Bu protokol, belirli primer nöronun arıtılması ve kültürlendirilmesi için basit ve tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlar. Bu kültürler elektrofizyolojik, morfolojik ve sağkalım analizleri için uygundur. Saflaştırılmış nöronların kültürleri nöronal fizyolojinin temellerini incelemek için kullanılabilir, sinaps oluşumu yanı sıra nöronal ağların nasıl geliştiğini.
Biz kortikal glutamaterjik ana hücreleri ve GABAerjik internöronlar odaklanmak iken, Bu prosedür kolayca floresan proteinleri ifade herhangi bir nöronal hatları incelemek için değiştirilebilir. Cam kapakları hazırlamak için, ilk mililitre PLL çözeltisi başına 200 mikrogram beş mililitre aliquot çözülme. Saf enjeksiyon sınıf su 45 mililitre ekleyerek mililitre başına 20 mikrogram bu stok çözeltisi seyreltin.
Daha sonra yeni bir 50 mililitrekonik tüp içine çözelti sterilize filtre ve PLL steril olarak bu tüp etiket. Daha sonra, steril PLL çözeltisi içinde 100 steril yuvarlak 12 milimetre cam kapakları yerleştirin. Hatta kaplama sağlamak için 2-3 dakika boyunca her beş ila 10 dakikada bir tüp çalkalayın.
PLL kaplama 40 dakika sonra, kağıt mendil iki adet almak ve akış kabininde düz yatıyordu. % 70 etanol kullanarak kağıt sterilize sonra kırışıklıkları kaldırmak ve kurumaya bırakın düzleştirmek. Cam kapakları PLL ile bir saat kaplandıktan sonra, fazla PLL çözeltisini çıkarın ve steril enjeksiyon sınıfı su ekleyin.
Fazla PLL'yi çıkarmak için coverlips'i 2-3 saniye boyunca hafifçe çalkalayın. Bu durulama adımLarını iki kez daha tekrarlayın. Fazla suyu çıkarın ve kapakları steril mendil kağıdına aktarın.
Kuruduktan sonra, 24 kuyu kültür plakası için kapakları aktarın. Hücre kültürü çözümlerini hazırlamak için, 15 mililitrelik konik tüp ve etiket için hücre kültürü tampon 12 mililitre dışarı ölçün BSA olarak. Farklı bir 15 mililitrelik tüp ve papain olarak etiket hücre kültürü tampon beş mililitre dışarı ölçün.
Daha sonra, 37 santigrat derece 15 dakika boyunca her iki tüpler kuluçka. BSA etiketli tüpe 120 miligram BSA ekleyin. Sonra çözeltiyi eritmek için tüp ters.
Sonra papain etiketli tüp papain yedi miligram ekleyin. Her iki tüpü de 15 dakika su banyosuna geri verin. Filtre taze bir konik tüp içine BSA çözeltisi sterilize.
Steril BSA çözeltisini üç tüpe bölün ve her tüpü BSA steril ve bir, iki veya üç olarak etiketlendirin. Şimdi filtre papain tüp sterilize ve papain steril olarak tüp etiket. Tüm tüpleri su banyosuna geri getirin ve kullanıma kadar 37 derecede kuluçkaya yatın.
Doku diseksiyonu için hazırlamak için, hipokampus ve korteksin diseksiyonu için gerekli neşter, makas, forseps ve spatula ortaya koy. Akış dolabına iki tane 35 milimetre Petri kabı ve steril filtre kağıdı içeren 100 milimetrelik Petri kabı yerleştirin. Transgenik NexCre toplamak; Ai9 veya vesiküler GABA taşıyıcı Venüs fare yavruları uygun uyarma ve emisyon filtreleri ile bir floresan lamba kullanılarak yabani tip litre arkadaşlarından floresan yavru ayırt etmek için incelenecek olan.
Hayvanları incelemeden hemen önce, her Petri kabını soğutulmuş steril hücre kültürü tamponuyla doldurun. Diseksiyondan sonra transgenik yavrunun beynini steril filtre kağıdına dikkatlice aktarın. İlk olarak, beyincik uzak incelemek ve iki yarımküreyi ayırın.
Sonra dikkatle her yarımküreden hipokampus ve korteks ayırın. Parçalanmış dokuyu soğutulmuş hücre kültürü tamponu içeren 35 milimetrelik Petri kabına aktarın. Sonra başka bir 35 milimetre Petri çanak kapağına parçalanmış hipokampus ve korteks aktarın.
Neşter bıçağının düz kenarını kullanarak, sadece küçük parçalar kalana kadar, dikkatlice bir crisscross hareket le doku doğrayın. Daha sonra, petri kabının kapağından steril papain tüpüne az miktarda papain çözeltisi ile doğranmış dokuyu aktarın. Dokuyu 37 derecede 25 dakika kuluçkaya yatırın.
Papain kuluçka sonra, akış kabine steril papain tüp ve steril BSA tüpleri aktarın. Sonra BSA tüp içine papain tüpü nden sadece kortikohippocampal doku aktarmak için bir mililitre Pasteur pipet kullanın. Doku herhangi bir büyük kümeleri kırmak için, bir mililitre Pasteur pipet kullanarak doku birkaç kez triturate.
