This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.

1. Giriş <ol><li> Biyoreaktör kadar güç. Giriş sayfasını açmak için herhangi bir yere tıklayın. Kullanıcı adı seçin ve parolanızı girin ve &quot;Giriş&quot; e tıklayınız. </li></ol> 2. Kalibrasyon <ol><li> PH sensörü (önceki otoklav 2 puan) kalibre. </li><li> PH sensörü kontrol edin ve sensör ucu elektrolit solüsyonu ile doldurulur onaylayın. PH kalibrasyon çözeltiler (elektrolit), pH 4 ve pH 7 ile beher iki hazırlayın ve damıtılmış su ile uygun bir yıkama şişe. </li><li> PH sensörü, pH kablosunu bağlayın. Merhaba arayüzünde &quot;Eylemler&quot; sekmesine gidin ve &quot;kalibre&quot; tıklayın. Kalibrasyon Çözüm Temp alanına tampon sıcaklığını girin. </li><li> Tamponu 1 (pH 4) pH sensörü yerleştirin ve &quot;sıfır&quot; alanına değer girin. Stabilize grafiği bekleyin ve &quot;kalibre 1&quot; butonuna tıklayın. Damıtılmış su ile pH sensörü durulayın. </li><li> Tampon içinde yer sensör 2 (pH 7). Tampon girin&quot;Yayılma&quot; alanında 2 değer. Stabilize ve 2 düğmesine kalibre tıklayın grafiği bekleyin. </li><li> &quot;Kaydet&quot; sonra &quot;Kapat&quot; tıklatın. </li><li> Çözünmüş Oksijen (DO) sensörünü kalibre. </li><li> DO sensörü sağlamak birkaç saat sistemine bağlı olması ile polarize edilmiştir. Merhaba arayüzünde &quot;Eylemler&quot; sekmesine gidin ve kalibre tıklayın. &quot;Bir DO&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> DO sensörünü ayırın ve &quot;sıfır&quot; alanına 0 girin. Stabilize ve &quot;Kalibre 1&quot; butonuna tıklayın grafiği bekleyin. </li><li> DO sensörünü takın ve &quot;yayılma&quot; alanına 100 girin. Stabilize ve &quot;Kalibre 2&quot; butonuna tıklayın grafiği bekleyin. </li><li> &quot;Kaydet&quot; sonra &quot;close&quot; tıklatın. </li></ol> 3. Otoklav ve Install Sensörler ve Reaktif Gemiler <ol><li> AutoC kalibrasyon, yer sensörleri ve termal kuyuda sonrayıkamak poşetler ve 121 ° C, 15 psi&#39;de 30 dakika süreyle otoklav. </li><li> % 70 izopropil Alkol (IPA) ve biyolojik güvenlik kabini transfer torbalar (BSC) ile otoklav torbalar sanitize. Geminin dış ambalajı çıkarın. </li><li> % 70 IPA ile iç ambalajların dezenfekte ve biyolojik güvenlik kabini (BSC) ile gemi aktarın. İç ambalajını çıkarın ve nakliye sırasında hasara için gemi ve boru inceleyin. </li><li> PH takın ve iki ön limanlarında sensörleri DO. Sol arka kapısına termal kuyu yükleyin. Sensör kapağını açın. </li><li> Sensör bağlantı noktası üzerinden sensörü Kılavuzu. Portuna sıkıca sensörünü geçirin. </li><li> BSC üzerinden gemi aktarın. </li><li> Damar kovan dışında DO ve pH sensörü kablolarını asın ve hiçbir şey kovanı olduğunu kontrol edin. Ilk olarak, kovan içine ayak kabı kaydırın. </li><li> Dikkatlice Kabın termal kuyuya sıcaklık sensörü uygun. Teknenin tabanına dayanacak ısıtıcılar emin olun. </li><li> Kaldırboru kendi çanta ayarlar. Biyoreaktör kontrol ünitesindeki ilgili konnektörleri ve pompalara boru üzerine Maç renk kodlaması. </li><li> Doğalgaz prize konektörü basarak ana gaz hattını takın. Gaz prize konektörü saat yönünde bükerek mikro gaz hattını takın. Egzoz filtre boru yükleyin: </li><li> Filtre Fırını açın. Onun boru filtre ve fırın dışında iki kanca geçer böylece U-kanal egzoz filtresini sabitleyin. </li><li> Boru tutucu kondansatör torba ile boruyu takın. Kapıyı kapatın. </li><li> Sonraki biyoreaktör kontrol ünitesine Yol ekleme hatları A ve B, hem medya hem de çizgiler ve DO sensörü arkasında tezgah üzerine hasat