نود أن نشكر الدكتور بيل Cashdollar لدعمه في استخدام التدفق الخلوي الأساسية.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في العملية ، في البنود التالية يجب أن يتم جمعها وإعدادها ل: <ol style="list-style-type:lower-roman;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جليد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب مخروطية 15 مل لخلايا التلوين و× 12 ملم أنابيب تدفق 75 لتلطيخ الضوابط لون واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلطيخ العازلة : الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) + 3 ٪ الجنين مصل العجل (FCS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FC كتلة (إذا لزم الأمر) ، وتلطيخ الأضداد. الأضداد تحتاج إلى معاير لتلطيخ الأمثل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعويض الخرز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العازلة التعليق : محلول الملح المتوازن للهانك (HBSS) + 25 + HEPES ملي FCS 3 ٪ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التريبان الأزرق وعدادة الكريات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلية مصفاة (40 ميكرومتر نايلون) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن استخدام نوعين من أنابيب جمع أ) 12 X 75 مم أنابيب البوليسترين (FCS يحتوي على 300 و 25 ميكرولتر HEPES ملم) أو ب) 15 مل أنابيب مخروطية الشكل (1 مل تحتوي على السفح HEPES + 25 مم) : أنابيب جمع. ويمكن استخدام أي وسيلة غنية مع تركيز المصل عالية لمجموعة من الخلايا التي تم فرزها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء تعليق خلية واحدة من السكان خلية البداية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري : إثراء للسكان الخلية التي تريدها وسيلة لتنقية السائبة مثل استنفاد تكملة أو الفرز المغناطيسي. والميزة الرئيسية لتخصيب اليورانيوم الخطوة هو أنه يقلل من الوقت الفرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرة واحدة مع خلايا تلطيخ العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل وطاف resuspend الخلايا في تلطيخ العازلة عند تركيز تصل إلى 6 × 10 50 لتلطيخ كفاءة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري : للحصول على الخلايا معربا عن مستويات عالية من FCR ، وكتلة مستقبلات باستخدام الأسلوب المناسب حظر. وهناك طريقة الاختيار هو استخدام خريطة موقع الذي يربط لFcγR على الجليد لمدة 10-15 دقيقة. هذه الأجسام المضادة متوفرة تجاريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة خريطة موقع مناسب (عند تركيز محدد سلفا) إلى وصمة عار للسكان الخلية المطلوبة واحتضان لمدة 20-30 دقيقة على الجليد في الظلام ، ثم يغسل مع اثنين من تلطيخ العازلة. اختياري : يلطخ مع صبغة حيوية ، مثل يوديد propidium ، يمكن أن تدرج على تمييز الخلايا الميتة (5). إذا متعددة الألوان تلطيخ لاستخدامه ، وهناك حاجة لضوابط لون واحد. نستخدم CompBeads دينار بحريني للتحضير الضوابط لون واحد باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم تكن تستخدم الأجسام المضادة مترافق مباشرة ، كرر الخطوة 7 باستخدام الأجسام المضادة المناسبة الثانوية أو المتقارن Streptavidin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الغسيل ، resuspend الخلايا في مستنبت وتحديد تركيز الخلية باستخدام صبغة حيوية مثل الأزرق التريبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط خلية إلى تركيز 15-20 × 10 6 / مل. بالنسبة للسكان الخلية التي تشكل كتل ، والتي يمكن أن تسد الصك أثناء الفرز ، وتصفية الخلايا من خلال مصفاة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء وتحسين فارز الخلايا. وتتنوع عملية إنشاء تدفق عداد الكريات اعتمادا على تصنيع ويحتاج إلى أن يقوم بها الأفراد المدربين بشكل مناسب. التوصيات العامة هي كما يلي : <ol style="list-style-type:lower-roman;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد فوهة المناسبة تبعا لنوع الخلية المراد فرزها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأنواع عقيمة ، تعقيم الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء أداة مراقبة الجودة للتحقق من الخرز مع الليزر تعمل ، ومن الفرز بدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت الجهاز جمع المطلوبة وإعداد الجداول الجانبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظرة على الليزر الصك وكشف عن تشكيل لتحديد تسميات الفلورسنت التي يمكن استخدامها (دينار بحريني لدينا نظام مراقبة الأصول الميدانية الأغنية ثلاثة الليزر ويمكن الكشف عن ما يصل الى تسعة ألوان). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة فإنه يتم تحديد ما سيتم استخدام تسميات فارز الفلورسنت على الخلية ، يمكن إجراء التعويض (كما هو موضح أدناه). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء التعويض باستخدام عينة السيطرة السلبية والضوابط واحدة إيجابية. التعويض هو ضروري لإزالة التداخل بين اثنين من الطيف كاشفات. من المهم أن نلاحظ أن التعويض لا تخدع دليلا وتتأثر سلبا من قبل كيف علامات معينة الزاهية وصمة عار ، ومضان من الخلايا التي تألق ذاتي منخفض والتي يمكن أن تؤدي إلى قرار الفقراء بين السكان قاتمة وسلبية. للحصول على أفضل النتائج ، يجب أن يتضمن التصميم التجريبي باستخدام fluorochromes مشرق مع علامات التعبير التي لديها منخفضة أو التي ليس لديها نمط تلطيخ معروفة. وينبغي استخدام علامات الفصل التي توفر جيدة بين السكان الخلية ويتم التعبير عن غاية مع fluorochromes ثنائيات مثل تلك ولع الليزر الأحمر أو البنفسجي. <ol style="list-style-type:lower-roman;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعويض لا يمكن أن يؤديها مع حبات التعويض ، والتي هي البوليسترين المجهرية الدقيقة التي اقترنت إلى الضد محددة للضوء سلسلة من كابا الإيج من الجرذان والفئران ، أو الجرذان / الهامستر. حبات سهلة