Erişmiş R01EY016099 ve Araştırma Körlük Kariyer Geliştirme Ödülü Engellenir: Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) Çekirdek Grant (5P30EY008098) ve aşağıdaki fonlar XW tarafından desteklenmiştir. Kira Lathrop konfokal görüntüleme yardım için teşekkür ederim.

1. Gün. Hazırlık 1. Balık haçlar Akşam zebrafish ikili haç ayarlayın. Istenilen süre önce rastgele çiftleşme önlemek için, kadın ve erkek balık çiftleşme kasetleri ayrı bölücüler kullanın. GFP ifade transgenik balık donör blastomer kaynağı olarak kullanılır. Pt104 transgenik hattı (Zou ve ark, 2008), burada kullanılan EF1 promotör kontrolü altında yayg GFP ifade eder. GFP ifade donör hücreleri canlı görüntüleme görselleştirme sağlar. Uygun floresan proteinleri ifade transgenik balık hatları belirli ihtiyaçları için kullanılıyor olabilir. 2. Embriyo tutmak için kama şeklindeki agaroz kuyuları hazırlayın E3 yumurta su (Westerfield 2007) hazırlanan erimiş% 1 agaroz, bir Petri kabı içine dökün. Agaroz çözüm kama şeklinde çıkıntılar vardır ve agaroz çözümü tamamen katılaşmaya plastik bir kalıp Float. Kalıp dikkatlice çıkarın ve E3 su ile agaroz yatak batırmayın. 3. Transplantasyonu iğneler hazırlayın Cam kapiller pipetler (Dünya Hassas Çalgı) çekerek iğne yapmak 11,5 ayar güçte bir dikey İğne çektirmesi (David Kopf Aletleri) kullanın. İyi iğne uçları, uzun miller ile konik olmalıdır. , Iç çapı 40-45μm Eğimli açıklıkları (Şekil 1A) elde edilir kadar Micro Öğütücü (Marishige) ile 45 derecelik bir açıyla iğne uçları Grind. Iğne uçları temizlemek için, iğne künt ucu bir hortum takmak, bir şırınga hortum bağlayın ve sonra emmek ve tüm görünür enkaz çıkarılana kadar% 10 hidroflorik asit çözeltisi bırakın. Daha sonra,% 100 etanol ile takip ipuçları, saf su ile yıkayın. Tüm etanol buharlaşır kadar iğne Hava kurulayın. Artık etanol yüksek sıcaklık parlatma adımı sırasında iğne berbat: ipuçları tamamen kuru olduğundan emin olmak için çok önemlidir. Iğne uçları pürüzlü kenarlarını yumuşatmak ve parlatmak için, iğne uçları filament Micro Forger (Marishige) tarafından üretilen ısı ile pişirin. Iğne uçları parlatma sırasında filament dokunmasına izin vermeyin. Filament iplik ve iğne uçları arasındaki mesafe olsa da geçen elektrik miktarı istenilen ısıtma koşullarını elde etmek için ayarlanabilir. Sıcaklığı çok yüksek olmamalıdır: Bu erime ve iğne uçları deforme olacaktır. Pürüzlü kenarlar düzeltilir sonra, dikkatli bir iğne ucu ile ısıtılan filaman dokunun ve sonra yavaşça iğne, sivri bir uç oluşturmak için (Şekil 1B) uzak filament çekin. , Keskin, pürüzsüz ve temiz bir iğne sağlam donör blastomer elde etmek için ve ev sahibi embriyolar zarar için kritik öneme sahiptir. 4. Bir embriyo konumlandırma prob hazırlayın Düzeltilir bir ucu ile ince bir cam probu elde etmek için bir gaz alev üzerine cam bir pipet çekin. Bu prob önce nakli uygun yönlendirmeyi embriyoları yerleştirmek için kullanılır. 2. Gün. Blastomer nakli 1. Toplayın ve dechorionate embriyolar Ertesi gün, arkadaşı balık izin çapraz kasetleri bölücüler çıkarın. E3 su ile dolu bir Petri kabındaki embriyoların yerleştirin. Daha sonra, ince forseps bir çift elle embriyoların chorions koparıp dechorionate embriyolar. Dikkatle agaroz kuyulara dechorionated embriyo transferine bükük şaft bir cam pipet kullanın. Embriyoların hava ile herhangi bir temastan kaçının, patlamaya embriyolar neden olur. Embriyolar 28.5 geliştirelim ° C agaroz kuyuları, 3 saat gübreleme, ya da hpf kadar. 2. Nakli aparat Embriyoların geliştirirken, mineral yağ dolu mikro pompa sistemi transplantasyonu iğne bağlayarak nakli aparat kurdu. Sistem kaçak değildir ve herhangi bir hava kabarcığı sistem içinde sıkışıp kalırlar emin olun. Geri mineral yağ ile 0,5 hariç tüm nakli iğne doldurmak alan 1 ul ucu açılışında. 