hattı. </li><li> DO ve pH sensörlere kablolarını bağlayın. </li></ol> 4. Ekleme Orta ve Mikro-taşıyıcılar <ol><li> &quot;Eylemler&quot; sekmesine gidin ve tıklayın bilgisayar arayüzü &quot;Denetim Pompalar&quot;. </li><li> Bir Steri FormKullanılmayan bir orta ilave hat (1 portakal bant) ve tüp kaynak veya luer bağlantı parçaları kullanılarak orta şişe / çanta kaynağı arasındaki le bağlantısı. </li><li> Ortam pompa açmak için kaydırıcıyı tıklayın. Medya ortamının eklenmesi istenilen miktarda sonra pompa kapalı kapatmak için kaydırıcıyı tıklayın. </li><li> Oda sıcaklığında 3 saat boyunca, Ca2 +, Mg + 2 serbest PBS mikrotaşıyıcı boncuklar yerleştirin. </li><li> Yıkama Ca 2 +, Mg 2 + ücretsiz PBS ile birkaç kez boncuk. </li><li> 115 ° C, 15 psi&#39;de 15 dakika süreyle otoklavlanmaktadır. NOT: Bu deneyde 3 g / L, (kuru ağırlık) ekleyin. </li><li> , Sulu yıkandı ve ortam, aşama 4.1 &#39;de ilave edildi aynı şekilde reaktöre otoklave edilmiş mikro-taşıyıcılar pompalama. </li></ol> 5. Dengeleme ve Tek-nokta kalibrasyon DO <ol><li> Otomatik kontrolörleri ayarlayın ve istenilen ayar noktalarını girin. Burada, Ajitasyon Set Point (SP) = 15 rpm, sıcaklık SP = kullanmak 37.0 ° C, pH = 7.2, =% 100 DO. P bekleyinarameters dengelenmesi için akmaktadır. </li><li> Sensörünü onaylamak tamamen polarize olduğunu. DO bugünkü değeri onaylayın stabilize. </li><li> &quot;Eylemler&quot; sekmesine gidin ve &quot;kalibre&quot; tıklayın. &quot;Tek nokta&quot; tıklayın, &quot;DO A&quot; tıklayın. </li><li> &quot;Açıklık&quot; alanına &#39;100&#39; girin. , Tıklayın &quot;Save&quot; ve &quot;Kapat&quot; düğmesini tıklatın &quot;Kalibre 1&quot; düğmesine tıklayın: </li></ol> 6. Çalıştır Başlangıç <ol><li> Eylemler sekmesine gidin. &quot;Toplu&quot; ı tıklayın. Toplu adı 16 karakter veya daha az girmek için ekran klavyesini veya harici bir klavye kullanın. </li><li> Ekrandaki klavyenizin &quot;Hide&quot; butonuna tıklayın. &quot;Toplu Başlat&quot; overlay &quot;Başlat&quot; tıklayarak onaylayın tıklayın. </li></ol> 7. Hücreleri ile inoküle <ol><li> Kaynak tarafından kullanılmayan bir ortam ilavesi hattı (1 turuncu bant dışı) arasında steril bir birleşme ve hücre şişe / torba kaynak FormLuer parçaları kullanarak boru veya. </li><li> Pompa ve tank arasındaki borular doğru ok noktalarına kadar ortam pompa hortumunun silikon bölüm takın. </li><li> Boru kelepçesi edin açıktır ve dallı boru kelepçesi kapalıdır. Ortam pompa açmak ve hücreleri ekledikten sonra &quot;Off&quot; tıklayın kaydırıcısını tıklayın. </li><li> &quot;Eylemler&quot; sekmesine gidin ve &quot;Denetim Pompalar&quot; tıklatın. </li></ol> 8. Örnekleme <ol><li> Sık kültürü izlemek için arzu edildiği gibi inoküle edilmesi ve sonra, aşağıdaki şekilde, bu kültürden örneği almak: </li><li> &quot;Eylemler&quot; sekmesine gidin ve &quot;örnek almak&quot; tıklayın. Örnekleme pompaya örnekleme boru yerleştirin ve ekrandaki talimatlara göre örnekleme stopcock manipüle. </li><li> Bu örnekler en az bir gün mikroskopik gözlem ve hücre sayımı gerçekleştirin. </li><li> Hücreleri bu c istenilen yoğunluğa ulaştığında,1.2 x 10 6 hücre / ml &#39;ase bir virüs aşı ilavesi ile hücreleri enfekte etmektedir. </li><li> Aseptik 20 ml&#39;lik bir şırınga inokulum ekleyin ve reaktörün boş bir ek bağlantı noktalarından birine şırınga bağlayın. Şırınga pistonu basarak reaktöre inokulum tanıtılması. </li><li> Örnekleme Devam ve adenovirüs hücre içi partikül konsantrasyonu için kültürünü analiz. </li></ol>