وصمة عار ، وإشارة قوية وتوفر طريقة سهلة لإعداد ضوابط الملون واحد التي لديها fluorophore نفس العينات التجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد قالب يتضمن مؤامرة ثنائي المتغير لعرض مبعثر إلى الأمام (FSC) والتشرذم الجانب (SSC) ، والمدرج واحد لكل ملون تألقي التي سيتم استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل أنبوب السيطرة السلبية وضبط مبعثر إلى الأمام (FSC) والتشرذم الجانب (SSC) لوضع السكان لسعر الفائدة على نطاق واسع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط إعدادات PMT مضان لوضع السكان سلبية أو تألق ذاتي في الجزء الأيسر بكثير من الرسم البياني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل أنبوب السيطرة السلبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل واحدة أنابيب مراقبة إيجابية وتسجيل بيانات كل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم البوابة الفاصلة حول الجزء الإيجابي من البيانات الموجودة على المدرج ، وآخر البوابة الفاصلة على الجزء السلبي من المدرج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم التعويض عن طريق ضبط الخط الناصف (المتوسط ​​هو أفضل تقدير للنزعة المركزية من الوسط على مقياس لوغاريتمي) من ايجابيات حتى يساوي وسيطة من السلبيات. ويجب أن يتم ذلك لكل من التسميات ملون تألقي المستخدمة في التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضبط وسيطة ، وضبط تداخل القيم الطيفية إما أعلى أو أقل حتى الوساطات عن كل مباراة المعلمة الفلورسنت قدر الإمكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا أن يتم التعويض تلقائيا مع برامج التحليل. التعويض التلقائي يستخدم البيانات المسجلة من الضوابط التعويض لحساب مصفوفة الجبرية عن جميع fluorophores المستخدمة في التجربة. وتستخدم هذه القيم للطرح من مساهمات من الألوان غير الأساسية التي هي نزيف في الكشف عن لون الأساسي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل العينة التجريبية ليتم فرزها واستخدام أدوات وأساليب تبوب subsetting لتعريف السكان من الاهتمام. <ol style="list-style-type:lower-roman;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد قالب تجريبية مع مؤامرة التي تعرض نقطة مقابل FSC SSC واستخدام أداة النابضة ، المضلع ، المستطيل ، الفاصل الزمني أو رباعي لبوابة السكان من الاهتمام. المؤامرة مبعثر يعرض الخصائص الفيزيائية للخلية التي تتميز إلى نوع من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أفضل طريقة لتحديد استراتيجية تبوب الاستشعاع استخدام مضان ناقص واحد التحكم (FMO). التحكم في أنبوب FMO يتم تضمين كافة الكواشف المستخدمة في التجربة باستثناء واحدة من الفائدة. ويساعد FMO تميز بين السكان الملون بشكل خافت والسكان سلبية واسعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البيانات المسجلة من أنابيب FMO لتحديد مكان وضع البوابات داخل أنبوب التجريبية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم تحديد البوابات ، يمكن تحديد بوابات للفرز في أنابيب جمع الخارجية. يمكن فرز ما يصل إلى أربعة أبواب (أو السكان) في وقت واحد اعتمادا على الأجهزة المتوفرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل أنبوب العينة التجريبية في 4 درجات مئوية ، بدوره على لوحات انحراف ، ونوع العينة. يمكن فرز 10 5 5 × -1.5 × 10 6 خلايا في أنبوب × 12 ملم 75 و 1.5 × 10 6-4،5 يمكن فرز × 10 6 الخلايا المخروطية الى 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم الحصول على العدد المطلوب من الخلايا ، ووقف الفرز يدويا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تحليل بعد الفرز لتحديد نقاء السكان الخلية التي تم فرزها. </li></ol> ممثل النتائج وقد أظهرت النتائج لأننا هنا ب الماوس الطحال وCD4 فرز الخلايا التائية (الشكل 1). وكانت ملطخة Splenocytes تكساس مع PE الأحمر مترافق المضادة للماوس B220 ، TCRβ المضادة للماوس FITC - مترافق وAlexafluor - 700 - مترافق مكافحة CD4 الماوس لتحديد الخلايا B (B220 + TCRβ) CD4 T والخلايا (CD4 + + TCRβ ). تم إجراء الفرز مع صك دينار بحريني الأغنية FACS. بعد فرز الخلايا B والنقاء&gt; كان 97 ٪ والخلايا التائية CD4 الطهارة&gt; 98 ٪. <img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. نقاء خلايا الطحال وباء CD4 T الخلايا بعد FACS. كانت ملطخة splenocytes الماوس المضادة للماوس TCRβ ، B220 والأضداد CD4. تم تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية للخلايا B باستخدام FACS دينار بحريني الأغنية التي تبوب على B220 + TCRβ خلايا (الشكل 1A ، اللوحة اليسرى ، الربع السفلي الأيمن). وأجري تحليل لتحديد نوع آخر على نقاء الخلايا B (الشكل 1A ، اللوحة اليمنى). ويرد تلطيخ B220 على محور x وتلطيخ TCRβ على محور ذ. تم تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية للخلايا CD4 T باستخدام نفس تدفق عداد الكريات تبوب على TCRβ خلايا CD4 + + (الشكل 1B ، اللوحة اليسرى ، رباعي العلوية اليمنى). وأجري تحليل نوع آخر لتحديد نقاء الخلايا التائية CD4 (الشكل 1B ، اللوحة اليمنى). ويرد تلطيخ TCRβ على المحور x و CD4 تلطيخ على محور ذ. يظهر الخلايا إيجابية في المئة في كل رباعي. <!--<img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. نقاء CD4 الطحال وقد أثرى الخلايا التائية بعد FACS. الفئران الخلايا التائية الطحال عن طريق إزالة الخلايا باء بحلول بالغسل. في وقت لاحق ، تم صبغ الخلايا المضادة للماوس TCRβ CD4 والأضداد (اللوحة اليسرى). تم تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام FACS دينار بحريني الأغنية التي تبوب على TCRβ + + خلايا CD4 (اللوحة اليسرى ، quadr اليمنى العلياالنمل). وأجري تحليل نوع آخر لتحديد نقاء الخلايا التائية ، التي كانت أكبر من 99 ٪ (اللوحة اليمنى). ويرد تلطيخ TCRβ على المحور x و CD4 تلطيخ على محور ذ. يظهر الخلايا إيجابية في المئة في كل رباعي. --&gt;

