ברצוננו להודות Cashdollar ד&quot;ר ביל תמיכתו בשימוש Core cytometry הזרימה.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים את התהליך, את הפריטים הבאים צריכים להיות מוכנים אסף: <ol style="list-style-type:lower-roman;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל עבור תאים מכתים ו 12 x 75 מ&quot;מ עבור זרימת צינורות מכתים צבע שולט יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים חיץ: פוספט בופר סליין (PBS) + 3% עוברית עגל בסרום (FCS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipettes </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fc לחסום (אם נדרש) ונוגדנים מכתים. נוגדנים צריך להיות טיטרציה עבור מכתים אופטימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצוי חרוזים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ השעיה: תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypan כחול hemocytometer </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא מסננת (40 ניילון מיקרומטר) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף צינורות: שני סוגים של צינורות איסוף ניתן להשתמש א) 12 x 75 מ&quot;מ צינורות פוליסטירן (המכיל 300 FCS μl ו HEPES 25 מ&quot;מ) או ב) 15 מ&quot;ל צינורות חרוטי (המכיל 1 + 25 מ&quot;ל FCS HEPES mM). כל מדיום עשיר עם ריכוז בסרום גבוהה יכול לשמש אוסף של תאים ממוינים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור השעיה תא בודד של האוכלוסייה תא ההתחלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: להעשיר לאוכלוסייה התא הרצוי על ידי שיטה לטיהור בתפזורת כגון דלדול משלימים או מיון מגנטי. היתרון העיקרי של צעד ההעשרה היא שזה מפחית את זמן המיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם עם תאים מכתים חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend התאים מכתים חיץ בריכוז של עד 50 x 10 6 עבור מכתים יעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: עבור תאים להביע רמות גבוהות של FCR, לחסום את הקולטנים באמצעות שיטה חסימת המתאים. שיטת הבחירה היא השימוש MAB הנקשרת FcγR על קרח למשך 10-15 דקות. נוגדנים אלה זמינים מסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את מב המתאים (בריכוז קבוע מראש) להכתים את אוכלוסיית התאים הרצויים דגירה של 20-30 דקות על הקרח בחושך, ואחריו שני שוטף עם חיץ מכתים. אופציונלי: צביעה עם צבע חיוניים, כגון יודיד propidium, ניתן לכלול להבחין תאים מתים (5). אם צבע רב מכתים היא לשמש, צבע שולט יחיד נדרשים. אנו משתמשים CompBeads BD להכין צבע שולט יחיד באמצעות פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לא באמצעות נוגדנים מצומדות ישירות, חזור על שלב 7 באמצעות נוגדנים משני מתאים או המצומד streptavidin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, resuspend התאים בינוני תרבות לקבוע את ריכוז התאים בעזרת צבע חיוניים כגון Trypan כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הריכוז התא 15-20 x 10 6 / ml. לגבי אוכלוסיות תא אשכולות טופס, אשר עלול להדביק את המכשיר במהלך מיון, סינון התאים דרך מסננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת לייעל את סדרן התא. תהליך הגדרת זרימה cytometer מגוונת בהתאם בייצור צריך להיות מבוצע על ידי צוות מיומן כראוי. המלצות כלליות הן כדלקמן: <ol style="list-style-type:lower-roman;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את זרבובית המתאים בהתאם לסוג התא להיות מסודר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך מיני סטרילי, לעקר את המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע בקרת איכות מכשיר עם חרוזים לאמת לייזרים מתפקדים, והוא מיון במדויק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת המכשיר אוסף נדרש להגדיר את הזרמים בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תראו לייזר של המכשיר גלאי להגדיר כדי לקבוע את תוויות ניאון כי ניתן להשתמש (BD שלנו FACS Aria יש שלושה לייזרים יכול לזהות עד תשעה צבעים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שזה נקבע מה תוויות ניאון ישמש על סדרן התא, הפיצוי ניתן לבצע (כפי שמוסבר בהמשך). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פיצוי באמצעות מדגם שליטה שלילית שולטת חיובית אחת. פיצויים יש צורך להסיר את ספקטרום חפיפה בין שני הגלאים. זה רלוונטי לציין פיצוי שאינו טיפש הוכחה והוא מושפע לרעה כמה סמנים מסוימים כתם בהיר, ועל ידי הקרינה של תאים בעלי autofluorescence נמוך אשר יכול להוביל ברזולוציה נמוכה בין אוכלוסיות עמום שלילית. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, העיצוב הניסוי יכלול שימוש fluorochromes בהיר עם סמנים כי יש ביטוי נמוך או שאין להם דפוס מכתים ידוע. סמנים המספקים הפרדה טובה בין אוכלוסיות תאים באים לידי ביטוי מאוד להשתמש עם דימר fluorochromes כגון אלה נרגש לייזרים אדום או סגול. <ol style="list-style-type:lower-roman;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפיצוי ניתן לבצע עם חרוזים פיצויים, אשר microparticles קלקר, כי כבר מצמידים את נוגדן ספציפי שרשרת האור של איג קאפה מתוך עכבר, חולדה, או חולדה / אוגר. החרוזים קל כתם, יש אות חזקים מספקים דרך קלה להכנת שולטת מוכתם יחיד כי יש fluorophore זהה דגימות הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תבנית הכוללת עלילה bivariate לתצוגה פיזור קדימה (FSC) ולפזר צד (SSC), ואחד היסטוגרמה עבורכל fluorochrome אשר ישמשו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את שפופרת שליטה שלילי ולהתאים את פיזור קדימה (FSC) ולפזר לוואי (SSC) למקום אוכלוסייה של הריבית על קנה מידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ההגדרות PMT הקרינה למקום האוכלוסייה autofluorescence שלילי או בחלק השמאלי המרוחק של ההיסטוגרמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את שפופרת שליטה שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את צינורות יחיד מלאה חיובי ולהקליט את הנתונים עבור כל צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציור השער המרווח סביב החלק החיובי של נתוני היסטוגרמה, ועוד שער מרווח על החלק השלילי של ההיסטוגרמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפיצוי נעשה באופן ידני על ידי התאמת הממוצע (חציון הוא להעריך טוב יותר את הנטייה המרכזית מאשר הממוצע בסולם לוגריתמי) של תוצאות חיוביות עד שהוא שווה לחציון של הדברים השליליים. זה חייב להיעשות עבור כל התוויות fluorochrome השתמשו בניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתאים את החציון, להתאים את הערכים חפיפה ספקטרלית או גבוה או נמוך עד חציונים עבור כל משחק פרמטר פלורסנט ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפיצוי יכול להיעשות גם באופן אוטומטי עם תוכנת ניתוח. פיצוי אוטומטי משתמשת בנתונים רשמה שולטת פיצוי לחשב מטריצה ​​אלגברית לכל fluorophores השתמשו בניסוי. ערכים אלה משמשים כדי להפחית את התרומות הלא העיקרי צבעים דימום לתוך גלאי של צבע ראשוני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את מדגם ניסיוני להיות מסודר ולהשתמש בכלים gating ושיטות subsetting להגדיר את האוכלוסיות של עניין. <ol style="list-style-type:lower-roman;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תבנית ניסיונית עם עלילה נקודה המציג FSC מול SSC ו להשתמש בכלי gating, מצולע, מלבן, רווח או ברבע לשער האוכלוסייה של עניין. העלילה פיזור מציג את המאפיינים הפיזיים של התא אשר ברורים לסוג התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדרך הטובה ביותר לקבוע את אסטרטגיית gating הקרינה היא להשתמש פלואורסצנציה מינוס אחד (FMO) שולטת. בתוך שפופרת מלאה FMO ריאגנטים כל המשמשים בניסוי כלולים למעט עניין אחד. FMO מסייע להבחין בין אוכלוסיות מוכתם במעומעם אוכלוסיות שלילית רחבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש נתונים רשמה צינורות FMO כדי לקבוע היכן למקם את השערים בתוך שפופרת הניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השערים נקבעו, השערים ניתן לבחור למיון לתוך צינורות איסוף חיצוני. עד ארבעה שערים (או אוכלוסיות) ניתן למיין בבת אחת בהתאם המכשור זמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את שפופרת מדגם ניסיוני 4 ° C, להפעיל צלחות סטיה, ולמיין את המדגם. 5 x 10 x 10 5 -1.5 6 תאים ניתן למיין לתוך צינור 12 מ&quot;מ ו 75 x 1.5 x 10 6-4.5 x 10 6 תאים ניתן למיין לתוך 15 מ&quot;ל חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מספר נדרש של תאים התקבל, באופן ידני להפסיק מיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח שלאחר מיון כדי לקבוע את הטוהר של אוכלוסיות תאים ממוינים. </li></ol> נציג תוצאות הראינו כאן תוצאות עבור B עכבר הטחול ואת תא T מסוג CD4 מיון (איור 1). Splenocytes הוכתמו PE טקסס אדום מצומדות אנטי עכבר B220 TCRβ, אנטי עכבר FITC-מצומדות ו Alexafluor-700-מצומדות אנטי עכבר CD4 כדי לזהות תאים B (B220-TCRβ +) ו-T מסוג CD4 תאים (CD4 + + TCRβ ). מיון בוצעה עם מכשיר BD Aria FACS. לאחר מיון על טוהר תא B היה&gt; 97% ואת תא טוהר T מסוג CD4 היה&gt; 98%. <img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. טוהר של תאים B ו-T מסוג CD4 הטחול תאים לאחר FACS. Splenocytes עכבר הוכתמו עכבר אנטי, TCRβ B220 ו נוגדנים CD4. עבור תאים ב FACS בוצעה באמצעות FACS BD Aria gating על ידי B220 + TCRβ תאים (איור 1 א &#39;, הפאנל השמאלי, ברבע הימני התחתון). ניתוח מין הודעה בוצע על מנת לקבוע את הטוהר של תאים B (איור 1 א &#39;, הפאנל מימין). מכתים B220 מוצג על ציר ה-x ו מכתים TCRβ על ציר ה-Y. FACS עבור תאים מסוג CD4 T בוצעה באמצעות cytometer תזרים אותו על ידי gating על TCRβ + CD4 + תאים (איור 1B, הפאנל השמאלי, ברבע הימני העליון). ניתוח מין הודעה בוצע על מנת לקבוע את הטוהר של תאים מסוג CD4 T (איור 1B, פאנל מימין). מכתים TCRβ מוצגת על ציר ה-x ו CD4 מכתים על ציר ה-Y. התאים אחוז חיובי ברבע כל מוצג. <!--<img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. טוהר CD4 ותאי T הטחול לאחר FACS. Murine בתאי T הטחול היו מועשר על ידי הסרת תאים B על ידי panning. כתוצאה מכך, התאים היו מוכתמות אנטי עכבר TCRβ ו CD4 נוגדן (הפאנל השמאלי). FACS בוצעה באמצעות FACS BD gating על ידי Aria TCRβ + CD4 + תאים (הפאנל השמאלי, quadr הימנית העליונהנמלה). ניתוח מין הודעה בוצע על מנת לקבוע את הטוהר של ותאי T, אשר היה גדול מ 99% (פאנל מימין). מכתים TCRβ מוצגת על ציר ה-x ו CD4 מכתים על ציר ה-Y. התאים אחוז חיובי ברבע כל מוצג. -&gt;