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods.">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li><li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies.">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li><li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application.">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).</li><li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing.">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li><li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities.">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li><li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures.">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li><li>DePalma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+Equipment+on+Cusp+of+Industrialization.">Single-use Equipment on Cusp of Industrialization.</a> Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).</li><li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).</li><li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , (2012).</li></ol>

Yazarlar D. Giroux ve Y. Hashimura Bu makalede kullanılan reaktifler ve aletleri üreten PBS Biotech çalışanlarıdır.

Bu tek kullanımlık biyoreaktör sisteminin kullanımı nispeten basittir ve reaktör izleme ve analiz için gerçek zamanlı bir analiz içerir. Bu, son derece iyi 30000000 fazla hücre / ml hücre yoğunluğu ile ulaşan memeli ve böcek hücre kültürü için uygundur. A549 hücreleri, bu raporda 11&#39;de tarif yanı sıra, hem de biyoreaktör SF-9 böcek hücreleri büyüdü. Pnömatik hava tekerleği tarafından sağlanan nazik karıştırma hücre hasarı azaltır. Bu reaktör kurarken birkaç adım önemlidir. İlk olarak, uygun bir pH kalibrasyonu ve sensörler kültür uygun izlenmesi için ve pH-değerini ya da sistemde oksijen ayarlamak için reaktifler ilave önemlidir DO. İkinci olarak, reaktif ve tohum şişe doldurulmuş ve diş ek bir BSC gibi, steril bir ortamda yapılmalıdır. Reaktif şişeleri steril ortamda dışına taşındı sonra, biyoreaktör besleme hatlarına bağlantıları mikrobik kontaminasyonu önlemek için dikkatle yapılmalıdır. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Bu biyoreaktör sistemi bakteri kültürleri için tasarlanmış değildir memeli ve böcek hücre hatları için iyi çalışıyor. Sistem, bakteri hücreleri için gerekli olan, hızlı karıştırma ve oksijen sağlayamaz. Bakteriyel çoğalma iyi bir karıştıran bioreaktör içinde gerçekleştirilir. Memeli ya da böcek hücre kültürü için diğer tek kullanımlık biyoreaktörlerde karşılaştırıldığında, bu sistem, kullanımı kolay çalışır analiz için yeterli veri sağlar ve biz değerlendirdik diğer tek kullanımlık sisteminden daha benzer veya daha iyi hücre büyümesini vardır. Tek kullanım için pnömatik biyoreaktör sistemi hücreleri, araştırma ve Biotherapeutics, aşıların alanda klinik uygulamaların bir çoğu yerine kök potansiyel ve kişiselleştirilmiş ilaç 4 sahiptir. Buna ek olarak, bu sistemin esnekliği Batch, ilaveli-fasılalı, serpme, ve transfeksiyonu göre biyoreaktör uygulamalar 5 sağlar. Son olarak, tek kullanımlık biyoreaktör sistemi potansiyeli taşıdığıbüyük ölçekli sanayi üretim ihtiyaçlarını karşılamak için kurallar ve ulusal ve uluslararası düzenleyici kurumlar 6-10 tavsiyelerine uymak için TIAL.