3. Blastomer Nakli Blastomer nakli için, 3-4-hpf embriyoların blastomer tarafında yukarı doğru yönlendirmek amacıyla cam konumlandırma prob kullanın. Sonra, yavaşça bir donör embriyo nakli iğne yerleştirin ve yavaş yavaş iğne 5-20 blastomer emmek. Bir dizi embriyo içine blastomer dolu bir iğne takın ve blastomer yavaşça bırakın. Onların soyu daha sonra gelişim evreleri yerde lokalize blastomer yayımlanan site etkileyecektir. Retina ve beyin gelişimi, hayvan kutup hücreleri serbest analiz etmek. Nakli sırasında, iğne ucu hava teması olmadığından emin olun. Mekanik zararları en aza indirmek için, ev sahibi embriyolar ertesi güne kadar 28.5 ° C&#39;de agaroz kuyularda sol olacaktır. Sonra, tHer iyi bir embriyo ile,% 1 agaroz 0.5 ml ile ön kaplı 24-kuyucuğu mozaik embriyolar ransfer. E3 yumurta su 1 ml her kuyuya eklenir. Bakteriyel enfeksiyonları önlemek için, 10 ul 100X penisilin ve streptomisin E3 yumurta su ekleyin. 3. Gün. Gömme ve mozaik embriyoların canlı görüntüleme 1. Gömülmesi embriyolar E3 yumurta suda% 1.5 düşük erime noktası agaroz (LMP) hazırlayın ve 30 ° C su banyosunda çözüm tutmak. 0.17mm kalınlığında bir cam alt FluoroDish doku kültürü çanak (Dünya Hassas Aletler) bir mozaik embriyo transferi. E3 asgari bir miktarı kapsadığı embriyo bırakmak aşırı E3 suyu çıkarın. Embriyo 30-50 ul erimiş% 1.5 LMP ekleyin. Agaroz çözüm katılaşır önce cam dibine mümkün olduğunca yakın olarak göz veya beyin hızla yerleştirin. Çözüm soğuduktan sonra, embriyolar daha yerinde sabitlemek için ek agaroz çözüm ekleyin. Daha sonra, 2-3 ml E3 yumurta su ile katılaşmış agaroz blok bırakın. 2. Konfokal Görüntüleme Konfokal mikroskopi için, büyük odak derinliği ile su daldırma ters objektif (Olympus, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, Japonya) kullanılır. Amaç üzerine bir damla su eklenir ve daha sonra objektif bir FluoroDish doku kültürü çanak yerdir. Görüntü geliştirme için, embriyoların her 5 dakikada bir fotoğraf çekmeye zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirin. Deney doğasına bağlı olarak, çekimler arasında zaman aralıkları ayarlanabilir olmalıdır. Temsilcisi sonuçları Şekil 2 temsilcisi, 24-hpf mozaik zebrafish göstermektedir. GFP ifade yeşil donör hücreleri vurgulamaktadır. Retina nöroepitelyal hücrelerin tüm retina duvar kalınlığı kapsar. Film 24 hpf ev sahibi beyin donör hücreleri hareketlerini gösterir. Bildirimi hücrelerinin morfolojileri zamanla değişir. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 nakli iğne uçları Şekilleri. A., bir iğne ucu kesik bir açılış hidroflorik asit yıkar sonra enkaz serbest bırakıldı. B. iğne ucunda sivri ucunu oluşturulmuştur. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Görselleştirme GFP-24 hpf kimerik zebrafish embriyolar donör hücreleri ifade. Sol panelinde, beyin ve retina GFP sinyalleri gösterir. Orta panel, parlak bir alan resim embriyo. Sağ panelde Birleştirilen görüntüyü gösterir. Film 1 GFP pozitif donör hücreleri görüntüleme, beyin nöroepitelyal hücrelerinin gelişimi sırasında morfolojileri kapsamlı değişiklikler gösterdi Canlı . 24 ve 25 hpf arasında her 5 dakikada bir filmin kareleri tek tek toplandı. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">film görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish.">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).</li><li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors.">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li><li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina.">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li></ol>

