Bu proje, Illinois Halk Sağlığı Bölümü ve Ulusal Bilim Vakfı (DBI-0.852.416) tarafından finanse edildi.

1. Cihaz işlevi <ol><li> Hipoksik eklemek cihaz 6-sütunlar içerdiğini standart 6-plaka içine yuva. Gaz direğinin dibinde mikroakışkan ağ üzerinden ayağı içine akar ve cihazın geri akar. Mikrokanallı alt duvarını oluşturan direği dibinde Mikrokanallı gaz ve kültür ortamı arasındaki oksijen difüzyon izinleri 100 mikron kalınlığında bir gaz geçirgen PDMS membran. Böylece, cihazın istenen değere doğru medya oksijen konsantrasyonu sürücüler bir konsantrasyon gradiyenti kurarak çalışır. </li><li> Bir cihaz hipoksik odası ve diğer hücre oksijenasyonu sistemleri üzerinde bir dizi avantaj sunar: 1)) daha hızlı zamansal kontrol, 2 izin oksijen difüzyon yolu en aza indirir, ayağı Mikrokanallı tasarım, 3 bağlı oksijenasyon üzerinde mekansal kontrol) artırır sahip küçük bir laboratuvar ayak izi ve deneysel verimliliği artırmak için daha yüksek verim ve 4), özel bilgi ve ekipman için gereksinimi olmadan ortak hücre kültürü araçları (örneğin multiwell plaka) uyarlar. </li></ol> 2. Cihaz fabrikasyon <ol><li> İlk ayağı dizisi PDMS ile daha önce işlenmiş bir Delran kalıp kalıp kopyasıdır. </li><li> Sonraki gaz her ayağı altındaki Mikrokanallı standart SU-8 fotolitografi ve PDMS çoğaltma kalıp kullanılarak imal edilir. </li><li> Gaz geçirgen zar, istenilen kalınlığı elde etmek için bir silikon yonga üzerinde PDMS tanımlanan iplik üretilir. Bu örnekte 10 saniye için 500 rpm ve daha sonra 30 saniye süreyle 900 rpm dönen tarafından imal edilen 100 mikron kalınlığında bir membran kullanın. </li><li> Tüm bileşenleri bir el plazma cihazı (Model BD-20, Elektro-Teknik Ürünler) ile oksijen plazma tedaviden sonra bir araya yapıştırılır. </li></ol> 3. Cihaz ayarları <ol><li> Yavaşça cihazın kabarcıkları önlemek için emin olun, plakası takın. Yerleştirilmesi sırasında cihazın bir tarafında kabarcıklar Olta sınırdışı etmeye yardımcı olur. Gerçek hücre tabanlı deneyler için, bu adımı steril bir laminer akış kaputu içinde yapılmalıdır. Cihazın takılı bir kez kirlenme şansı büyük ölçüde azalır, montaj inkübatör, steril olmayan bir ortamda yapılabilir. </li><li> Boru kaynak gaz tankı cihazın giriş ve çıkış portlarına bağlayın. Hücre tabanlı deneyler için, kültür inkübatör boru giriş ve boru cihaz taşıma ve kuvöz içine yerleştirerek sonra bağlı olmalıdır izin verecek bir delik olmalıdır. Altta yatan hücreler ezmek için yeterli PDMS deforme cihazı, aşırı basınç koyarak önlemek için dikkatli olun. </li><li> Hassas akış regülatörü, cihaz taşan önlemek için tank top regülatörü açmadan önce kapalı olduğundan emin olun. Gaz akışını başlatın. Istenen akış hızı (50-100 ml / dk) hafifçe açık hassas akış regülatörü. Basınç düşüşü akış hızını değiştirerek sistemi, equilibrates değişecek, bir sonraki saatten fazla değer yakından izlemek ve gerekli değişiklikleri yapmak. Medya kabarcıklarının oluşumunu önlemek için, yüksek debili bir ilk 15 dakika dengelenme süresi sonra 10-20 arasında ml / dk akış hızını azaltır. </li><li> Istenilen deneme süresinden sonra, gaz akışını durdurmak, plaka kaldırmak ve süreç hücrelerin buna göre (örneğin, vb, sayım, leke, lyse). </li></ol> 4. Aygıt Doğrulama <ol><li> Ayarlama <ol><li> Floresan oksijen pozisyonların sayısı ve konumu seçin. (FOXY) oksijen ölçümü için kullanılan sensör slayt (doğrulama gereksinimlerine göre). Slayt oksijen ile söndürülür floresan Rutenyum boya kaplama içerir. </li><li> 0, 10 slayt Açığa ve doğrudan gaz tankeri,% 21 oksijen ve düzgün dengelenmesi için 5 dakika sonra görüntüleri yakalayabilir. </li><li> Floresan yoğunluğuna bağlı olarak her bir pozisyon ve arsa oksijenasyonu konsantrasyonu ortalama görüntü yoğunluğu ihracat. </li><li> % 0-10 çizgisine uyan doğrusal eğrileri ve 10-21% hattı kalibrasyon eğrisi oluşturun. </li></ol></li><li> Heterojenite <ol><li> Belirli bir aralığı (örneğin her 1 mm) kanal genişliği kapsayan birden çok nokta oluşturulması. Boşluğu bağlı olarak görüntüleri üst üste olabileceğini unutmayın. </li><li> Cihaz üzerinden iyi yüzey oksijen konsantrasyonu ölçün </li></ol></li><li> Dengeleme <ol><li> Oksijen konsantrasyonu ölçmek için üç puan FOXY slayt seçin. </li><li> Ortam oksijen seviyesi ilk fotoğraf çekiminden hemen sonra, cihazın içine gaz akışını başlatmak için hassas akış regülatörü açın. Oksijen Concentr süresi ve kapsamı değerlendirmek için uygun bir aralıkta görüntüler yakalayınation dengeleme (örneğin her 10 saniyede bir 30 dakika). </li></ol></li></ol> 5. Uygulamalar <ol><li> Yara İyileşmesi <ol><li> Deneyden önce bir gün serum orta, iyi gaz kabarcık oluşumunu engellediğini azaltmak için sterilize PDMS eklemek