Süspansiyon içinde büyümeye hücreleri, agregat Çoğalan hücreler, ve hücreler, bir alt-tabakaya sabitlenmiş yükselmektedir memeli hücre soyları büyüme özelliklerine göre üç kategoriye ayrılabilir. Bu video gösterilen hava tekerlekli biyoreaktör hücrelerin her üç tip büyümeye mümkün olsa da, bu video mikro-taşıyıcılar üzerinde ankoraj-bağımlı hücreleri büyütmek için bioreaktörün kullanımını gösterecektir. , Hücreler ürünü - ankoraj-bağımlı hücreleri daha memeli hücreleri üretmek amacıyla yetiştirilebilir. Örneğin, insan kemik iliği kökenli mezenkimal kök ile henüz hücrelerin hasat edilmesi ve hastalıklı doku içine enjekte edilmesi ile yetiştirilmektedir. Bu video gösterilen pnömatik biyoreaktör bu uygulama için bu tür mezenkimal kök hücrelerin üretilmesi için uygun olduğu kanıtlanmıştır (Serra et al., Kişisel iletişim, 2013). Anchorage dependent memeli hücreleri, tipik olarak, özel bir muamele edilmiş büyüme yüzeyi 1 &#39;e uygun hücre kültür plakaları, hücre kültürü şişeleri veya silindir şişelerde, 2B kültür kabına küçük çaplı büyütülür. Daha fazla hücre arzu edildiği zaman, ya da plakalar, şişeler daha fazla ya da daha büyük damarların kullanılarak genişletilebilir. Bununla birlikte, daha düşük maliyetli bir ankoraj-bağımlı hücrelerin büyük miktarlarda kültivasyonu, hücre bağlanması için yüzey alanını artırmak için gerekli mikro-taşıyıcılar olarak adlandırılan küçük bir katı boncuklar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Hücrenin bağlanma özelliklerine bağlı olarak, mikro-taşıyıcılar birden fazla değişik tipte örneğin kaplanmış dekstran, peptid, ya da kolajen gibi, ticari olarak temin edilebilir. Mikro taşıyıcılar, hücre büyümesi için daha geniş bir yüzey alanı hacim oranı sağlamak için geniş bir yüzey alanına sahiptir; ve mikro taşıyıcılar, hücreler biyoreaktör de 2 yüksek yoğunluklarda kültive edilmesini sağlar çalkalama ile süspansiyon içinde muhafaza edilebilir. Biorea Şu anda, türleriyapışık hücreler mikro-taşıyıcılar üzerinde yetiştirilen ctors hücre kaplı mikro-taşıyıcı süspansiyonu sağlamak için eksenel pervaneler kullanır döndürme şişeleri ve karıştırılmıştır tankı sistemleri içerir. Çeşitli faktörler, oksijen gerilimi, kesme stresi, yüzey matris ve bir gıda maddesi ve metabolit konsantrasyonları dahil olmak üzere, hücrelerin başarılı bir şekilde ekimi için önemlidir. Biyoreaktörler kullanılması, gerçek zamanlı büyüme koşullarının izlenmesi ve önemli ölçüde daha düşük üretim maliyetleri 1&#39;e potansiyeli sağlar. Dahil olmak üzere, in vitro hücre ekimi, karıştırılmış bir süspansiyona, dönen duvar kap, içi boş elyaf, bir rocker platformunda torba biyoreaktör ve akışkan yataklı sistemler 3 birçok ortak biyo-reaktör tasarımları vardır. Bu sistemlerin birçoğu gibi yüksek maliyet besin konsantrasyonu geçişlerini, hidrodinamik kesme, hücre toplama ve zorluk örnekleme, izleme ve kontrol cel gibi, hücre ekimi için benzersiz sorunları sunmak ve -up ölçekl ölçek-up. Çeşitli yapışık hücre çizgileri, viral aşıların üretimi veya gen terapi uygulamaları için viral vektörlerin üretimi için ya da, virüs üretiminde kullanılmaktadır. Bu video, tek kullanımlık hava basınçlı (Hava Tekerlek) biyoreaktör sistemi kullanılarak, insan akciğer kanser hücreleri (A549) bir onkolitik adenovirüsün üretimi için mikro-taşıyıcılar üzerinde hücre kültürünü göstermektedir. Pnömatik biyoreaktör tasarımı bioreaktörün dibine serpilmiştir gaz kaldırma kuvveti tarafından desteklenmektedir dikey bir çalkalama tekerlek kullanır. Bu nazik Karıştırma yöntemi hidrodinamik kesme kuvvetleri sınırlar, ama yine de iyi, orta ve hücre 4 karıştırma sağlar. Karıştırılmakta olan tank reaktörden ile karşılaştırıldığında, pnömatik reaktör daha yüksek hacimli hava Teker biyoreaktör sistemleri (Şekil 1) olarak düşük duvar kesme stresine sahip bulunmaktadır. Karıştıran tank biçimindeki bioreaktörlerde aksine, bu tek kullanımlık reaktörün dikey itici gaz kabarcıklarının akışı içinde tarafından açıldığındaYumuşak ve düzgün karıştırma ortamı (Şekil 2) sağlayan kabından oluşur.