<ol>
	<li>Herzenberg, L. A., De Rosa, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+and+the+FACS:+complementary+tools+for+immunobiology+and+medicine.">Monoclonal antibodies and the FACS: complementary tools for immunobiology and medicine.</a> Immunol Today. 21, 383-390 (2000).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow cytometry first principles. , 273-273 (2001).</li><li>Hewitt, Z., Forsyth, N. R., Waterfall, M., Wojtacha, D., Thomson, A. J., McWhir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+single+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cells.">Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells.</a> Cloning Stem Cells. 8, 225-234 (2006).</li><li>Walker, A., Parkhill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genomics.">Single-cell genomics.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 176-177 (2008).</li><li>Sorensen, T. U., Gram, G. J., Nielsen, S. D., Hansen, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+sorting+of+GFP-transduced+live+cells+for+subsequent+culture+using+a+modified+FACS+vantage.">Safe sorting of GFP-transduced live cells for subsequent culture using a modified FACS vantage.</a> Cytometry. 37, 284-290 (1999).</li><li>Diamond, R. A., DeMaggio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In living color: Protocols in flow cytometry and cell sorting. , 800-800 (2000).</li><li>Karabinus, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+sorting+of+human+sperm:+MicroSort+clinical+trial+update.">Flow cytometric sorting of human sperm: MicroSort clinical trial update.</a> Theriogenology. 71, 74-79 (2009).</li><li>Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seventeen-colour+flow+cytometry:+unravelling+the+immune+system.">Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).</li><li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+flow+cytometry+data:+a+guide+for+the+perplexed.">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nat Immunol. 7, 681-685 (2006).</li><li>Tung, J. W., Heydari, K., Tirouvanziam, R., Sahaf, B., Parks, D. R., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+flow+cytometry:+a+practical+approach.">Modern flow cytometry: a practical approach.</a> Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).</li></ol>