<ol>
	<li>Herzenberg, L. A., De Rosa, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+and+the+FACS:+complementary+tools+for+immunobiology+and+medicine.">Monoclonal antibodies and the FACS: complementary tools for immunobiology and medicine.</a> Immunol Today. 21, 383-390 (2000).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow cytometry first principles. , 273-273 (2001).</li><li>Hewitt, Z., Forsyth, N. R., Waterfall, M., Wojtacha, D., Thomson, A. J., McWhir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+single+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cells.">Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells.</a> Cloning Stem Cells. 8, 225-234 (2006).</li><li>Walker, A., Parkhill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genomics.">Single-cell genomics.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 176-177 (2008).</li><li>Sorensen, T. U., Gram, G. J., Nielsen, S. D., Hansen, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+sorting+of+GFP-transduced+live+cells+for+subsequent+culture+using+a+modified+FACS+vantage.">Safe sorting of GFP-transduced live cells for subsequent culture using a modified FACS vantage.</a> Cytometry. 37, 284-290 (1999).</li><li>Diamond, R. A., DeMaggio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In living color: Protocols in flow cytometry and cell sorting. , 800-800 (2000).</li><li>Karabinus, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+sorting+of+human+sperm:+MicroSort+clinical+trial+update.">Flow cytometric sorting of human sperm: MicroSort clinical trial update.</a> Theriogenology. 71, 74-79 (2009).</li><li>Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seventeen-colour+flow+cytometry:+unravelling+the+immune+system.">Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).</li><li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+flow+cytometry+data:+a+guide+for+the+perplexed.">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nat Immunol. 7, 681-685 (2006).</li><li>Tung, J. W., Heydari, K., Tirouvanziam, R., Sahaf, B., Parks, D. R., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+flow+cytometry:+a+practical+approach.">Modern flow cytometry: a practical approach.</a> Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).</li></ol>

