Name: purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (facs)
Uploaded: 2010-07-10T18:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
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Wir möchten Dr. Bill Cashdollar für seine Unterstützung in der Verwendung der Durchflusszytometrie Core-danken.

<ol><li> Vor Beginn des Prozesses, müssen die folgenden Punkte zu sein, gesammelt und aufbereitet: <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Eis </li><li> 15 ml konische Röhrchen zum Färben von Zellen und 12 x 75 mm Strömungsrohre zur Färbung einfarbig steuert. </li><li> Färbepuffer: Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) + 3% fötalem Kälberserum (FCS) </li><li> Pipetten </li><li> Fc-Block (falls erforderlich) und Färbung Antikörper. Antikörper müssen für eine optimale Färbung titriert werden. </li><li> Compensation Perlen </li><li> Suspensionspuffer: Hank Balanced Salt Solution (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS </li><li> Trypanblau und Hämozytometer </li><li> Zellsieb (40 um Nylon) </li><li> Sammlung Röhren: Zwei Arten von Sammelröhrchen können a) 12 x 75 mm Polystyrol-Röhrchen (mit 300 ul FCS und 25 mM HEPES) oder b) 15 ml konische Röhrchen (mit 1 ml FCS + 25 mM HEPES) werden. Jeder reiche Medium mit hoher Konzentration im Serum kann für die Sammlung von sortierten Zellen verwendet werden. </li></ol></li><li> Generieren Sie eine einzelne Zelle Aussetzung der ab-Zell-Population. </li><li> Optional: Bereichern Sie für die gewünschte Zellpopulation durch eine Bulk-Reinigungsverfahren wie Komplement Erschöpfung oder magnetische Sortierung. Der wesentliche Vorteil der Anreicherung Schritt ist, dass es die Art der Zeit reduziert. </li><li> Wash Zellen einmal mit Färbepuffer. </li><li> Überstand verwerfen und Zellen in Färbepuffer in einer Konzentration bis zu 50 x 10 6 zur effizienten Färbung. </li><li> Optional: Für Zellen, die ein hohes Maß an FcR, blockieren die Rezeptoren mit einem geeigneten Blocking-Methode. Eine Methode der Wahl ist die Verwendung eines mAb, die auf Eis für 10-15 min FcyR bindet. Diese Antikörper sind kommerziell erhältlich. </li><li> Fügen Sie die entsprechenden mAb (in einer vorbestimmten Konzentration) auf die gewünschte Zellpopulation Fleck und inkubieren für 20-30 min auf Eis im Dunkeln, durch zwei Waschungen mit Färbepuffer gefolgt. Optional: Die Färbung mit einem vitalen Farbstoff, wie Propidiumiodid kann enthalten, um tote Zellen (5) zu erkennen sein. Wenn Multi-Color-Färbung verwendet werden soll, sind einfarbig Kontrollen erforderlich. Wir verwenden BD CompBeads einzelne Farbe Kontrollen vorzubereiten mit dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Wenn nicht mit direkt konjugierten Antikörpern, wiederholen Sie Schritt 7 mit den entsprechenden Sekundär-Antikörper oder Streptavidin-Konjugat. </li><li> Nach dem Waschen die Zellen in Kulturmedium und bestimmen die Zellkonzentration mit einem vitalen Farbstoff wie Trypanblau. </li><li> Passen Sie die Zellkonzentration auf 15-20 x 10 6 / ml. Für Zellpopulationen, die Cluster bilden, die das Instrument bei der Sortierung können verstopfen, die Zellen-Filter durch ein Sieb. </li><li> Einrichten und optimieren die Zell-Sorter. Der Prozess der Einrichtung eines Durchflusszytometer variiert in Abhängigkeit von der Herstellung und muss von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. Die allgemeinen Empfehlungen lauten wie folgt: <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Wählen Sie die gewünschte Düse je nach Zelltyp, die sortiert werden. </li><li> Für sterile Sorten, sterilisieren das Instrument. </li><li> Führen Instrument der Qualitätskontrolle mit Perlen, um zu überprüfen Laser funktionieren, und es ist genau sortieren. </li><li> Installieren Sie die