Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

96 oyuklu plakalar, 1. Yüzey Hazırlama <ol><li> Farklı alt tabakalar ve hücre tiplerini açıklayan 96 oyuklu plaka bir haritası oluşturma (Şekil 1) incelenecek. </li><li> Farklı alt tabakalar [poli-L-lisin, fibronektin, I, laminin ve entactin-kolajen IV-laminin (ECL) kollajen tip], 96 oyuklu bir çok oyuklu bir plaka ve steril bir hücre kültüründe, bir çalışma istasyonu hazırlamak stok çözeltilerinin elde edilmesi davlumbaz. </li><li> (Bu konsantrasyon, önceden hücrelerin büyümesi ve çoğalması için bir alt-tabaka konsantrasyona bağlı bir deneye göre belirlenmiştir) 5 ug / ml&#39;lik bir son konsantrasyona kadar, steril fosfat tamponlu salin (PBS) &#39;de stok seyreltilmesi ile tek tek tabakaları hazırlayın. Steril bir rezervuar içine dökülmeden önce bir vorteks ile karıştırın. </li><li> 96 oyuklu harita (Şekil 1) &#39;e göre, her bir oyuğa substrat çözeltisi 100 ul ekle (12 ya da 8-kanallı bir mikro pipet bir 96 oyuklu bir plakaya micropipetting için uygun). Parafilm bir şerit kullanılarak 96 oyuklu plakaya kapağı kapatın ve 4 ° C de bir gece boyunca muhafaza ediniz. </li></ol> 2. Hücre Kaplama ve Time-lapse Görüntüleme Not: Fare MKH&#39;ler yetişkin C57BL / 6 farelerinin kemik iliğinden izole edilmiş ve bir yapışkan hücre hattı olarak muhafaza edilmiştir. Lentiviral vektör en kodlayan BDNF (LV-BDNF kullanılarak ve glial hücre kökenli nörotrofik faktör (insan cDNA GDNF), MKH beyin kaynaklı nörotrofik faktör (insan cDNA BDNF) salgılaması için onlara mühendisi lentiviral vektörleri kullanılarak enfekte edilmiş CMV-BDNF-IRES GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP) ve yeşil floresan protein (GFP, LV-GFP, CMV-GFP). Not: Fare mezenkimal kök hücreleri için kültür ortamı (MSC&#39;ler), 10 mg / ml streptomisin,% 10 hibridom nitelikli fetal sığır serumu,% 10 at serumu, 2 mM L-glutamin ve 10,000 U / ml penisilin, ihtiva eden Iscove Modifiye Dulbecco ortamı olan . Fare MSC (MSC, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-M beş farklıSC&#39;ler ve BDNF / GDNF-GFP MSC&#39;ler), T75 hücre kültürü şişelerinde% 30 birleştiği kaplandı. <ol><li> Hücre Ekimi <ol><li> Iki kez Ertesi gün, aspirasyon ile alt-tabaka çözüm çıkarın ve steril PBS yaklaşık 200 ul her bir yıkayın. Nihai PBS durulama sonra her bir oyuğa Hücre kültür ortamı (200 ul / oyuk) ilave edin. 37 ° C&#39;de ve% 5 dengeleme için CO2 ayarlanmış bir hücre kültürü inkübatöründe içine 96 oyuklu plaka koyun. </li><li> 96 gözlü plaka inkübatör içinde dengelemeden birlikte, hücreler hasat büyüme ortamı toplayarak (T75 şişeleri içinde hasat MKH&#39;ler / kaplama sırasında yaklaşık% 70 konfluent olmalıdır), T75 şişesi (koşullu ortam adlandırılır) ve steril koşullar altında 15 ml&#39;lik konik bir tüp içinde depolanması (bu koşullu ortam aşağıda adım 2.1.4 kullanılacaktır). </li><li> Şişeye steril PBS 8 ml ilave edilir ve yavaşça girdap ve daha sonra PBS pipetle ve% 0.05 tripsin 1 ml ve% 0.01 ilaveEDTA çözeltisi T75 şişesinin kültür yüzey hücreleri ayırmak için. Faz kontrast optik ile donatılmış bir ters mikroskop kullanılarak balon görüntüleyerek hücre dekolmanı izleyin. </li><li> Hücreler müstakil zaman, hemen şişeye (adım 2.1.2 toplanan) klimalı ortam 8 ml ekleyin. Hücre süspansiyonu toplayın ve topak hücrelere 450 x g&#39;de, 4 dakika için 15 ml konik santrifüj tüpüne ve santrifüj aktarın. </li><li> Süpernatantı ve taze 200 ul hücre pelletini ve (37 ° C) hücre kültürü ortamı ısıttı. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak bir tripan mavisi canlı hücre sayımı gerçekleştirilerek hücre süspansiyonu hücre sayısını belirler. Yaklaşık 300 hücre / kuyucuk içine 96 oyuklu plaka ihtiva eden uygun oyuklara hücreleri Plate. </li><li> Hücrelerin her nüfus için bu adımları yineleyin. </li></ol></li><li> Time-lapse Görüntüleme <ol><li> MKH tüm kaplama edildikten sonra, yer2 saat süre ile bir inkübatör içine 96 oyuklu plaka MKH&#39;ler alt tabakaya eklemek için izin verir. </li><li> HCS sistemini başlatın ve sistemin dengeye için 2 saat bekleyin. 