Bunu takiben, ince uçlu Pasteur pipetkullanarak dokuyu yedi kez triturate. 30 saniye sonra, alt çözelti ve doku bir mililitre BSA tüp bir BSA tüp iki aktarın. BSA tüpündeki dokuyu ince uçlu Pasteur pipetkullanarak iki kez triturate.
Triturasyondan sonra, alt doku ve çözelti nin bir mililitresini BSA tüpünden bir mililitresini BSA tüpü üçüne aktarın. BSA tüpündeki dokuyu üç kez triturate. Triturasyondan sonra, tüm çözelti ve dokuyu 2 ve 3 numaralı tüplerden BSA tüpüne aktarın.
Üç dakika boyunca 3,000 kez g'de 2-3 kez daha triturate ve santrifüj. Santrifüjden sonra, peletli dokudaki süpernatantı dikkatlice çıkarın ve iki mililitre lik tam bir p1000 pipeti kullanarak hücreleri askıya alın Düşük floresan bir ortam. Daha sonra doku çözeltisinin tamamen yeniden uzaklaştırılmasını sağlamak için dokuyu 20 kez triturate.
Daha sonra, bir polistiren örnek tüp içine 30 mikrometre hücre elek ile hücre süspansiyon filer. 300 mikrolitre tam hazırda bekletme a ortamını gerekli sayıda polipropilen tüpe boru haline getirmek için hücre ayırma toplama tüplerini hazırlayın. Sıralanacak her floresan hücre tipi için uygun uyarma ve emisyon filtrelerini seçin.
488 nanometre uyarma dalga boyu kullanarak Venüs proteinini heyecanlandırın ve yayılan ışığı 530/40 emisyon filtre kümesinden algıla. 531 nanometre uyarma dalga boyu kullanarak TdTomato proteinini heyecanlandırın ve yayılan ışığı 575/30 emisyon filtre setinden algıla. Yüksek saflıkta, parlak etiketli floresan hücreleri sıralayın.
Hücre sıralamasını takiben, toplanan hücreleri iki mililitre yuvarlak alt santrifüj tüpüne aktarın. Sonra hücreleri 3,000 kez g'de üç dakika santrifüj edin ve bir hücre peleti oluşturun. Mikrolitre başına 1.000 hücre yoğunluğu elde etmek için önceden ısıtılmış tam NBA orta gerekli miktarda hücre pelet resuspend.
Ayrıştırılmış hücrelerin varlığını doğrulamak için, 4X veya 10X objektif lens kullanarak hücre çözümünü mikroskop altında kontrol edin. Hücreleri kaplamadan önce, eşit bir hücre süspansiyonu sağlamak için 2-3 saniye orta hızda girdap. Girdap takiben, hızlı bir şekilde pipet 10 mikrolitre hücre süspansiyon her coverslip merkezine.
Bir saat sonra, hücreleri 500 mikrolitre önceden ısıtılmış tam NBA ortamıile besleyin ve 37 santigrat derecede kuvöze dönün. Birlikte kültür saflaştırılmış nöronlar ve glial hücreler için, hücre kültürü ekler gerekli sayıda geçiş glial hücreleri. Bu tam NBA orta 500 mikrolitre damlacık 40, 000 glial hücreleri kaplama tarafından yapılır.
Bir saat sonra, transfer glial hücre kültürü saflaştırılmış nöronlar ekler. Kültür uçlarından fazla ortam çıkarın ve tabakları kültür için kuvöze geri döndürün. Başarılı sıralama sonrasında, kaplama nöronlar düzgün bir membran ile şeklinde yuvarlak görünmelidir ve in vitro yaklaşık bir saat sonra nöroidler yedek görülmelidir.
Yedi gün in vitro, bazı hücre ölümü belirgin olabilir rağmen, canlı hücreler tüm kültür koşullarında mevcut olmalıdır. Saflaştırılmış kültürlerin analizi hem glutamaterjik hem de GABAerjik nöronların hücre vücutlarından aksonları ve dendritleri genişletmeyi ve akım enjeksiyonlarını depolarize eden süper eşiklere yanıt olarak etki potansiyelleri üretme yeteneğini koruyabildiğini ortaya koymaktadır. Özellikle arınma aşağıdaki, sadece GABAerjik nöronlar spontan sinaptik iletim önemli miktarda aldı ve glutamaterjik nöronlar glial hücrelerin yokluğunda çok az sinaptik iletim aldı.
Daha da önemlisi, glial hücreleri ile saflaştırılmış nöronların kültüre nöron büyüme ve sağkalım yanı sıra glutamaterjik kültürlerde sinaptik iletim teşvik artırır. Kapakkapaklarının yeterli polarize kaplaması ve kültür ortamının fizyolojik pH'ının prosedür boyunca korunması kaliteli hücre kültürlerinin sağlanmasında anahtar dır. Bu protokolden sonra, belirli nöronal tiplerde transkripsiyonel süreçlerin araştırılmasını sağlayan saflaştırılmış kültürlerde RNA dizilimi ve protein kütle spektroskopisi yapılmalıdır.