erforderlichen Auffangvorrichtung und richten Sie die Seite Streams. </li><li> Schauen Sie sich das Instrument der Laser und Detektor bis zum fluoreszierenden Markierungen, die verwendet werden (unser BD FACS Aria hat drei Lasern und können bis zu neun Farben zu erkennen) kann bestimmen, festgelegt. </li><li> Sobald festgestellt wird, was fluoreszierenden Markierungen auf der Zell-Sorter verwendet wird, kann Entschädigung durchgeführt werden (wie unten beschrieben) werden. </li></ol></li><li> Führen Ausgleich mit der negativen Kontrollprobe und die einzige positive Kontrollen. Kompensation ist notwendig, um das Spektrum Überschneidungen zwischen beiden Detektoren zu entfernen. Es muss darauf hingewiesen werden, dass eine Entschädigung nicht narrensicher und wird negativ durch, wie hell bestimmte Marker Fleck, und die Fluoreszenz der Zellen, die geringe Autofluoreszenz, die zu einer schlechten Auflösung zwischen dunkel und negativen Populationen führen kann betroffen sind. Für beste Ergebnisse sollte das experimentelle Design umfassen die Verwendung von hellen Fluorochrome mit Markern, die geringe Expression haben oder die nicht über ein bekanntes Fluoreszenzmuster. Marker, die eine gute Trennung zwischen Zellpopulationen und sind hoch exprimiert bieten sollte mit Dimer Fluorochrome wie diejenigen von roten oder violetten Laser angeregt werden. <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Eine Entschädigung kann mit Kompensation Perlen, die Polystyrol-Mikropartikel, die mit einem Antikörper spezifisch für die Kappa leichten Kette des Ig aus Maus, Ratte, Ratte oder / Hamster wurden gekoppelt sind, ausgeführt werden. Die Perlen sind leicht zu färben, haben ein robustes Signal und bieten eine einfache Möglichkeit zur Herstellung von einzelnen Flecken Steuerelemente, die die gleichen Fluorophor wie die experimentellen Proben. </li><li> Richten Sie eine Vorlage, die eine bivariate Plan, forward scatter (FSC) und Seitwärts-Streulicht (SSC), und ein Histogramm zur Anzeige umfasstjedes Fluorochrom, die verwendet werden. </li><li> Führen Sie die negative Kontrolle Röhre und stellen Sie die forward scatter (FSC) und Seitwärts-Streulicht (SSC), um die Bevölkerung von Interesse auf der Skala statt. </li><li> Passen Sie die Fluoreszenz PMT-Einstellungen, um die negativen Bevölkerung oder Autofluoreszenz im äußersten linken Teil des Histogramms Platz. </li><li> Notieren Sie sich die negative Kontrolle Röhre. </li><li> Führen Sie das einzige positive Kontrolle Rohre und notieren Sie die Daten für jede Röhre. </li><li> Zeichnen Sie ein Intervall Schutzzaun um den positiven Teil der Daten auf das Histogramm, und ein anderes Intervall Tor auf der negativen Teil des Histogramms. </li><li> Manuelle Kompensation wird durch die Einstellung erfolgt der Median (Median ist eine bessere Schätzung der zentralen Tendenz als der Mittelwert auf einer logarithmischen Skala) des Positiven, bis er gleich dem Median der Negative ist. Dies muss für jeden der Fluorochrom-Etiketten in dem Experiment verwendete durchgeführt werden. </li><li> Zur Einstellung der Median, passen Sie die spektrale Überlappung Werte höher oder niedriger, bis die Mediane für die einzelnen fluoreszierenden Parameter entsprechen so genau wie möglich. </li><li> Eine Entschädigung kann auch automatisch mit Analyse-Software geschehen. Automatische Kompensation verwendet die erfassten Daten von der Entschädigung Kontrollen eine algebraische Matrix für alle Fluorophore in dem Experiment verwendete berechnen. Diese Werte werden verwendet, um zu subtrahieren aus den Beiträgen der nicht-primären Farben, die in einer Grundfarbe des Detektors Blutungen sind. </li></ol></li><li> Notieren Sie sich die experimentelle Probe, die sortiert werden und die Nutzung Gating-Tools und