bir post tür analizi yapıldı. B220 boyama, y ​​ekseni üzerinde x-ekseni ve TCRβ boyama gösterilir. FACS CD4-T hücreleri üzerinde yolluk aynı akış sitometresi kullanılarak yapıldı TCRβ + CD4 + hücreler (Şekil 1B, sol panelindeki, sağ üst kadranda). Sonrası bir sıralama analizi, CD4 T hücreleri (Şekil 1B, sağ panel) saflığı belirlemek için yapıldı. TCRβ boyama, x-ekseni ve y-ekseni üzerinde boyama CD4 gösterilmiştir. Her çeyrekte yüzde pozitif hücrelerin gösterilmiştir. <!--<img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Dalak CD4 Saflık FACS sonra T hücreleri, fare dalak T hücreleri B hücreleri kaldırılması kaydırma tarafından zenginleştirildi. Daha sonra, hücreler, anti-fare TCRβ ve CD4 antikoru (sol panel) ile boyandı. FACS TCRβ + CD4 + hücreler üzerinde yolluk BD FACS Aria kullanılarak yapıldı (sol panelinde, sağ üst dörtlüANT). % 99 daha fazla (sağ panel) T hücreleri, saflığını belirlemek için bir post tür analizi yapıldı. TCRβ boyama, x-ekseni ve y-ekseni üzerinde boyama CD4 gösterilmiştir. Her çeyrekte yüzde pozitif hücrelerin gösterilmiştir. -&gt;

<ol>
	<li>Herzenberg, L. A., De Rosa, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+and+the+FACS:+complementary+tools+for+immunobiology+and+medicine.">Monoclonal antibodies and the FACS: complementary tools for immunobiology and medicine.</a> Immunol Today. 21, 383-390 (2000).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow cytometry first principles. , 273-273 (2001).</li><li>Hewitt, Z., Forsyth, N. R., Waterfall, M., Wojtacha, D., Thomson, A. J., McWhir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+single+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cells.">Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells.</a> Cloning Stem Cells. 8, 225-234 (2006).</li><li>Walker, A., Parkhill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genomics.">Single-cell genomics.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 176-177 (2008).</li><li>Sorensen, T. U., Gram, G. J., Nielsen, S. D., Hansen, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+sorting+of+GFP-transduced+live+cells+for+subsequent+culture+using+a+modified+FACS+vantage.">Safe sorting of GFP-transduced live cells for subsequent culture using a modified FACS vantage.</a> Cytometry. 37, 284-290 (1999).</li><li>Diamond, R. A., DeMaggio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In living color: Protocols in flow cytometry and cell sorting. , 800-800 (2000).</li><li>Karabinus, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+sorting+of+human+sperm:+MicroSort+clinical+trial+update.">Flow cytometric sorting of human sperm: MicroSort clinical trial update.</a> Theriogenology. 71, 74-79 (2009).</li><li>Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seventeen-colour+flow+cytometry:+unravelling+the+immune+system.">Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).</li><li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+flow+cytometry+data:+a+guide+for+the+perplexed.">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nat Immunol. 7, 681-685 (2006).</li><li>Tung, J. W., Heydari, K., Tirouvanziam, R., Sahaf, B., Parks, D. R., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+flow+cytometry:+a+practical+approach.">Modern flow cytometry: a practical approach.</a> Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).</li></ol>