FACS هي تقنية متطورة للغاية لتنقية السكان خلية من الفائدة ، والتي يمكن من خلالها الحصول على درجة نقاوة عالية جدا (95-100 ٪) من السكان التي تم فرزها. لذلك ، هذه التقنية أهمية خاصة بالنسبة للتجارب ، حيث نقاء عالية شرط أساسي (على سبيل المثال ميكروأري التحليل). FACS هو مفيد خاصة خلال الأساليب الأخرى المتاحة للتنقية عندما السكان الخلية يحتاج إلى تنقية استنادا إلى السطح وأعرب علامة الأسبوعية أو عند اثنين أو أكثر من السكان بحاجة إلى تنقية التي لديها مستويات مختلفة من التعبير عن علامة السطح نفسه. على سبيل المثال ، منطقة هامشية تنقية الخلايا B (B220 + CD21 CD23 INT مرحبا / منخفض) ومسامي الخلايا B (B220 + CD21 INT ​​/ منخفضة مرحبا CD23) على أساس مستويات التعبير عن CD21 CD23 و. تطبيق آخر هو تزايد FACS احد الفرز الخلية مما يتيح للتحليل الخلايا الفردية (3 ، 4). كما FACS تستخدم عادة لفرز الخلايا معربا عن البروتينات الفلورية التي أعرب وراثيا ، مثل البروتينات الخضراء بروتين فلوري الموسومة (5). يمكن إذا تم تنفيذ عملية الفرز تكون عقيمة مثقف الخلايا. ومع ذلك ، يمكن أن يتعرض للخطر بقاء الخلية والمحصول أثناء الفرز. ويمكن تحسين الجدوى باستخدام الخلايا التي تعتمد على درجة الحرارة المثلى لفرز ومعالجة الأنابيب بعد جمع فورا ان تصل القدرة. ويمكن زيادة الاسترداد باستخدام أنابيب جمع البولي بروبلين ، وجمع الخلايا مرتبة في وسائل الإعلام الغنية المصل وأنابيب جمع عكس بشكل متقطع ، والحفاظ على أنابيب جمع في درجة حرارة مثلى والطرد المركزي لخلايا فرز 10 دقيقة ~ (http://cyto.mednet.ucla.edu / Protocol.htm). مددت تطوير فارزات عالية السرعة المتطرف في إمكانية تطبيق الفرز في ضبط تدفق السريرية. التطبيقات السريرية المحتملة تشمل نظام مراقبة الأصول الميدانية لتنقية الدم من الخلايا الجذعية من الدم البشري لأغراض علاجية ، وتطبيقات في علاج السرطان ، واستبدال بزل ، فرز الحيوانات المنوية البشرية المكتشفة والمرض في وقت مبكر (6 ، 7). لتلطيخ متعدد الألوان ، واختيار الأضداد هو خطوة حاسمة ، ويتم اختيار fluorochromes على أساس نظام الكشف عن كل وثيقة معينة. هناك عدد من الشركات التي تبيع فارزات الخلية ، ويختلف التكوين الليزر وفقا لاحتياجات المستخدم. وبالتالي لا يمكن للمرء ببساطة استخدام الأجسام المضادة الدقيقة نفسها التي استخدمت في الدراسات التي نشرت دون أن يؤكد التوافق. الأجسام المضادة لاختيار الأمثل ، ينبغي للمرء أن ينظر في مستوى التعبير عن بروتين يتم فحصها. بصفة عامة ، ينبغي استخدام ما هو متاح من ألمع ملون تألقي الأضداد الموسومة صمة عار على السطح علامات وأعرب خافت ، بينما يمكن استخدام fluorochromes قاتمة للتلوين علامات سطح أعرب للغاية (8). بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يتم تحديد الأجسام المضادة في مثل هذه الطريقة التي تتداخل بين الأطياف انبعاثاتها هو الحد الأدنى. لتلطيخ متعدد الألوان ، فإنه من الصعب للغاية في اختيار ملون تألقي التي لا تتداخل الطيفية. في هذه الحالة ، يتم تنفيذ التعويض. التعويضات اللازمة للقضاء على التداخل رياضيا مضان بين الطيف انبعاثات fluorochromes المختلفة التي يتم قياسها بواسطة أجهزة الكشف عن (8-10). وبعبارة أخرى ، هو مطروح التداخل مضان من ملون تألقي من طيف ملون تألقي انبعاثات أخرى. احتساب التعويض يتطلب مراقبة غير ملوثين والضوابط الإيجابية واحد لكل ملون تألقي تستخدم لتلوين متعدد الألوان (9 ، 10). ويمكن إجراء التعويض باستخدام الخلايا أو الخرز. حبات سهلة وصمة عار ، وإشارة قوية وتوفر طريقة سهلة لإعداد ضوابط الملون واحد التي لديها fluorophores نفس العينات التجريبية. الخرز التعويض هي مفيدة بشكل خاص عندما يتم التعبير عن بروتين سطح الخلية من الفائدة عند مستوى منخفض ، وعندما السكان خلية من الفائدة يحد من السكان الأولي خلية البداية. مرة واحدة وقد تم اختيار الأضداد ، ينبغي أن يكون الأمثل نشاطهم عن طريق إجراء تحليل المعايرة. وهذا أمر مهم لا سيما إذا كان الجهاز قد FACS يزر قوية للغاية. ويمكن استخدام تركيزات أدنى من الأضداد في تلطيخ نتيجة الفصل الفقيرة من السكان الخلية المطلوبة من مجموع السكان الخلية. استخدام تركيزات عالية جسم يزيد من فرصة لتلطيخ غير محددة مستضد. ولذلك سوف يسمح للمعايرة الأضداد اختيار تركيز الأجسام المضادة التي تعطي أقصى سطوع للسكان والحد الأدنى من تلطيخ إيجابية خلفية (8). FACS الآن تقنية موحدة لتنقية مجموعات سكانية فرعية من الخلايا. يمكن استخدامه لفصل أي نوع من الخلايا التي يمكن أن تتولد تعليق خلية واحدة والأجسام المضادة المتوفرة لتحديد السكان الخلية المطلوبة. FACS هو الأسلوب المفضل عند حighly مطلوبة السكان الخلية نقية.

purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (facs)

الدراسات التجريبية والسريرية غالبا ما تتطلب عالي النقاء السكان الخلية. FACS هو الاسلوب المفضل لتنقية السكان من النمط الظاهري الخلية المعروفة. معظم طرق أخرى للتنقية وتشمل بالغسل استنفاد تكمل ، وفصل حبة المغناطيسي. ومع ذلك ، FACS ديها العديد من المزايا أكثر من الأساليب الأخرى المتاحة. FACS هو الأسلوب المفضل عند الحاجة نقاء عالية جدا من السكان المطلوب ، عندما كان سكان الخلية المستهدفة يعبر عن مستوى منخفض جدا من علامة تحديد الخلية أو عند السكان تتطلب الفصل على أساس الكثافة علامة التفاضلية. بالإضافة إلى ذلك ، FACS هي التقنية الوحيدة المتاحة لتنقية عزل الخلايا استنادا إلى تلطيخ الداخلية أو بين الخلايا بروتين تعبير ، مثل علامة بروتين فلوري المعدلة وراثيا. FACS يسمح للتنقية من الخلايا الفردية القائمة على التفاصيل والحجم ومضان. من أجل تنقية الخلايا من الفائدة ، والملون لأول مرة مع fluorescently الموسومة الاجسام المضادة (ماب) ، التي تعترف علامات محددة على سطح الخلية المطلوبة للسكان (1). اختيار السلبية للخلايا غير ملوثين غير ممكن أيضا. FACS تنقية يتطلب تدفق عداد الكريات مع فرز القدرات والبرامج المناسبة. لنظام مراقبة الأصول الميدانية ، يتم تمرير الخلايا في التعليق كشرط تيار في قطرات مع بعضها تحتوي على خلية واحدة أمام ليزر. نظام الكشف عن مضان يكشف خلايا الفائدة استنادا المعلمات الفلورسنت محددة سلفا من الخلايا. الصك ينطبق تهمة إلى قطرة تحتوي على خلية من الفائدة ونظام كهرباء انحراف يسهل جمع قطرات المشحونة في أنابيب جمع المناسب (2). نجاح تلطيخ والفرز وبالتالي تعتمد بشكل كبير على اختيار علامات تحديد واختيار خريطة موقع. ويمكن تعديل معايير الفرز اعتمادا على شرط الطهارة والعائد. على الرغم من أن نظام مراقبة الأصول الميدانية يتطلب المعدات المتخصصة وتدريب الموظفين ، وهذا هو الأسلوب المفضل لعزل عالي النقاء السكان الخلية.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS at JoVE.com