subsetting Methoden, um die Bevölkerung von Interesse zu definieren. <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Richten Sie die experimentelle Vorlage mit einem Punkt-Diagramm, dass FSC vs SSC-Displays und einen Gating-Werkzeug, Polygon, Rechteck-, Intervall-oder Quadranten zu Tor der Bevölkerung von Interesse. Das Streudiagramm zeigt die physikalischen Eigenschaften der Zelle, die verschiedene auf den jeweiligen Zelltyp ist. </li><li> Der beste Weg, um die Fluoreszenz-Gating-Strategie zu bestimmen, ist die Fluoreszenz minus eins (FMO)-Steuerelemente verwenden. In einem FMO Steuerrohr alle Reagenzien, die in dem Experiment verwendet werden, sind mit Ausnahme des einen von Interesse enthalten. Die FMO hilft zu unterscheiden zwischen schwach gefärbte Populationen und breiten negativen Populationen. </li><li> Verwenden Sie die Daten aus FMO Rohren aufgenommen, um festzustellen, wo man Tore in die Röhre statt. </li></ol></li><li> Nach Toren bestimmt worden sind, können die Tore für die Sortierung in externe Sammelröhrchen ausgewählt werden. Bis zu vier Toren (oder Populationen) kann zu einem Zeitpunkt in Abhängigkeit von der Instrumentierung zur Verfügung sortiert werden. </li><li> Führen Sie die experimentelle Probe-Röhrchen bei 4 ° C, auf Ablenkplatten drehen und Art der Probe. 5 x 10 5 -1,5 x 10 6 Zellen in eine 12 x 75 mm Rohr und 1,5 sortiert x 10 6 bis 4,5 x 10 6 Zellen in eine 15 ml konische sortiert werden. </li><li> Sobald die erforderliche Anzahl von Zellen erhalten worden ist, manuell stoppen Sortierung. </li><li> Führen Sie eine post-Art-Analyse, um die Reinheit der sortierten Zellpopulationen zu ermitteln. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Wir haben hier für Maus Milz B-und CD4 T-Zell-Sortierung (Abbildung 1) gezeigt. Milzzellen wurden mit PE Texas Red-konjugiertem Anti-Maus-B220, FITC-konjugierten Anti-Maus-TCRβ und AlexaFluor-700-konjugierten Anti-Maus-CD4 an B-Zellen (B220 + TCRβ-) und CD4 T-Zellen (CD4 + + TCRβ identifizieren gebeizt ). Die Sortierung wurde mit BD FACS Aria Instrument durchgeführt. Nach dem Sortieren der B-Zell-Reinheit betrug&gt; 97% und die CD4 T-Zell-Reinheit betrug&gt; 98%. <img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Die Reinheit der Milz B-Zellen und CD4 T-Zellen nach FACS. Maus Milzzellen mit anti-Maus-B220, TCRβ und CD4 Antikörper gefärbt wurden. FACS für B-Zellen wurde mit einem BD FACS Aria durch Gating auf B220 + TCRβ-Zellen (Abb. 1A, links, untere rechte Quadrant). Ein Beitrag Sortieren Analyse wurde durchgeführt, um die Reinheit der B-Zellen (Abb. 1A, rechts) zu bestimmen. B220-Färbung ist auf der x-Achse und TCRβ Flecken auf der y-Achse dargestellt. FACS für CD4 T-Zellen wurde unter Verwendung der gleichen Durchflusszytometer durch Gating auf TCRβ + CD4 +-Zellen (Abb. 1B, linken, oberen rechten Quadranten). Ein Beitrag Sortieren Analyse wurde durchgeführt, um die Reinheit der CD4 T-Zellen (Abb. 1B, rechts) zu bestimmen. TCRβ Färbung ist auf der x-Achse und CD4-Färbung auf der y-Achse dargestellt. Der prozentuale Anteil positiver Zellen in jedem Quadranten dargestellt. <!--<img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Die Reinheit der Milz CD4 T-Zellen nach FACS. Murine Milz-T-Zellen wurden durch die Entfernung von B-Zellen durch Schwenken bereichert. Anschließend wurden die Zellen mit anti-Maus-TCRβ und CD4 Antikörper (linkes Bild) gefärbt. FACS wurde mit einem BD FACS Aria durch Gating auf TCRβ + CD4 +-Zellen (links, rechts oben quadrant). Ein Beitrag Sortieren Analyse wurde durchgeführt, um die Reinheit der T-Zellen, die größer als 99% (rechts) war zu bestimmen. TCRβ Färbung ist auf der x-Achse und CD4-Färbung auf der y-Achse dargestellt. Der prozentuale Anteil positiver Zellen in jedem Quadranten dargestellt. -&gt;