<table><tbody><tr><td>PBS 3&amp;nbsp;</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Use Assembly</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Lung Carcinoma Cells (A549)</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA, 0.25%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytodex 1 Microcarriers</td><td>GE</td><td>3781</td><td></td></tr><tr><td>Antifoam C</td><td>Sigma</td><td>A8011</td><td></td></tr></tbody></table>

cultivation of mammalian cells using a single-use pneumatic bioreactor system

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Şekil 3&#39;te, biyoreaktör çalıştırmak başlatılması için parametreler gösterilir. Bu rakam sıcaklık, çözünmüş oksijen, pH ve ajitasyon parametreleri ayarlayarak önce ekranını gösterir. Parametreleri ayarlandıktan sonra, çalışma parametreleri sürekli olarak takip edilmekte ve ayarlamalar gerekli koşulları korumak için yapılabilir. Yazılım sorunları kolay tanımlanması için izin veren bir sürekli okuma üretir. DMEM,% 10 FBS, SAFC anti-köpük C, 250 ppm, 2 mM L-glutamin ve 3 g / mikro-taşıyıcı L ihtiva eden 2.5 ml kullanarak bu deneyde, sistem o kadar oksijen yüzdesi% 50, bir stabilize sıcaklık 37 ° C ve pH 7.2. Reaktör 10 x 7 4 hücre / ml (ve / veya mikro-taşıyıcı 10 hücre) bir konsantrasyonda A549 hücreleri ile aşılanır. Bu çalışma için seçilen parametreler, 2 saat (Şekil 4) bulunan mikro-taşıyıcılar yapışan hücrelerin çoğunluğunda sonuçlandı. 12 saat sonra, hücreler şeytan(Şekil 5) ve düzleşme mikro taşıyıcı yüzeye yayılması ve süzücü işaretler. 24 saatin sonunda, mikro-taşıyıcıların (Şekil 6) hücreleri olmadan mikro taşıyıcı ve mikro-taşıyıcılar üzerinde hücrelerin herhangi bir iri kümeleri ile hücrelerin nispeten daha dağılımı vardır. A549 hücrelerinin mikro-taşıyıcı kolonizasyon yüzdesi, 24 saat ve daha sonra% 90 (Şekil 7) ile% 75 olduğu. Hücreler, 48 saat (Şekil 8) sonra ~ 1000000 hücre / ml olacak şekilde katlanarak büyümeye devam etti. 50 saat sonra, onkolitik adenovirüs ile (2 x 10 8 virionlar / ml) bir dozu ile enfeksiyondan sonra, yoğunluk mi 1.200.000 hücre / yükseldi ve daha sonra litik enfeksiyon ilerledikçe düşmeye başladı. Viral inokülüm ~ 10.000 kat büyütme oldu. Önceki deneylerde, gaz akışı izleme ve uyarlama hücre büyümesi (yayınlanmamış veriler) üst düzeye çıkarmak için önemli olduğunu bulduk. Hızla büyüyen hücreleri oksijen sistemi ile tüketebilir<html> sıfıra bırakarak DO seviyesi. Hücreler büyümeye devam ederken, çok daha yavaş bir oranda olmuştur. Izlemek ve logaritmik büyüme fazı sırasında hücre taleplerini karşılamak için oksijen akışını ayarlamak için kritik öneme sahiptir. Her çalışma, günlük hücre sayısı ile pH, DO ve sıcaklık karşılaştırarak optimum büyüme için analiz edilebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg" /> Reaktör çeşitli hacimlerde duvar kayma kuvvetlerini ölçen bir karıştırıcı bioreaktör kıyasla Pnömatik Biyoreaktör Sistemi (PBS) Şekil 1. Akışkan dinamiği. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg" /> Şekil 2. Pnömatik-Tekerlek reaktör çark. <html> 52008 / 52008fig3highres.jpg &quot;/&gt; Biyoreaktör Çalışmayı başlatmak için parametrelerin 3. Pnömatik Tekerlek yazılım ekran görüntüsü Şekil. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" /> A549 hücreleri 2 saat Aşıdan ile Şekil 4. Mikro-taşıyıcı kolonizasyon. (Ortalama mikro-taşıyıcı çapı ~ 180 mikron.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg" /> Şekil 5. 12 saat kültürünün başlatılmasından sonra, A549 hücreleri, bağlama düzleştirme ve mikro-taşıyıcılar üzerine yayılmaktadır.5highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" /> Kültüründe 24 saat sonra hücreler ile kaplanmış Şekil 6. Mikro-taşıyıcılar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg" /> A549 hücreleri tarafından mikro-taşıyıcı kolonizasyon Şekil 7. yüzdesi aşılamadan. <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg" /> Şekil 8. adenovir ile kültür öncesi canlı A549 hücrelerinin sayısı ve Enfeksiyondanbize. viral enfeksiyon adım 50 saatte meydana unutmayın.