FACS sıralanmış nüfusun çok yüksek saflıkta (% 95-100) elde edilebilir, hangi faiz hücre popülasyonlarının, arındırıcı için son derece gelişmiş bir tekniktir. Bu nedenle, bu teknik deneyler, yüksek saflıkta için temel bir gereklilik (örneğin mikroarray analizi) için özellikle önemlidir. FACS aynı yüzey marker ifade farklı düzeylerde sahip olduğu iki veya daha fazla nüfus arındırılması gerekir bir hücre haftalık ifade yüzey işaretleyici dayalı nüfus saflaştırılmış gereken veya mevcut diğer arıtma yöntemlerine göre oldukça avantajlı. Örneğin, marjinal bölge arıtma B hücreleri (B220 + CD21 hi CD23 int / düşük) ve foliküler B hücreleri (B220 + CD21 int / düşük CD23 yüksek), CD21 ve CD23 ekspresyon düzeyleri dayalı . FACS büyüyen diğer bir uygulama, tek tek hücrelerin analizi (3, 4) izin veren tek bir hücre sıralama. FACS da yaygın tür hücrelere, gibi yeşil flüoresan protein etiketli proteinleri (5) gibi genetik olarak ifade edilir floresan proteinleri ifade kullanılır. Steril bir sıralama yapılırsa hücrelerin kültür olabilir. Ancak, hücre canlılığı ve verim sıralama sırasında tehlikeye girebilir. Canlılık, sıralama için bir hücre bağımlı optimum sıcaklık ve kapasite ulaştıktan sonra hemen toplama tüpleri işleme geliştirilebilir. Kurtarma, polipropilen toplama tüpleri kullanarak, aralıklı serum zengin medya ve tersini alma tüpleri olarak sıralanır hücreleri toplamak optimal bir sıcaklık toplama tüpleri muhafaza ve ~ 10 dakika (http://cyto.mednet.ucla.edu sıralanmış hücreler santrifüj artabilir / Protocol.htm). Ultra yüksek hızda sorters klinik ortamlarda akış sıralama uygulama geliştirme imkanı genişletmiştir. FACS potansiyel klinik uygulamalar, insan kanı, insan sperm ve hastalığın erken tespitler (6, 7) sıralama terapötik amaçlarla, kanser tedavisi uygulamaları, amniyosentez değiştirme, kan kök hücre arıtma içerir. Çok renkli boyama, antikor seçimi kritik bir adımdır ve fluorochromes her bir araç için algılama sistemi olarak seçilmiştir. Kullanıcı ihtiyaçlarına göre hücre sorters ve lazer yapılandırma değişir satan şirketlerin bir dizi vardır. Böylece bir sadece uyumluluğu teyit olmadan Yayınlanan çalışmalarda kullanılan aynı antikorlar kullanamazsınız. Optimum antikor seçimi için, bir muayene olmak protein ekspresyon seviyesi göz önünde bulundurmalısınız. Genel olarak, en parlak florokrom etiketli antikorlar loş fluorochromes yüksek ifade yüzey belirteçleri (8) boyanması için kullanılabilir loş ifade yüzey belirteçleri leke olmalıdır. Buna ek olarak, antikorlar kendi emisyon spektrumları arasında üst üste böyle bir şekilde seçilmelidir minimum düzeydedir. Çok renkli boyama için, spektral örtüşme olduğunu florokrom seçmek için son derece zordur. Bu durumda, tazminat yapılır. Tazminat floresan dedektörleri (8-10) ölçülebilir çeşitli fluorochromes emisyon spektrumu arasındaki örtüşme matematiksel ortadan kaldırmak için gereklidir. Diğer bir deyişle, bir florokrom floresan örtüşme başka bir florokrom emisyon spektrumu çıkarılır. Tazminat hesaplama, çok renkli boyama (9, 10) için kullanılan her florokrom için lekesiz kontrolü ve tek pozitif kontrol gerektirir. Tazminat hücreleri veya boncuk kullanılarak yapılabilir. Boncuklar, leke güçlü bir sinyal var ve deneysel numuneler, aynı fluorophores tek lekeli kontrolleri hazırlanması kolay bir yol sağlamak için kolaydır. Tazminat boncuk ilgi hücre popülasyonu başlangıç ​​hücre popülasyonunu sınırlayan özellikle ilgi hücre yüzeyinde protein, düşük bir seviyede ifade edildiği zaman, avantajlı ve. Antikorlar seçilmiştir sonra, kendi faaliyet titrasyon analiz yaparak optimize edilmelidir. FACS makine çok güçlü lazerler varsa bu özellikle önemlidir. Suboptimal boyama antikor konsantrasyonlarının toplam hücre popülasyonunun istenilen hücre popülasyonunun kötü ayrımı neden olabilir. Yüksek antikor konsantrasyonlarının antijen non-spesifik boyanması için şansını artırır. Bu nedenle antikor titrasyon olumlu nüfus ve minimal arka plan boyama (8) maksimum parlaklık verir antikor konsantrasyonu seçimi sağlayacaktır. FACS hücre alt popülasyonlarının arıtma için standart bir tekniktir. Bu herhangi bir hücre tipi, tek bir hücre süspansiyonu oluşturulur ve istenilen hücre popülasyonunu belirlemek için antikorlar mevcuttur hangi ayırmak için kullanılabilir. FACS tercih edilen bir yöntemdir zaman highly saf hücre popülasyonlarının gereklidir.

purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (facs)

Deneysel ve klinik çalışmalarda genellikle hücre popülasyonları son derece saflaştırılmış gerektirir. FACS bilinen fenotip hücre popülasyonlarının arındırmak için tercih edilen bir tekniktir. Arınma diğer dökme yöntemleri kaydırma, tamamlayıcı tükenmesi ve manyetik boncuk ayırma içerir. Ancak, FACS, mevcut diğer yöntemlere göre bazı üstünlükleri vardır. FACS hedef hücre popülasyonu diferansiyel marker yoğunluğuna göre ayırma gerektiren çok düşük bir seviyede tespit marker ifade ya da hücre popülasyonlarının zaman, istenilen nüfusun çok yüksek saflıkta gerekli olan tercih edilen bir yöntemdir. Buna ek olarak, FACS gibi genetiği değiştirilmiş floresan protein marker olarak iç boyama ya da hücre içi protein ifade hücreleri izole etmek için sadece mevcut arıtma tekniğidir. FACS sağlar, tek tek hücrelerin boyutu, taneciklik ve floresan dayalı arıtma. Ilgi hücreleri arındırmak için, ilk, istenen hücre popülasyonu (1) özel yüzey belirteçleri tanır floresan monoklonal antikorlar (mAb) ile boyandı. Lekesiz hücrelerinin Negatif seçim de mümkündür. FACS arıtma kapasitesi ve uygun yazılım sıralama ile bir akış sitometresinin gerektirir. FACS, süspansiyon hücrelerin her biri bir lazer önünde tek bir hücre içeren damlacıklar bir akım olarak aktarılır. Floresan algılama sistemi hücreleri, hücrelerin önceden belirlenmiş floresan parametreler dayalı ilgi algılar. Cihaz ilgi ve elektrostatik saptırma sistemi, uygun toplama tüpleri (2) içine ücret damlacıkları toplama kolaylaştıran bir hücre içeren damlacık bir ücret geçerlidir. Boyama ve böylece sıralama tanımlayıcı belirteçler ve mAb seçim seçim başarısı büyük ölçüde bağlıdır. Saflık ve verim gereksinimine göre sıralama parametreleri ayarlanabilir. FACS, özel ekipman ve personel eğitimi gerektirmesine rağmen, hücre popülasyonlarının yüksek oranda saflaştırılmış izolasyonu için tercih edilen bir yöntemdir.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS at JoVE.com

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Hücrelerin hücre popülasyonlarının bir biyolojik ve kimyasal analiz gerektiren pek çok bilimsel çalışmalar için saflık yüksek bir devlet olmalıdır. Floresan aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), saf hücre popülasyonlarının elde etmek için üstün bir yöntemdir.

Floresan Aktive Hücre Ayırma (FACS) Özgül Hücre Nüfus Arıtma

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

purification-specific-cell-population-fluorescence-activated-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

72.5K Görüntüleme.  BloodCenter of Wisconsin. Hücrelerin hücre popülasyonlarının bir biyolojik ve kimyasal analiz gerektiren pek çok bilimsel çalışmalar için saflık yüksek bir devlet olmalıdır. Floresan aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), saf hücre popülasyonlarının elde etmek için üstün bir yöntemdir.

Video: Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Kompleman tükenmesi Özel Hücre Populasyonlarının tükenmesi

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Yaratma<em&gt; De Novo</em&gt; Merkezli Hemichain retroviral transdüksiyonu ile antijen-özel insan T hücre reseptörleri

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Algılama<em&gt; Trypanosoma brucei</emManyetik Aktif Hücre Sorting ve Akış Sitometrisi ile&gt; Varyant Yüzey Glikoprotein Değiştirme

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...