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FACS ist ein hochentwickeltes Verfahren zur Reinigung von Zellpopulationen von Interesse, in denen eine sehr hohe Reinheit (95-100%) der sortierten Population erhalten werden kann. Daher ist diese Technik besonders wichtig für Experimente, bei denen hohe Reinheit ist eine wesentliche Voraussetzung (zB Microarray-Analyse). FACS ist besonders vorteilhaft gegenüber anderen verfügbaren Methoden der Reinigung, wenn eine Zelle Bevölkerung muss auf der Grundlage einer wöchentlichen ausgedrückt Oberflächenmarker gereinigt werden oder wenn zwei oder mehr Populationen zu reinigende, die verschiedenen Ebenen der Ausdruck der gleichen Oberfläche Marker haben werden müssen. Zum Beispiel die Reinigung der Randzone B-Zellen (B220 + CD21 hallo CD23 int / niedrig) und follikulärem B-Zellen (B220 + CD21 int / low CD23 hallo) auf Expression von CD21 und CD23 auf. Ein weiterer wachsender Anwendung von FACS ist Single cell sorting ermöglicht die Analyse einzelner Zellen (3, 4). FACS ist auch allgemein zu sortieren Zellen, die fluoreszierende Proteine, die genetisch ausgedrückt werden, wie grün fluoreszierende Protein markierte Proteine ​​(5) verwendet. Wenn eine sterile Art durchgeführt wird können die Zellen kultiviert werden. Allerdings kann die Lebensfähigkeit der Zellen und die Ausbeute bei der Sortierung beeinträchtigt werden. Die Lebensfähigkeit kann durch eine Zell-abhängige optimale Temperatur für die Sortierung und Verarbeitung Sammelröhrchen unmittelbar nach ihrer Kapazität zu erreichen verbessert werden. Die Wiederherstellung kann durch Verwendung von Polypropylen-Röhrchen, das Sammeln sortierten Zellen im Serum von Rich Media und Invertieren Sammelröhrchen intermittierend, Pflege-Röhrchen bei einer optimalen Temperatur und Zentrifugieren sortierten Zellen für ca. 10 min (http://cyto.mednet.ucla.edu erhöht werden / Protocol.htm). Die Entwicklung von Ultra-High-Speed-Sorter hat die Möglichkeit, die Anwendung von Flow Sortierung in klinischen Umgebungen erweitert. Die mögliche klinische Anwendungen der FACS gehören Reinigung von Blut-Stammzellen aus menschlichem Blut zu therapeutischen Zwecken, Anwendungen in der Krebstherapie, Amniozentese Ersatz-, Sortier-menschlichen Spermien und Früherkennung von Krankheiten Erkennungen (6, 7). Für mehrfarbige Färbung wird Antikörperselektion ein wichtiger Schritt und Fluorochrome beruhen auf dem Nachweis-System für die jeweilige Instrument gewählt. Es gibt eine Reihe von Unternehmen, die Zellsortern und der Laser-Konfiguration variiert verkaufen nach den Bedürfnissen der Benutzer. So kann man nicht einfach verwenden genau die gleichen Antikörper in veröffentlichten Studien ohne Bestätigung Kompatibilität verwendet. Für eine optimale Antikörper Auswahl, sollte man die Expression des Proteins untersucht. Im Allgemeinen sollten die hellsten verfügbaren Fluorochrom-markierten Antikörper verwendet, um schwach ausgedrückt Oberflächenmarker Fleck, während dim Fluorochrome für die Färbung von stark exprimierten Oberflächenmarker (8) verwendet werden können. Darüber hinaus Antikörper sollten in einer Weise, dass unter ihren Emissionsspektren Überlappung gewählt werden, ist minimal. Für mehrfarbige Färbung, ist es äußerst schwierig zu entscheiden Fluorochrom, dass keine spektrale Überlappung. In dieser Situation ist die Entschädigung durchgeführt. Kompensation ist notwendig, um mathematisch zu eliminieren die Fluoreszenz Überschneidungen zwischen den Emissionen Spektrum der verschiedenen Fluorochrome, die messbar von den Detektoren (8-10) ist. In anderen Worten ist die Überlappung Fluoreszenz von einem Fluorochrom aus dem Emissionsspektrum eines anderen Fluorochrom abgezogen. Die Ausgleichsrechnung erfordert eine ungefärbte Kontrolle und einzigen positiven Kontrollen für jedes Fluorochrom für eine mehrfarbige Färbung (9, 10). Eine Entschädigung kann unter Verwendung von Zellen oder Perlen werden. Die Perlen sind leicht zu färben, haben ein robustes Signal und bieten eine einfache Möglichkeit zur Herstellung von einzelnen Flecken Steuerelemente, die die gleichen Fluorophoren wie die experimentellen Proben haben. Compensation Perlen sind besonders vorteilhaft, wenn der Zelloberfläche Protein von Interesse auf einem niedrigen Niveau exprimiert wird und wenn die Zellpopulation von Interesse ist in der Anfangsphase ab Zellpopulation begrenzen. Sobald der Antikörper ausgewählt wurden, sollte ihre Aktivität durch die Durchführung einer Titration Analyse optimiert werden. Dies ist besonders wichtig, wenn der FACS-Maschine hat sehr leistungsfähige Laser. Die Verwendung von suboptimalen Konzentrationen der Färbung Antikörper können in schlechten Abtrennung der gewünschten Zellpopulation aus der gesamten Zellpopulation führen. Die Verwendung von hohen Antikörper-Konzentrationen erhöht die Chance für Antigen nicht-spezifische Färbung. Deshalb Antikörper-Titration ermöglicht die Auswahl der Antikörper-Konzentration, die maximale Helligkeit des positiven Bevölkerung und minimale Hintergrundfärbung (8) gibt. FACS ist heute ein Standard-Technik für die Reinigung von Subpopulationen von Zellen. Es kann benutzt werden, um jeden Zelltyp, in denen eine einzige Zellsuspension erzeugt und können Antikörper verfügbar sind, um die gewünschte Zellpopulation zu identifizieren trennen. FACS ist die Methode der Wahl, wenn highly reine Zellpopulationen sind erforderlich.

purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (facs)

Experimentelle und klinische Studien erfordern oft hochreine Zellpopulationen. FACS ist eine Technik der Wahl, um Zellpopulationen bekannter Phänotyp zu reinigen. Andere bulk Methoden der Reinigung sind Panning, ergänzen Erschöpfung und Magnetic Bead Separation. Allerdings hat FACS mehrere Vorteile gegenüber anderen verfügbaren Methoden. FACS ist die bevorzugte Methode, wenn eine sehr hohe Reinheit des gewünschten Bevölkerung erforderlich ist, wenn die Zielzelle Bevölkerung ein sehr niedriges Niveau der Identifizierung Marker drückt oder wenn Zellpopulationen erfordern Trennung basierend auf differentiellen Marker Dichte. Darüber hinaus ist FACS die einzige verfügbare Reinigungsverfahren für Zellen auf innere Färbung oder intrazelluläre Protein-Expression basiert, wie eine gentechnisch veränderte fluoreszierendes Protein-Marker zu isolieren. FACS ermöglicht die Reinigung von einzelnen Zellen nach Größe, Granularität und Fluoreszenz. Um Zellen von Interesse zu reinigen, werden diese zunächst mit Fluoreszenz-markierten monoklonalen Antikörpern (mAb), die spezifische Oberfläche Marker auf die gewünschte Zellpopulation (1) zu erkennen gefärbt. Negative Auswahl von ungefärbten Zellen ist ebenfalls möglich. FACS Reinigung erfordert ein Durchflusszytometer mit Sortier-Kapazität und der entsprechenden Software. Für FACS werden Zellen in Suspension als Stream in Tröpfchen mit jeweils einer einzelnen Zelle vor einer Laser hindurchgeführt. Die Fluoreszenz-Detektionssystem erkennt Zellen von Interesse auf vorbestimmten fluoreszierenden Parameter der Zellen. Das Gerät gilt eine Gebühr, die Tröpfchen mit einer Zelle von Interesse und eine elektrostatische Ablenkung erleichtert Sammlung der geladenen Tröpfchen in entsprechende Sammelröhrchen (2). Der Erfolg der Färbung und damit Sortierung hängt weitgehend von der Auswahl der Identifizierung von Markern und die Wahl der mAb. Sortieren Parameter können je nach Anforderung der Reinheit und Ausbeute werden. Obwohl FACS erfordert spezielle Ausrüstung und Ausbildung des Personals, ist es die Methode der Wahl für die Isolierung von hochreiner Zellpopulationen.