FACS היא טכניקה מתוחכמת ביותר לטיהור אוכלוסיות תאים בעלי עניין, שבה הטוהר גבוהה מאוד (95-100%) של האוכלוסייה מיון ניתן להשיג. לכן, טכניקה זו היא חשובה במיוחד עבור ניסויים, שבהם טוהר גבוהה היא תנאי הכרחי (למשל ניתוח microarray). FACS יתרון במיוחד על השיטות הזמינות האחרות של טיהור, כאשר האוכלוסייה התא צריך להיות מטוהרים מבוסס על סמן משטח השבועית הביע או כאשר שניים או יותר אוכלוסיות צריכים להיות מטוהרים אשר יש רמות שונות של ביטוי סמן את פני השטח אותו. לדוגמה, טיהור אזור שוליים B תאים (B220 + CD21 CD23 היי int / נמוך) ו-B פוליקולרית תאים (B220 + CD21 int / נמוך היי CD23) בהתבסס על רמות ביטוי של CD21 ו - CD23. יישום נוסף הוא גדל והולך של FACS מיון תא יחיד ומאפשר ניתוח של תאים בודדים (3, 4). FACS הוא גם נפוץ בתאי מין הבעת חלבוני ניאון כי הם הביעו גנטית, כגון חלבונים חלבון פלואורסצנטי ירוק מתויג (5). אם מעין סטרילי מתבצע התאים יכול להיות מתורבת. עם זאת, כדאיות התא ואת התשואה אפשר להתפשר במהלך המיון. הכדאיות ניתן לשפר באמצעות תא תלויי טמפרטורה אופטימלית למיון ועל ידי צינורות עיבוד אוסף מיד אחרי שהם מגיעים קיבולת. השחזור ניתן להגדיל באמצעות אוסף צינורות פוליפרופילן, איסוף תאים ממוינים מדיה עשירה בסרום וצינורות אוסף היפוך לסירוגין, שמירה על צינורות אוסף בטמפרטורה אופטימלית centrifuging תאים ממוינים דקות 10 ~ (http://cyto.mednet.ucla.edu / Protocol.htm). הפיתוח של מהירות גבוהה במיוחד sorters האריך את האפשרות של יישום של מיון תזרים במסגרות קליניות. יישומים קליניים הפוטנציאל של FACS כוללים טיהור בתאי גזע של דם דם אדם למטרות טיפוליות, יישומים בטיפול בסרטן, החלפת בדיקת מי שפיר, מיון זרע אנושי לתגליות המחלה מוקדם (6, 7). עבור מכתים ססגוניות, מבחר נוגדן היא צעד קריטי fluorochromes נבחרים מבוסס על מערכת זיהוי כל מכשיר מסוים. ישנן מספר חברות שמוכרות sorters התא התצורה לייזר משתנה לפי צרכי המשתמש. לכן אי אפשר פשוט להשתמש נוגדנים בדיוק משמש מחקרים שפורסמו ללא אישור תאימות. עבור מבחר נוגדן אופטימלי, יש לשקול את רמת הביטוי של החלבון הנבדק. באופן כללי, נוגדנים הבהיר fluorochrome-tagged זמין צריך לשמש כתם סמנים השטח לידי ביטוי עמום, בעוד fluorochromes עמום יכול לשמש מכתים את פני השטח של סמנים הביע ביותר (8). בנוסף, נוגדנים יש לבחור בצורה כזאת, כי חפיפה בין ספקטרום הפליטה שלהם היא מינימלית. עבור מכתים ססגוניות, קשה מאוד לבחור fluorochrome כי אין חפיפה ספקטרלית. במצב זה, פיצוי מבוצע. פיצויים יש צורך לחסל את מתמטית חפיפה בין ספקטרום הקרינה את פליטות של fluorochromes שונים זה שניתן לכמת ידי גלאי (80-10). במילים אחרות, חופפים את הקרינה מאחד fluorochrome מופחת ספקטרום פליטת אחר fluorochrome. חישוב הפיצוי דורש שליטה בלא כתם בקרות חיובי יחיד לכל fluorochrome המשמש מכתים ססגוניות (9, 10). הפיצוי ניתן לבצע באמצעות תאים או חרוזים. החרוזים קל כתם, יש אות חזקים מספקים דרך קלה להכנת שולטת מוכתם יחיד כי יש fluorophores זהה דגימות הניסוי. חרוזים פיצויים הם יתרון במיוחד כאשר שטח פני התא חלבון עניין מתבטאת ברמה נמוכה וכאשר אוכלוסיית תאים של הריבית הגבלת באוכלוסייה התא הראשוני ההתחלה. לאחר נוגדנים נבחרו, הפעילות שלהם צריך להיות מותאם על ידי ביצוע ניתוח טיטרציה. הדבר חשוב במיוחד אם המכשיר FACS יש לייזרים רבי עוצמה ביותר. השימוש בריכוזים הכי מוצלח של נוגדנים מכתים יכול לגרום ההפרדה עניים האוכלוסייה התא הרצוי מתוך האוכלוסייה תא מוחלט. השימוש ריכוזי נוגדנים גבוה מגביר את הסיכוי מכתים אנטיגן בלתי ספציפי. לכן טיטרציה נוגדן יאפשר את הבחירה של ריכוז הנוגדנים שנותן בהירות מקסימלית של האוכלוסייה חיובית מכתים רקע מינימלי (8). FACS עכשיו היא טכניקה תקן לטיהור של subpopulations של תאים. זה יכול לשמש כדי להפריד כל סוג התא שבו ההשעיה תא בודד ניתן להפיק נוגדנים זמינים כדי לזהות את האוכלוסייה התא הרצוי. FACS היא השיטה של ​​בחירה כאשר highly אוכלוסיות תאים טהור נדרשים.

purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (facs)

מחקרים ניסיוניים וקליניים לעיתים קרובות דורשים מטוהרים מאוד אוכלוסיות תאים. FACS היא טכניקה של בחירה כדי לטהר אוכלוסיות תאים של פנוטיפ ידוע. עיקר שיטות אחרות של טיהור כוללות צילום פנורמי, דלדול להשלים חרוז הפרדה מגנטי. עם זאת, FACS יש מספר יתרונות על פני השיטות הזמינות האחרות. FACS היא השיטה המועדפת כאשר הטוהר גבוהה מאוד של האוכלוסייה הרצויה נדרשת, כאשר האוכלוסייה תא היעד מבטא רמה נמוכה מאוד של הסמן, או כאשר זיהוי אוכלוסיות תאים דורשים הפרדה על בסיס צפיפות סמן ההפרש. בנוסף, FACS היא הטכניקה רק טיהור זמין לבודד תאים בהתבסס על מכתים פנימי או ביטוי חלבונים תאיים, כגון סמן מהונדסים גנטית חלבון פלואורסצנטי. FACS מאפשרת טיהור של תאים בודדים גרעיניות על בסיס גודל, פלואורסצנטי. על מנת לטהר את התאים של עניין, הם מוכתמים הראשון עם fluorescently-tagged נוגדנים חד שבטיים (מב), אשר מזהה סמנים ספציפיים על פני האוכלוסייה התא הרצוי (1). סלקציה שלילית של תאים בלא כתם הוא גם אפשרי. טיהור FACS דורש cytometer לזרום עם מיון קיבולת התוכנה המתאים. עבור FACS, תאים ההשעיה מועברים כזרם בטיפות עם שכל אחת מהן מכילה תא בודד מול לייזר. מערכת גילוי הקרינה מזהה תאים של עניין על פי פרמטרים שנקבעו מראש ניאון של התאים. מכשיר חל חיוב אגל המכיל תא עניין ומערכת סטיה אלקטרוסטטי מקלה אוסף של טיפות טעון לתוך צינורות איסוף המתאים (2). ההצלחה של מכתים ובכך מיון תלוי במידה רבה על הבחירה של סמנים לזיהוי הבחירה של MAB. פרמטרים של מיון יכול להיות מותאם בהתאם לדרישה של טוהר ואת התשואה. למרות FACS דורש ציוד מיוחד והכשרה אדם, היא שיטת הבחירה של בידוד מטוהרים מאוד אוכלוסיות תאים.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS at JoVE.com