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

لكثير من الدراسات العلمية التي تتطلب تحليلا والبيولوجية والكيميائية للسكان الخلية يجب أن تكون الخلايا في حالة عالية من النقاء. مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) هو الأسلوب الذي متفوقة في الحصول على خلايا نقي السكان.

تنقية سكان خلية معينة من قبل الإسفار الفرز الخلية المنشط (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

purification-specific-cell-population-fluorescence-activated-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

72.5K Views.  BloodCenter of Wisconsin. لكثير من الدراسات العلمية التي تتطلب تحليلا والبيولوجية والكيميائية للسكان الخلية يجب أن تكون الخلايا في حالة عالية من النقاء. مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) هو الأسلوب الذي متفوقة في الحصول على خلايا نقي السكان.

Video: Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

نضوب بالسكان خلية معينة من قبل استنفاد تكملة

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

توليد خلايا T - Multivirus محددة لمنع / علاج الالتهابات الفيروسية خيفي بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

مضان تنشيط الفرز الخليوي لتنقية الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل من الفأر نخاع العظم

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

توليد<em&gt; دي نوفو</em&gt; محددة مستضد تي الإنسان مستقبلات الخلية من قبل فيروسات تنبيغ من مركزية Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

الكشف عن<em&gt; المثقبية البروسية</em&gt; التبديل البديل البروتين السكري السطح بواسطة المغناطيسي خلية المنشط فرز والتدفق الخلوي

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

إنتشار الجزيئي في أغشية البلازما الخلايا اللمفاوية الابتدائية تقاس الإسفار الارتباط الطيفي

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

توليد عدد كبير من فروعه النقوي وسلائف الخلايا الجذعية من نخاع العظام مورين باستخدام خلية رواية فرز استراتيجية

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

في المختبر تشكيل الكلاب العَدلات فخ خارج الخلية: التحليل الكمي ودينامية بالفحص المجهري الأسفار

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

معالجة البروتوكول لتحليل نشر وحجم الكتلة من مستقبلات الغشاء بالفحص المجهري Fluorescence الصور

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...