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Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Für viele wissenschaftliche Studien, die eine biologische und chemische Analyse von Zell-Populationen müssen die Zellen in einem hohen Zustand der Reinheit sein. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) ist eine überlegene Methode, bei der reinen Zellpopulationen zu erhalten.

Reinigung von spezifischen Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

73.1K Aufrufe.  BloodCenter of Wisconsin. Für viele wissenschaftliche Studien, die eine biologische und chemische Analyse von Zell-Populationen müssen die Zellen in einem hohen Zustand der Reinheit sein. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) ist eine überlegene Methode, bei der reinen Zellpopulationen zu erhalten.

Serie: Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Forschung

Biologie

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Biotechnik

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Neurowissenschaften

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Immunologie und Infektion

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their prominent presence is often associated with poor prognosis1,2. CAFs are an activated subpopulation of stromal fibroblasts, many of which express the myofibroblast marker &alpha;-SMA3. CAFs originate from local tissue fibroblasts as well as from bone marrow-derived cells recruited into the developing tumor and adopt a CAF phenotype under the influence of the tumor microenvironment4. CAFs were shown to facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes tumor cell proliferation, angiogenesis, and invasion5-8. We demonstrated that CAFs enhance tumor growth by mediating tumor-promoting inflammation, starting at the earliest pre-neoplastic stages9. Despite increasing evidence of the key role CAFs play in facilitating tumor growth, studying CAFs has been an on-going challenge due to the lack of CAF-specific markers and the vast heterogeneity of these cells, with many subtypes co-existing in the tumor microenvironment10. Moreover, studying fibroblasts in vitro is hindered by the fact that their gene expression profile is often altered in tissue culture11,12 . To address this problem and to allow unbiased gene expression profiling of fibroblasts from fresh mouse and human tissues, we developed a method based on previous protocols for Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)13,14. Our approach relies on utilizing PDGFR&alpha; as a surface marker to isolate fibroblasts from fresh mouse and human tissue. PDGFR&alpha; is abundantly expressed by both normal fibroblasts and CAFs9,15 . This method allows isolation of pure populations of normal fibroblasts and CAFs, including, but not restricted to &alpha;-SMA+ activated myofibroblasts. Isolated fibroblasts can then be used for characterization and comparison of the evolution of gene expression that occurs in CAFs during tumorigenesis. Indeed, we and others reported expression profiling of fibroblasts isolated by cell sorting16. This protocol was successfully performed to isolate and profile highly enriched populations of fibroblasts from skin, mammary, pancreas and lung tissues. Moreover, our method also allows culturing of sorted cells, in order to perform functional experiments and to avoid contamination by tumor cells, which is often a big obstacle when trying to culture CAFs.

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Cancer Associated Fibroblasts (CAFs) facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes proliferation, angiogenesis, and inflammation. Here we describe a method to isolate pure populations of normal fibroblasts and CAFs from fresh mouse and human tissues by cell sorting, using PDGFR&#x03B1; as a surface marker.