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

עבור מחקרים מדעיים רבים הדורשים ניתוח ביולוגי וכימי של אוכלוסיות תאים תאים חייב להיות במצב גבוה של טוהר. תא Fluorescence מיון מופעל (FACS) היא שיטה מעולה בו כדי להשיג אוכלוסיות תאים טהור.

טיהור אוכלוסייה תאים ספציפיים על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

purification-specific-cell-population-fluorescence-activated-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

72.5K Views.  BloodCenter of Wisconsin. עבור מחקרים מדעיים רבים הדורשים ניתוח ביולוגי וכימי של אוכלוסיות תאים תאים חייב להיות במצב גבוה של טוהר. תא Fluorescence מיון מופעל (FACS) היא שיטה מעולה בו כדי להשיג אוכלוסיות תאים טהור.

Video: Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

דלדול של אוכלוסיות תאים ספציפיים על ידי דלדול משלים

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

דור Multivirus ספציפיים תאים T כדי למנוע / לטפל זיהומים נגיפיים לאחר השתלת allogeneic תא גזע hematopoietic

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

יצירה<em&gt; דה נובו</em&gt; לקולטנים המצויים בתאי אנטיגן ספציפי האדם T על ידי retroviral התמרה של Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

איתור של<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; מיתוג גליקופרוטאין Surface Variant ידי מגנטי Activated Cell מיון cytometry זרימה

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

דיפוזיה מולקולרית פלזמה ממברנות יסודי לימפוציטים נמדד באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

דור מספר גדול של תאים מיאלואידים אבות ו מבשרי תא דנדריטי ממח העצם מאתר באמצעות תא הרומן מיון אסטרטגיה

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

עיבוד פרוטוקול עבור הניתוח של פעפוע וגודל האשכול של קולטני ממברנה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ תמונה

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...