bekletin. </li><li> 6 plaka% 100 confluency Kültür hücreleri. </li><li> Yaralar simüle etmek için bir P200 pipet ile mono tabakaları düz çizikler oluşturun. </li><li> Hücre aspire medya, 5 ml medya ile temizleyin, durulayın ve tekrar aspire. Hücrelerin tek tabaka rahatsız değil önemlidir. </li><li> Yedek hücre proliferasyonu azaltmak için 4 ml serum orta kuyular. </li><li> Place kuyuların içine yerleştirin ve karşılık gelen bir oksijen konsantrasyonu her iyi bağlamak. </li><li> 37 ısıtılmış sahnede eki ile birlikte koyun 6-plaka ° C </li><li> Istenen aralık ve toplam süresi hücrelerinin zaman atlamalı görüntüleri yakalayın. MATLAB T_Scratch, bir yara ölçüm algoritması, iyileşmeyen yüzey alanı analiz etmek için kullanılır. </li></ol></li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar <ol><li> Cihaz doğrulama Hipoksik eklemek cihaz,% 0.5 oksijen stabilize etmek için en az 2 dakika gerektiren, oksijen dengeleme zamanı ve kapsamı açısından hipoksik odasının içinde büyük gelişmeler sergilemektedir. Cihazın membran kuyu alt boşluğu boyutu, daha büyük boşluk boyutları kararlı durum oksijen konsantrasyonu değerlerine ulaşmak için daha fazla zaman gerektiren, dengeleme verimliliği belirleyen en kritik faktör oldu. Cihaz, aynı zamanda birden fazla koşul oluşumuna izin, tek bir kuyuda mekansal oksijenasyonu büyük bir anlaşma üzerinde kontrol izin verir, ve hatta iyi bir yüzey üzerinde döngüsel bir oksijen profili oluşturmak. </li><li> Yara iyileşmesi % 10 veya% 21 oksijen ve yara yüzey alanı hücre mono tabakaları maruz kaldılar zamanla analiz edildi. % 21 oksijene maruz çizikler yavaş ve% 10 hızlı kapattı. Şekil 1, 17 saat boyunca bir çizik görüntüleri gösterir. Şekil 5 grafikler, açık yara alan deney süresi boyunca her iki oksijen konsantrasyonları için yüzde göstermektedir. </li></ol> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig1tmb.jpg" alt="Şekil 1" border="0" /></a> Şekil 1 şematik ve cihaz özellikleri gösteren diyagramları. Oksijen eklemek cihaz geleneksel fotolitografi (mikroakışkan network), çoğaltma kalıplama (mikroakışkan ağ ve insert iskele) tarafından imal ve (gaz geçirgen zar) PDMS iplik tanımlanır. A) oksijen cihazı 6 plaka iç içe. B) 24 ve 96-kuyu direği dizileri örnekleri. C) bir ayağı çapraz-kesitsel şematik. Oksijen giriş üzerinden cihazın içine akar ve ayağı altındaki mikroakışkan bir ağ üzerinden geçecek. Oksijen, gaz geçirgen PDMS membrandan serbestçe direğinin altındaki diffüz ve kültür ortamı içine çözülür. D) dengeleme çalışmaları için gümrüklü cam Mesajları, üstten tek kanallı bir sütun çeşitli özellikler gösteren bir mikroskop görüntüsü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig2tmb.jpg" alt="Şekil 2" border="0" /></a> Şekil 2 oksijen sensörleri ile cihazın Doğrulama. Oksijen basıncı her bir kuyunun içinde bir düzlemsel rutenyum oksijen sensörü kullanılarak karakterize edilmiştir. Tüm oksijen karışımları medya tamponlama için dengeli azot ve% 5 CO 2 içeriyordu. A) Denge süresi ve etkinliği üzerinde Arsa yazılan yüksekliğinin etkisi gösteren ve böylece membran ve hücreleri arasındaki oksijen difüzyon mesafesi. Heights cihazın altına bağlı kesme cam Mesajları kuruldu. Her üç yazılan boyutları verim dengeleme kez hipoksik odasının içinde çok geliştirdi. Zaman bir günlük ölçekte olduğunu unutmayın. B) Arsa hızlı oksijen dengeleme tepki süresi 0,2 mm boşluk cihazın tasvir. C) Çok konumlu linescans da Mikrokanallı altında iyi genelinde cihaz tarafından tanıtılan oksijen konsantrasyonu homojenliği sağlamak için alınmıştır. Grafik,% 0,% 10, ve 10 dakika süreyle% 21 oranında oksijen beslerken sonra ölçülen oksijen konsantrasyonu gösteriyor. D) Cihaz, 5 gün boyunca etkili% 10 oksijen korur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig3tmb.jpg" alt="Şekil 3" border="0" /></a> Şekil 3, daha karmaşık oksijen Mikrokanallı tasarımları ile denemeleri . A) Çift koşulu Mikrokanallı kurulum, istikrarlı bir% 0 ve 14 gün içinde% 21 oksijen profili verir. B) 500 mikron genişlik mikro bir interdigitated ve sarma desen inci boyunca uzanandöngüsel bir oksijen profili e ayağı sonuçlanır. Mikrokanallı hizalama zor olduğu gibi veriler sadece bir temsilci deneme gösteriyor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig5tmb.jpg" alt="Şekil 4" border="0" /></a> Şekil 4 yaranın kapanması 0, 7, ve 17 saat sonra ilk sıfırdan Timelapse görüntüler. Hücreler Deney süresi boyunca% 21 oksijen teslim edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig6.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig6tmb.jpg" alt="Şekil 5" border="0" /></a> Şekil 5, oksijen konsantrasyonu üzerinde bir çizik tayininde yara iyileşmesi oranı etkisi .