Isolation von Normal und Krebs-assoziierte Fibroblasten von Fresh Gewebe durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

Primärzellkultur von gereinigten Gurified GABAergic oder Glutamatergic Neuronen, die durch Fluoreszon-Sortierung gegründet wurden

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Isolierung von Skleractin-Zellpopulationen

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and extremely large cell (40-60 &#181;m). As opposed to the fast-increasing knowledge in megakaryopoiesis at the cell biology and molecular level, the characterization of megakaryopoiesis by flow cytometry is limited to the identification of mature MKs using lineage-specific surface markers, while earlier MK differentiation stages remain unexplored. Here, we present an immunophenotyping strategy that allows the identification of successive MK differentiation stages, with increasing ploidy status, in human primary sources or in vitro cultures with a panel integrating MK specific and non-specific surface markers. Despite its size and fragility, MKs can be immunophenotyped using the above-mentioned panel and enriched by fluorescence-activated cell sorting under specific conditions of pressure and nozzle diameter. This approach facilitates multi-Omics studies, with the aim to better understand the complexity of megakaryopoiesis and platelet production in humans. A better characterization of megakaryopoiesis may pose fundamental in the diagnosis or prognosis of lineage-related pathologies and malignancy.

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Here, we present an immunophenotyping strategy for the characterization of megakaryocyte differentiation, and show how that strategy allows the sorting of megakaryocytes at different stages with a fluorescence-activated cell sorter. The methodology can be applied to human primary tissues, but also to megakaryocytes generated in culture in vitro.

Immunphänotypisierung und Zellsortierung von humanen MKs aus menschlichen Primärquellen oder differenziert in vitro von hämatopoetischen Vorläufern

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and ...

Fluoreszenzaktivierte Einzelzellsortierung von humanen mesenchymalen Stammzellen

Single-Cell Sorting of Immunophenotyped Mesenchymal Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth

The mesenchymal stem cells (MSCs) of an organism possess an extraordinary capacity to differentiate into multiple lineages of adult cells in the body and are known for their immunomodulatory and anti-inflammatory properties. The use of these stem cells is a boon to the field of regenerative biology, but at the same time, a bane to regenerative medicine and therapeutics owing to the multiple cellular ambiguities associated with them. These ambiguities may arise from the diversity in the source of these stem cells and from their in vitro growth conditions, both of which reflect upon their functional heterogeneity.
This warrants methodologies to provide purified, homogeneous populations of MSCs&#160;for therapeutic applications. Advances in the field of flow cytometry have enabled the detection of single-cell populations using a multiparametric approach. This protocol outlines a way to identify and purify&#160;stem cells from&#160;human exfoliated deciduous teeth (SHEDs) through fluorescence-assisted single-cell sorting. Simultaneous expression of surface markers, namely, CD90-fluorescein isothiocyanate (FITC), CD73-peridinin-chlorophyll-protein (PerCP-Cy5.5), CD105-allophycocyanin (APC), and CD44-V450, identified the &#34;bright,&#34; positive-expressors of MSCs&#160;using multiparametric&#160;flow cytometry. However, a significant drop was observed in percentages of quadruple expressors of these positive markers from passage 7 onwards to the later passages.
The immunophenotyped subpopulations were sorted using the single-cell sort mode where only two positive and one negative marker constituted the inclusion criteria. This methodology ensured the cell viability of the sorted populations and maintained cell proliferation post sorting. The downstream application for such sorting can be used to evaluate lineage-specific differentiation for the gated subpopulations. This approach can be applied to other single-cell systems to improve isolation conditions and for acquiring multiple cell surface marker information.

Autor im Rampenlicht: Bedeutung der Einzelzellsortierung bei der Isolierung gereinigter Populationen mesenchymaler Stammzellen 

This protocol describes the use of fluorescence-activated cell sorting of human mesenchymal stem cells using the single-cell sorting method. Specifically, the use of single-cell sorting can achieve 99% purity of the immunophenotyped cells from a heterogeneous population when combined with a multiparametric flow cytometry-based approach.

Einzelzellsortierung von immunphänotypisierten mesenchymalen Stammzellen aus humanen abgeblätterten Milchzähnen

The mesenchymal stem cells (MSCs) of an organism possess an extraordinary capacity to differentiate into multiple lineages of adult cells in the body and ...