37 ° C çevre denetleyicisi ayarlama, sabit bir hava kaynağı temin HCS sistemi çevre odasında, hava içinde% 5 CO2 ihtiva eden bir gaz karışımı silindiri bağlanır. </li><li> 2 saat bir dengeleme süresinden sonra, aşağıdaki inkübatör 96 oyuklu plaka çıkarın ve HCS sisteminin hücre büyüme odasına doğrudan yer. Dengeleme plakası herhangi bir ısı ile ilgili genişleme için hesap ve sonra plaka ayarlarını yapılandırmak için görüntü toplama ve analiz yazılımı başlatmak için 30 dakika bekleyin. </li><li> Görüntüleme için 20X objektif seçin. [Yani, vb FİBRONEKTİN GFP-MKH (x 2 çoğaltır 30 şartlarda = toplam 60 kuyu toplam 6 yüzeyler x 5 MSC alt tipi)] time-lapse görüntüleme kurmak için koşul başına iki kuyu seçin. Ile görüntüleme için iki site seçinHer çukurda. </li><li> Görüntüleme için doğru ışık dalga boylarını seçin. NOT: İki farklı dalga boyları (Faz kontrast ve GFP floresan) time-lapse görüntüleme için seçildi. </li><li> Lazer otofokus kullanarak kuyu dibinde odaklanın ve optimize odak düzlemi bulmak için birden fazla site ve çoklu kuyular test görüntüleri çekmek. </li><li> Odak kurulduktan sonra, 60 kuyuları (120 site) için 48 saat boyunca görüntüleri her 5 dakikada yakalayan başlar. </li><li> HCS sistemi için 96 oyuklu bir plaka kaldırılarak hücreleri her 24 saatte besleyin. Her ortam, 75 ul iyi çıkarın ve her bir oyuğa taze ortam, 100 ul (37 ° C ve% 5 CO bu taze ortam dengeye 2). </li><li> Time-lapse Deneyin sonunda, HCS sisteminden 96-plaka çıkarın. Steril koşullar altında, her bir oyuktan koşullu ortam örnekleri toplamak ve başka bir 96-çukurlu plaka Bu örnekleri aktarın. NOT: Bu örnekler ayrıca analizi kullanılmıştır için kullanılabilirnörotrofik faktörler için ELISA performans gereğidir. </li><li> Bu tür Ki67 hücre çoğalması tahlilinde veya propidyum iyodid ölü / canlı boyama tahlilinde (ayrıntılar aşağıdadır) gibi ek tahliller için kültürlenmiş MSC 96 oyuklu plaka hazırlanması. </li><li> Aşağıdaki bölüm 5&#39;de tarif edildiği gibi hücre göçü / hücre takibi için zaman atlamalı görüntüleme analizi. </li></ol></li></ol> 3. Ki67 Hücre Çoğalması ve Propidium Iodide Canlı / Ölü Deneyi <ol><li> Ki 67 Hücre Proliferasyon Deneyi (İmmünositokimya) <ol><li> 0.1 M fosfat (PO 4) bir dakika için iki kez tampon hücre kültürleri durulayın. Oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) ile kültür sabitleyin. PFA çıkarın ve yedi dakika üç kez PBS ile kuyu durulayın. </li><li> Son durulama sonra, her bir göze bir karşı bloke edici çözeltisi 100 ul (fosfat tamponlu tuzlu su,% 5 normal eşek serumu,% 0.4 sığır albümin serumu ve% 0.2 Triton X-100) ekleyinBurada nd 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. 200: 1 bir çalışma oranında bloke çözeltisi içinde seyreltilmesi ile primer antikor, tavşan anti-Ki67, hazırlayın. </li><li> Bloke edici çözelti çıkarın ve her bir oyuğa birincil antikor solüsyonu, 100 ul de geçerlidir. 96 oyuklu plaka örtün ve bir gece süreyle 4 ° C&#39;de inkübe örnekleri. </li><li> Ertesi gün, antikor çözeltisi çıkarın ve 7 dakika, 3 kez PBS ile yıkayın. </li><li> Ikincil antikor hazırlayın, eşek anti-tavşan Cy3 1 bir çalışma oranında çözüm engelleme: 500. 1: 100 seyreltisinde ikincil antikor çözeltisine DAPI nükleer leke ekleyin. Son PBS durulama çıkarılmasından sonra her bir sekonder antikor / DAPI çözeltisinin 100 ul uygulanır. 