SU-8 standart fotolitografi çoğaltma kalıplama, ve iplik ve polidimetilsiloksan tamamen tanımlanan cihaz tarafından imal. Gaz, istenen denge oksijen konsantrasyonu doğru sistem, sürüş Mikrokanallı ayağı ve kültür ortamı arasında konsantrasyon farkı kurmak için cihazın içine tanıtıldı. Cihaz, bir kuyu içinde zamansal ve mekansal oksijenasyonu modüle, yanı sıra uygun bir şekilde hücresel davranışı modüle gösterilmiştir. Oksijenasyon mekansal desenlendirme direğinin dibinde Mikrokanallı tarafından tanımlanan, çeşitli tasarımlar photomask işçiliği uygulanan olabilir. Ayrıca, iyi gaz fazına istenen gaz infüzyon, dengeleme zamanı ve kapsamı hipoksi geliştirmek için bekleniyor. Mikroakışkan karıştırma ağ sadece birkaç stok gaz tankları roman gaz karışımları üretmek için bir araç sağlamak için cihaza adapte olabilir. Son olarak, medya değişimi için bir mekanizma hücreleri yanıt verebilir multiwell plaka, cihazın çıkarılması için ihtiyaç ortadan kaldıracaktır. Cihaz in vitro veya ex vivo deneyi oksijen konsantrasyonu üzerinde kontrol gerektiren herhangi bir uygulamalar vardır. Oksijen sinyal yolları büyük bir çoğunluğu etkileyen önemli bir fizyolojik değişken olduğundan, yararlanacak araştırma alanlarında araştırmacı yaratıcılığı ile sınırlıdır. Diğerleri arasında kanser metastazı, uyku apnesi ve kardiyak iskemi reperfüzyon hasarı, oksijen konsantrasyonu gelişmiş temporal kontrolü yararlanacak bazı alanlar şunlardır. Örneğin, aralıklı hipoksi sürekli hipoksi ve normoxia göre metastastis ilişkili genlerin bir dizi upregulating, daha invaziv kanserler ile ilişkili. Mekansal kontrolü oksijen gradyanlar geliştirme, karaciğer zonation, ilaç zehirlenmesi, ve kök hücre niş kritik olduğu gibi, aynı zamanda önemlidir. Bu makalede sunulan cihaz, bir sistem, daha küçük bir laboratuvar ayak izi, nispeten basit operasyonel gereksinimleri ve hücrelere oksijen aşırı maruz kalmak çok daha fazla kontrol sağlayarak araştırma alanlarında bir dizi fayda sağlayacaktır.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PDMS-Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Planar FOXY sensor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ocean Optics</td>
<td>FOXY-SGS-M</td>
<td>Coated microscope slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Gas regulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega</td>
<td>FL-1472-G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gas</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Airgas</td>
<td>Custom mixes</td>
<td>All have 5% CO2</td>
</tr>
<tr>
<td>SU-8 2150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microchem</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SAFC Biosciences</td>
<td>M3803</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>30-2020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication and operation of an oxygen insert for adherent cellular cultures 