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System at JoVE.com

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

Tek kullanımlık Pnömatik Biyoreaktör Sistemi kullanılarak memeli hücrelerinde yetiştirme

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

cultivation-mammalian-cells-using-single-use-pneumatic-bioreactor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.3K Görüntüleme.  Johns Hopkins University. Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells. 

Video: Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Pulsatif Biyoreaktör kullanarak Mühendislik Biyolojik Tabanlı Vasküler Greftler

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Biyomühendislik

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Perfüze Mikro-biyoreaktörler Chip tabanlı üç boyutlu Hücre Kültürü

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Biyoloji

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Küresellerde Memeli Hücrelerinin Büyük ölçekli Genişleme için sürekli Beslenme ile Besin Yönetmeliği

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

The functional behavior of cells in culture can be improved by culturing in more in vivo-like 3-dimensional culture environments16-21. This manuscript describes the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for in vivo-like mammalian tissue culture.

için içi boş fiber Biyoreaktörler<em&gt; İn Vivo</em&gt; Benzeri Memeli Doku Kültürü

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Yüksek üretilen iş kullanımı otomatik Microbioreactor sistemi modeli Igg1 CHO hücrelerdeki imalatı için

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain selection and by developing bioprocess parameters. Shake flasks have been used for this purpose. They, however, lack the capability to control the process parameters such as pH and dissolved oxygen (DO). This limitation can be overcome with the help of an automated micro-bioreactor. These bioreactors mimic cultivation at a larger scale. One of the major advantages of this system is the integration of the Design of Experiment (DOE) in the software. This integration enables establishing a design where multiple process parameters can be varied simultaneously. The critical process parameters and optimum bioprocess conditions can be analyzed within the software. The focus of the work presented here is to introduce the user to the steps involved in process design in the software and incorporation of the DOE within the cultivation run.

Here, we present a detailed procedure to run a Design of Experiment in an automated micro-bioreactor followed by cell harvest and protein quantification using a Protein A column.

Çin Hamster Yumurtalık Hücre Yetiştiriciliğinde Yüksek İş-İş BulaMetli Otomatik Mikro-Biyoreaktörler Kullanılarak Proses Optimizasyonu

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

Çözünebilir Mikro Taşıyıcılara Dayalı Yapışık Hücrelerin Kapalı Sistem Üretimi

Large-Scale Cell Production Based on GMP-Grade Dissolvable Porous Microcarriers

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To address the primary shortcomings of the two-dimensional (2D) planar culturing system, we innovatively developed an automated closed industrial scale cell production (ACISCP) platform based on a GMP-grade, dissolvable, and porous microcarrier for the 3D culture of adherent cells, including human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs), HEK293T cells, and Vero cells. To achieve large-scale expansion, a two-stage expansion was conducted with 5 L and 15 L stirred-tank bioreactors to yield 1.1 x 1010 hMSCs with an overall 128-fold expansion within 9 days. The cells were harvested by completely dissolving the microcarriers, concentrated, washed and formulated with a continuous-flow centrifuge-based cell processing system, and then aliquoted with a cell filling system. Compared with 2D planar culture, there are no significant differences in the quality of hMSCs harvested from 3D culture. We have also applied these dissolvable porous microcarriers to other popular cell types in the CGT sector; specifically, HEK293T cells and Vero cells have been cultivated to peak cell densities of 1.68 x 107 cells/mL and 1.08 x 107 cells/mL, respectively. This study provides a protocol for using a bioprocess engineering platform harnessing the characteristics of GMP-grade dissolvable microcarriers and advanced closed equipment to achieve the industrial-scale manufacturing of adherent cells.

Yazar Spotlight: Çözünebilir Mikro Taşıyıcılarla Hücre Tedavisi Üretimini İlerletmek 

Here, we present a protocol to achieve the large-scale manufacturing of adherent cells through a fully closed system based on GMP-grade dissolvable microcarriers. The cultivation of human mesenchymal stem cells, HEK293T cells, and Vero cells was validated and met both quantity demands and quality criteria for the cell and gene therapy industry.

GMP Sınıfı Çözünebilir Gözenekli Mikro Taşıyıcılara Dayalı Büyük Ölçekli Hücre Üretimi

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To ...