Bu video, blastomer nakli zebrafish retina ve beyin gelişimini analiz etmek için bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu protokol aynı zamanda ilgili yerlere sadece ev sahibi embriyolar donör blastomer bırakmadan diğer doku ve organların gelişimini analiz etmek için kullanılabilir. GFP molekülleri ile etiketleme, floresan boya konjuge Dextran&#39;ın (Ho ve Kane 1990) ile etiketleme daha temiz bir arka plan verir. Bu ölü donör hücreleri Dextran&#39;ın boyaların enkaz böylece görüntüleme (Catalano ve...

E3 yumurta su: <ul><li> 5 mM NaCl </li><li> 0.17 mM KCl </li><li> 0.33 mM CaCl 2 </li><li> 0.33 mM MgSO 4 </li><li> % 0.1 &#39;lik metilen mavisi </li></ul>

transplantation of gfp-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos

Hücreler embriyogenez sırasında konumlarını ve mal yaygın olarak değişir. Bu değişiklikler hücre ve çevreleri arasındaki etkileşimler tarafından düzenlenir. Farklı genetik arka plan hücreleri oluşur Kimerik embriyolar, genler tarafından ilgi aracılı hücre-hücre etkileşimleri çalışmak için mükemmel araçlardır. Erken gelişim aşamasında zebrafish embriyonik şeffaflık, hücresel düzeyde, doku ve organların morfolojilerinden doğrudan görselleştirme izin verir. Burada, zebrafish embriyolar kimerik retina ve beyin oluşturmak ve donör hücreleri canlı görüntüleme gerçekleştirmek için bir protokol göstermektedir. Protokol nakli iğneler, nakli hazırlık kapsar GFP ifade GFP-negatif ana donör blastomer ve canlı konfokal mikroskobu altında donör hücre davranışlarının incelenmesi. Hafif değişiklikler, bu protokolü de embriyonik gelişim zebrafish diğer doku ve organları incelemek için kullanılan olabilir. Etiket donör hücreleri GFP kullanmanın avantajları da tartışılır.

Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos at JoVE.com

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Biz embriyogenez sırasında canlı görüntüleme hücresel davranışı için kimerik zebrafish embriyolar üretmek için bir protokol ortaya koymaktadır.

Transplantasyon GFP of-Kimerik Zebra balığı Embriyolar Retina ve Beyin Gelişimi Canlı Görüntüleme blastomer ifade

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

transplantation-gfp-expressing-blastomeres-for-live-imaging-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Görüntüleme.  University of Pittsburgh. Biz embriyogenez sırasında canlı görüntüleme hücresel davranışı için kimerik zebrafish embriyolar üretmek için bir protokol ortaya koymaktadır.

Video: Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Biyoloji

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Transplantasyon Kimerik Zebra balığı Embriyolar Yaratma

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

Zebrafish kimyasal ekranlar için otomatik görüntüleme ve analiz geliştirilmesi.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Chimeras Üretim Medaka Embriyolar ve Hücre Nakli Dechorionation

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Metabolik Etiketleme ve Bioorthogonal tıklayın Kimya Zebra balığı Embriyolar Görüntüleme glukanlardır

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.