90 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> İkincil antikor / DAPI çözeltisi çıkarın ve 7 dakika, 3 kez PBS ile her bir yıkayın. Görüntüleme kadar 4 ° C&#39;de 96-çukurlu plaka ve mağaza örtün. </li></ol></li><li> Propioniloksidium iyodür Canlı / Ölü Deneyi <ol><li> Aşağıda tarif edildiği gibi propidyum iyodür (PI), dışlama deneyi ile hücre ölümü ölçün. </li><li> Kültür ortamı içinde, 1.5 uM&#39;lik bir konsantrasyonda propidyum iyodür leke çözelti hazırlayın. </li><li> Bu hücreleri öldürmek amacı ile 2 dakika için MSC nin bir oyuğuna% 70 etanol içinde 100 ul ekle. Bu pi leke için bir pozitif kontrol olarak hizmet etmektedir. MKH çoğunluğu PI-lekeli hücre ölümünü gösteren olacaktır. Etanol çözeltisini çıkarın. </li><li> Her oyuğa propidyum iyodür leke çözeltisi 100 ul ilave edin ve bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 20 dakika inkübe edilir. </li><li> 1 dakika sonra 2 kez 0.1 M fosfat tampon maddesi ile hücreleri durulayın. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 0.1 M P0 4 tampon maddesi içinde% 4 PFA hücreleri saptamak. 7 dakika boyunca üç kez PFA çıkarın ve PBS ile yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 st için bloke edici çözelti içinde seyreltildi DAPI çözeltisi (01:50) ile inkübe edin. Tüm kuyuları durulayın7 dakika sonra 3 kez PBS ile yıkandı. </li><li> DAPI çözeltisi çıkarın ve 7 dakika, 3 kez PBS ile her bir yıkayın. Görüntüleme kadar 4 ° C&#39;de 96-çukurlu plaka ve mağaza örtün. </li></ol></li></ol> 4. Otomatik Görüntüleme ve Multiwavelength Puanlama Analizi <ol><li> 96-plaka yükleyin HCS sistemine (daha önce Ki67 immunolabeling veya propidyum iyodür lekeli için işlenmiş) ve 20 dk HCS sistem görüntü toplama ve analiz yazılımı açın için plaka gelmesini sağlayınız. </li><li> Hücreler Otomatik Pozlama fonksiyonu kullanarak ikamet ve ilgi her dalga boyu için ofset hesaplamak Z&#39;nin-düzlemi bul 1&#39;den binning kamera ve 2 bir kazanç ayarını kullanarak 10X objektif için satın alma ayarlarını seçin. Bu analiz için, DAPI (W1), Cy3 (W2) ve FITC (W3) için yakalama görüntüleri. Negatif kontrol kuyuları görüntü elde etmek için hiçbir sinyal gösteriyor ki maksimum yoğunluk düzeyini seçin. Bu ayarı onaylayın pos için uygunitive kuyular. </li><li> Plaka Edinme. Görüntü yakalamak ve görüntü elde etme ve analiz yazılımının veri tabanında saklayabilirsiniz. </li><li> Görüntüleri elde edildikten sonra, görüntülerden açık görüntü toplama ve analiz çevrimdışı yazılım ve inceleme plakası verileri yukarıda satın aldı. </li><li> Çok dalga boyu puanlama analizi seçin. Her dalga boyu için minimum ve maksimum yoğunluklar yapılandırın. NOT: DAPI tespiti her görünür çekirdeğin etrafında boyama işaretlemeniz gerekir. Cy3 Ki67 immünoreaktivitesinde (IR) ile pozitif hücrelerini tespit edilmeli ve negatif kontroller altında kızılötesi tespit etmemelidir. Cy3 Ki67 IR için, yaklaşık minimum genişlik yaklaşık maksimum genişlik 30 mikron idi, 7 mikron idi, yerel arka plan üzerinde yoğunluk 150 gri düzeyi idi, ve minimum lekeli alan 50 mikron 2 oldu. </li><li> Tüm pozisyonlar için çalıştırın analizi. Elektronik tabloda görüntülemek için veri verir. </li></ol> 5. Hücre Takibi <ol><li> Açık görüntü acquisition ve analiz programı ve üzerine tıklayın &quot;Değerlendirme Plaka Veri [DB] ...&quot;, ilgi plaka seçme. </li><li> &quot;Well vs Time&quot; gibi verileri görüntüleyin. </li><li> İstenilen seçimi sol tıklayarak &quot;Yer&quot; bölümünden sitelerinden birini seçin. Seçin altında &quot;... Bulaşan&quot; &quot;dalga boyundaki:&quot;. Sağ 96-plaka şablonunda hedefin üzerine tıklayın ve &quot;Yük Images&quot; üzerine tıklayın. </li><li> &quot;Apps&quot; ve ardından &quot;Parça Nesneleri&quot; üzerine tıklayarak hücreleri izleyin. </li><li> Kullan &quot;Dinamik Veri Değişimi (DDE)&quot; gibi verileri, Microsoft Excel ihracat biçimi seçin. </li><li> Kökeni, delta x ve delta y örneğin ihracat, geçen zaman, nesne numarası, mesafe, zaman aralığı, hız, mutlak açı, mesafe izleme verilerini seçin. </li><li> Hedef hücreler üzerinde &quot;Ctrl tuşu + sol klik&quot; ile ilgi her hücre Etiketi. </li><li> Parça hücreleri. Gerekirse, / durdurma &quot;Esc&quot; tuşu ile hücrelerin uygunsuz izleme değiştirmek ve ardından ayarları. </li><li> Hücre izleme tamamlandıktan sonra, &quot;Log Data&quot; ile verileri kaydetmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Thoenen, H., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins:+from+enthusiastic+expectations+through+sobering+experiences+to+rational+therapeutic+approaches.">Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches.</a> Nature neuroscience. 5 Suppl, 1046-1050 (2002).</li><li>Park, H., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+regulation+of+neural+circuit+development+and+function.">Neurotrophin regulation of neural circuit development and function.</a> Nature reviews. 14, 7-23 (2013).</li><li>Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+for+midbrain+dopaminergic+neurons.">GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons.</a> Science (New York, N.Y.). 260, 1130-1132 (1993).</li><li>Azizi, S. A., Stokes, D., Augelli, B. J., DiGirolamo, C., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+and+migration+of+human+bone+marrow+stromal+cells+implanted+in+the+brains+of+albino+rats--similarities+to+astrocyte+grafts.">Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3908-3913 (1998).</li><li>Prockop, D. J., Gregory, C. A., Spees, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+strategy+for+cell+and+gene+therapy:+harnessing+the+power+of+adult+stem+cells+to+repair+tissues.">One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 Suppl 1, 11917-11923 (2003).</li><li>Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+of+the+spinal+cord+following+intravenous+delivery+of+bone+marrow+cells.">Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells.</a> Glia. 39, 229-236 (2002).</li><li>Hofstetter, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+stromal+cells+form+guiding+strands+in+the+injured+spinal+cord+and+promote+recovery.">Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2199-2204 (2002).</li><li>Chopp, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+neural+injury+with+marrow+stromal+cells.">Treatment of neural injury with marrow stromal cells.</a> Lancet neurology. 1, 92-100 (2002).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+marrow+stromal+cells+restores+cerebral+blood+flow+and+reduces+cerebral+atrophy+in+rats+with+traumatic+brain+injury:+in+vivo+MRI+study.">Transplantation of marrow stromal cells restores cerebral blood flow and reduces cerebral atrophy in rats with traumatic brain injury: in vivo MRI study.</a> Journal of neurotrauma. 28, 535-545 (2011).</li><li>Jin, H. K., Carter, J. E., Huntley, G. W., Schuchman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+into+acid+sphingomyelinase-deficient+mice+delays+the+onset+of+neurological+abnormalities+and+extends+their+life+span.">Intracerebral transplantation of mesenchymal stem cells into acid sphingomyelinase-deficient mice delays the onset of neurological abnormalities and extends their life span.</a> The Journal of clinical investigation. 109, 1183-1191 (2002).</li><li>Harper, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+BDNF-secreting+mesenchymal+stem+cells+provides+neuroprotection+in+chronically+hypertensive+rat+eyes.">Transplantation of BDNF-secreting mesenchymal stem cells provides neuroprotection in chronically hypertensive rat eyes.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52, 4506-4515 (2011).</li><li>Arnhold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirally+transduced+bone+marrow+stromal+cells+differentiate+into+pigment+epithelial+cells+and+induce+rescue+effects+in+RCS+rats.">Adenovirally transduced bone marrow stromal cells differentiate into pigment epithelial cells and induce rescue effects in RCS rats.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 47, 4121-4129 (2006).