Oksijen birçok hücresel yollar önemli bir modülatör, ancak mevcut cihazların izin<em&gt; In vitro</em&gt; Oksijen modülasyon biyomedikal araştırma ihtiyaçlarını karşılamak için başarısız olur. Hipoksik odasına standart kültür damarlarındaki oksijenlenme kontrol etmek için basit bir sistem sunuyor, ancak, fizyolojik olayların çeşitli eğitim uygulaması önlenmesi, hücre yüzeyinde bulunan oksijen konsantrasyonu üzerinde tam zamansal ve mekansal kontrol yoksun. Diğer sistemler hipoksik odasının üzerine geliştirilmiş, ancak kendi çalışması için özel bilgi ve ekipman gerektiren, ortalama araştırmacı için onları korkutucu hale getirir. Multiwell plakaları için microfabricated eklemek bulundu iyi model fizyolojik olgular için zamansal ve mekansal oksijen konsantrasyonu daha etkili bir şekilde kontrol etmek için geliştirilmiştir<em&gt; In vivo</em&gt;. Platformu, standart bir multiwell plakasına yuvaları ve pasif mikroakışkan amaçlayan bir gaz geçirgen bir zar ile gaz ağının olarak hizmet vermektedir yapışık hücrelere oksijen sunumunu modüle polidimetilsiloksan eklemek oluşur. Cihaz kullanımı kolay ve platform haline istenen oksijen konsantrasyonu tanıtmak basınç sağlayan gaz silindirleri bağlı. Fabrikasyon bir silikon yonga üzerinde iplik standart SU-8 fotolitografi, çoğaltma kalıplama, ve tanımlanmış PDMS bir kombinasyonu içerir. Cihazın bileşenleri, elde tutulan bir plazma sistemi kullanılarak yüzey tedaviden sonra yapıştırılır. Doğrulama düzlemsel floresan oksijen sensörü ile gerçekleştirilebilir. Dengelenme zamanı dakika sırasına ve oksijen profilleri geniş bir yelpazede bulunan bu taklit etmek için, bu çalışmada elde edilen siklik profili olarak cihaz tasarımı, ve hatta oksijen gradyanlar göre elde edilebilir<em&gt; In vivo</em&gt;. Cihaz fonksiyon kaybı olmadan ortak yöntemler kullanılarak hücre kültürü için sterilize edilebilir. Okuyan cihazın uygulanabilirliği<em&gt; In vitro</em&gt; Yara iyileşmesi tepki gösterdi.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures at JoVE.com

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

6 plaka mekansal ve zamansal oksijenasyonu üzerinden gelişmiş kontrol imkanı sağlayan bir add-on bir platform imalatı ve doğrulama. Cihaz bir dizi kültür sistemleri uyarlanabilir ve yara iyileşmesi üzerine oksijen etkilerini araştırmak amacıyla kullanılabilir.

İmalat ve Operasyon yapışkan Hücresel Kültürler Oksijen Ekle

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

fabrication-operation-an-oxygen-insert-for-adherent-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

9.6K Görüntüleme.  University of Illinois. 6 plaka mekansal ve zamansal oksijenasyonu üzerinden gelişmiş kontrol imkanı sağlayan bir add-on bir platform imalatı ve doğrulama. Cihaz bir dizi kültür sistemleri uyarlanabilir ve yara iyileşmesi üzerine oksijen etkilerini araştırmak amacıyla kullanılabilir.

Video: Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

Yapışkan ve Sigara yapışık Memeli Hücre yerinde Subselüler Fraksiyonu

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Biyoloji

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogenic Testi: yapışkan Hücreler

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Hücre-Hücre İletişim Yokluğunda iki Hücresel Türleri Ekleme Co-kültür Sisteminin Geliştirilmesi

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

Hücresel dönüştürme Kaposi sarkomu Herpesvirus tarafından eğitim için bir Vitro modeli

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Dinamik için objektif-ücretsiz Video mikroskobu ve kantitatif analiz yapisan hücre kültürü

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen infection or challenge with pathogen-associated chemicals (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]), an array of immune responses, including a ROS burst, are quickly induced in plants, which is called PAMP-triggered immunity (PTI). A ROS burst is a hallmark PTI response, which is catalyzed by a group of plasma membrane-localized NADPH oxidases-the RBOH family proteins. The vast majority of ROS comprise hydrogen peroxide (H2O2), which can be easily and steadily detected by a luminol-based chemiluminescence method. Chemiluminescence is a photon-producing reaction in which luminol, or its derivative (such as L-012), undergoes a redox reaction with ROS under the action of a catalyst. This paper describes an optimized L-012-based chemiluminescence method to detect apoplast ROS production in real-time upon PAMP elicitation in rice tissues. The method is easy, steady, standardized, and highly reproducible under firmly controlled conditions.

Here, we describe a method for the real-time detection of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues in pathogen-associated molecular pattern-triggered immune response. This method is simple, standardized, and generates highly reproducible results under controlled conditions.

Kemilüminesans Testi ile Pirinçte İmmün Yanıtta Reaktif Oksijen Türleri Üretiminin Gerçek Zamanlı Tespiti

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of conditioned media remains time-consuming and far from physiological and pathological conditions. Although a few models of co-culture are commercially available, they remain restricted to specific assays and are mostly for two types of cells. 
Here, 3D-printed inserts are used that are compatible with numerous functional assays. The insert allows the separation of one well of a 6-well plate into four compartments. A wide range of combinations can be set. Moreover, windows are designed in each wall of the compartments so that potential intercellular communication between every compartment is possible in the culture medium in a volume-dependent manner. For example, paracrine intercellular communication can be studied between four cell types in monolayer, in 3D (spheroids), or by combining both. In addition, a mix of different cell types can be seeded in the same compartment in 2D or 3D (organoids) format. The absence of a bottom in the 3D-printed inserts allows the usual culture conditions on the plate, possible coating on the plate containing the insert, and direct visualization by optical microscopy. The multiple compartments provide the possibility to collect different cell types independently or to use, in each compartment, different reagents for RNA or protein extraction. In this study, a detailed methodology is provided to use the new 3D-printed insert as a co-culture system. To demonstrate several capacities of this flexible and simple model, previously published functional assays of cell communication were performed in the new 3D-printed inserts and were demonstrated to be reproducible. The 3D-printed inserts and the conventional cell culture using conditioned media led to similar results. In conclusion, the 3D-printed insert is a simple device that can be adapted to numerous models of co-cultures with adherent cell types.

In this paper, a newly designed 3D-printed insert is presented as a model of co-culture and validated through the study of the paracrine intercellular communication between endothelial cells and keratinocytes.

Basit 2D ve 3D hücre kültürlerini mümkün kılmak için tasarlanmış yenilikçi bir 3D baskılı ek parça

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...