</li><li>Inoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+transplantation+of+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+delays+retinal+degeneration+in+the+RCS+rat+model+of+retinal+degeneration.">Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal degeneration in the RCS rat model of retinal degeneration.</a> Experimental eye research. 85, 234-241 (2007).</li><li>Xia, X., Wong, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+a+high-content+screening+approach+to+stem+cell+research+and+drug+discovery.">Concise review: a high-content screening approach to stem cell research and drug discovery.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 30, 1800-1807 (2012).</li><li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ki-67+protein:+from+the+known+and+the+unknown.">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of cellular physiology. 182, 311-322 (2000).</li><li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAPI:+a+DNA-specific+fluorescent+probe.">DAPI: a DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic &amp; histochemistry : official publication of the Biological Stain Commission. 70, 220-233 (1995).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow.">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418, 41-49 (2002).</li><li>Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+and+human+bone+marrow+stromal+cells+differentiate+into+neurons.">Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons.</a> Journal of Neuroscience Research. 61, 364-370 (2000).</li><li>Huang, B., Tabata, Y., Gao, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+as+therapeutic+agents+and+potential+targeted+gene+delivery+vehicle+for+brain+diseases.">Mesenchymal stem cells as therapeutic agents and potential targeted gene delivery vehicle for brain diseases.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 162, 464-473 (2012).</li><li>Uccelli, A., Benvenuto, F., Laroni, A., Giunti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+features+of+mesenchymal+stem+cells.">Neuroprotective features of mesenchymal stem cells.</a> Best Pract Res Clin Haematol. 24, 59-64 (2011).</li><li>Forostyak, S., Jendelova, P., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchymal+stromal+cells+in+spinal+cord+injury,+regenerative+medicine+and+possible+clinical+applications.">The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury, regenerative medicine and possible clinical applications.</a> Biochimie. 95, 2257-2270 (2013).</li><li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+lentivirus-mediated+TH+and+GDNF+genetic+engineering+mesenchymal+stem+cells+on+Parkinson's+disease+rat+model.">The effect of lentivirus-mediated TH and GDNF genetic engineering mesenchymal stem cells on Parkinson's disease rat model.</a> Neurological sciences : official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology. 32, 41-51 (2011).</li><li>Harper, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+released+from+engineered+mesenchymal+stem+cells+attenuates+glutamate-+and+hydrogen+peroxide-mediated+death+of+staurosporine-differentiated+RGC-5+cells.">Brain-derived neurotrophic factor released from engineered mesenchymal stem cells attenuates glutamate- and hydrogen peroxide-mediated death of staurosporine-differentiated RGC-5 cells.</a> Experimental eye research. 89, 538-548 (2009).</li><li>Harrill, J. A., Freudenrich, T. M., Machacek, D. W., Stice, S. L., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+human+embryonic+stem+cell-derived+hN2+cells+using+automated+high-content+image+analysis.">Quantitative assessment of neurite outgrowth in human embryonic stem cell-derived hN2 cells using automated high-content image analysis.</a> Neurotoxicology. 31, 277-290 (2010).</li></ol>

Bu video makalede için yayın ücretleri Molecular Devices, LLC tarafından desteklendi.

Yetişkin mezenkimal kök hücreler (MKH) hücresel ve gen teslimi bazlı tedavi birleştiren deneysel bir stratejinin geliştirilmesi için cazip bir hücre tipi vardır. MKH 17,18 paradigmalar / ayırt uygun indüksiyon ile nöronal ve glial soy içine transdifferentiating, mezodermal kökenli hücrelerin içine ayırt edebilen Multipotent, ve önemli plastisite görüntüler. Ayrıca, MSC&#39;ler, transplante edilmiş ve nörodejeneratif koşulların 19 gibi hastalıkların bir dizi için klinik öncesi çalışmalarda etkili olduğu kanıtlanmıştır. MSC terapötik etkinliği de bunların faydalı anti-proliferatif, anti-enflamatuar ve anti-apoptotik faaliyetleri 20 dolayı bilinmektedir. MSC&#39;ler da muhtemel yaralanma ya da hastalık 21. bölgelerinde transplantasyonundan sonra saf MSC ile bağlantılı nöro-koruyucu özelliklerine katkıda çeşitli nörotrofik büyüme faktörleri üretmek ve salgılamak için bilinmektedir. Importantly, MSC&#39;ler genetik Birleştirilen hücresel ve gen terapisi tabanlı uygulamalar için nörotrofik faktörlerin sürekli verilecek şekilde modifiye edilebilir ve merkezi sinir sistemi 11,19,22 yaralanma ya da hastalığının hayvan modellerinde bir çok kullanılmaktadır. Bir birleştirilmiş hücreli ve gen tedavisi bazlı stratejisinin geliştirilmesinde, bu hücrelerin, sağlık dikkatli bir şekilde in vitro bunların yaygın kullanımı öncesi ve özellikle in vivo uygulamalarda değerlendirilmiş önemlidir. Kavramının bir kanıtı olarak, biz bir yüksek içerik tarama (HCS) yaklaşımı kullanılarak hücre sağlık ve fitness genetik değişikliklerin sonuçlarını incelemek amacıyla tasarlanmış ve kontrol MSC hatlarının birden popülasyonları araştırdık. Genel olarak, HCS hücresel görüntü tabanlı yüksek verimli tarama 14 anlamına gelir. Bu tarama yaklaşımı mekansal çok düzeyde (gün milisaniye) (hücre içi hücre) ve temporal res hücresel fenotip bir nicel değerlendirmesini izinÇeşitli deneysel koşullar arasında lere. Hücre proliferasyonu, yeşil flüoresan protein (GFP), hücre ölümü ve hücre hareketi / göç: aşağıdaki parametreler üzerinde alt-tabaka tercih olası farklar girip Bu yaklaşım kullanılarak. Deneyler, 96-iyi hücre kültür plakası biçiminde tasarlanmıştır. Tek bir plaka içinde rutin lentiviral-transduced hücrelerin farklı MSC popülasyonları için her parametreye göre olası substrat ilgili farklılıklar araştırıldı ve orijinal ile mühendislik MKH&#39;lerin olmayan transdüse MKH karşılaştırdık. Bu da doğrudan bir zaman atlamalı dijital görüntüleme gerçekleştirerek propidyum iyodür boyaması kullanılarak Ki 67 immün, ölü / canlı hücre canlılığı deneyi kullanılarak, hücre proliferasyonu gibi in vitro testlerin pil ve hücre davranışı farklı MSC alt tiplerinin sonuçları karşılaştırmak için bir araç temin . Bir de bireysel w toplanan klimalı ortam örnekleri üzerinde ELISA&#39;lar gerçekleştirebilirsiniz bu HCS bir uzantısı olarakarşın kantitatif nörotrofik faktörlerin salgılanmasını tespit etmek için. Farklı MSC alt tipleri elde edilen koşullu ortam ayrıca salgılanan faktörler 11,23 biyolojik aktivitesini belirlemek için in vitro biyo-deneyler kullanılabilmektedir. HCS platformun Bu tür, aynı zamanda primer nöron kültürleri ve nöral kök hücre hatları 24 nörit büyümesinin in vitro ölçümü için kullanılabilir. Genel olarak, bizim sonuçlar genetiği değiştirilmiş MKH subpopülasyonunun olmayan değiştirilmiş MSC karşılaştırıldığında benzer davranışları görüntülenen gösterdi. hücre büyümesi ve hücre göçü üzerinde çeşitli kültür yüzeylerde etkisi dramatik MSC alt tipleri arasında farklı yanı sıra, kültür substratları değildi. Gibi, test hücre dışı matris yüzeyler bu farklı projelendirilmiş MSC hücre davranışı bu yönlerini modüle kritik bir rol oynamaya görünmedi. Bu çalışma, ayırıcı analiz etmek için bir HCS sisteminin kullanımını gösterirHücre davranış t yönleri. Bununla birlikte, görüntü analizi ile ilgili sınırlamaları karşılaşmaya bir durum değildir. Floresan görüntüleri analiz ederken vesilesiyle, bu immunolabeled veya lekeli hücreler gibi pozitif lekeli / etiketli sayılır olacağını yukarıda doğru eşik değerini belirlemek için biraz zor oldu. Bu durumda, ilgili verevi en aza indirmek için, eşik değerlerinin belirlenmesi kontrolleri ile bir karşılaştırma (floresans görüntüleme için negatif kontroller birincil ya da ikincil antikor ihmal bütün işlem esnasında paralel olarak yapılmıştır) bağlı idi. Başka bir sınırlama zamana atlamalı sayısal görüntüleme kullanarak hücre göçü analizi sırasında karşılaşıldı. Bazı durumlarda, görüntü programı aslında sadece çok kısa bir mesafe giden bir hücre karşı bir hücrenin rastlantısal Brown hareketi arasında ayırt etmek mümkün değildi. Analiz yazılımı multip varlığını ayırt etmek mümkün değildi nerede ek sınırlamalar durumlarda belli oldubir-bir çok yakın le hücreleri. Analizi yerine tam otomatik analiz sırasında bu sınırlama gerekli manuel hücre seçimi üstesinden gelmek için. Hücre kaplama yoğunluğu, aynı zamanda, birbirinden ayrı olarak büyür hücrelerine karşın yığınlarda büyümesini daha fazla tercih kullanmaz hücre popülasyonları arasında hücre göçü veri eğriltme neden olabilir. Farklar Bu tür bir parçası muhtemelen hücre-hücre tercihleri ​​karşı hücre alt-tabaka bir yansıması içindedir. Görüntü elde ve veri analizi gerçekleştirmek için bir HCS sistemi kullanarak verimli ve hızlı araçlar birden fazla hücre parametrelerini değerlendirmek için sağlar. Ayrıca, 30 farklı koşullar (6 yüzeyler ve 5 farklı MSC alt tipleri) için hızlandırılmış dijital videolar rutin çevre odasını kullanırken saat gün (48 saat) arasında değişen sürelerle elde edildi. Bu veriler, daha sonra, farklı ECM çeşitli hücre çizgileri boyunca hücre göçü oranlarındaki farklılıkları hesaplanması ve belirlemek için kullanılmıştırmoleküller. Bu yazıda, hücre sağlığı ve fonksiyonlarını değerlendirmek için bir içeriği yüksek tarama platformu uygulanmasını sermiştir. Bu tip analiz daha yönlendirilmiş hücre büyümesini ve sinir yeniden oluşumu kolaylaştıran hücre türlerini ve aynı zamanda, polimer alt tabakaları tasarımı için rasyonel stratejiler geliştirilmesi için kullanışlıdır. Bu hücre nakli stratejilerini kullanarak in vivo klinik öncesi çalışmalarda önce geniş terapötik faktörlerin kök hücre tabanlı teslimat uygulaması yönünde önemli bir adımdır.

Sinir sistemi bozukluklarının tedavisi için yararlı tedavilerin uygulanması ile ilgili bir ana sorunu daha da dejenerasyonu önlemek ve aynı zamanda fonksiyonlarının eski haline gelmesini kolaylaştıran etkili yöntemler geliştirmek bulunmaktadır. Yenilikçi bir strateji öncesinde nakli için nöro-koruyucu faktörler, üretimi için genetik olarak kök hücreleri ex vivo olarak etmektir. Gen terapisi, bir tür ile birleştiğinde hücre bazlı Tedavinin bu kombinasyonu, sinir sistemi hastalık veya hasar kaynaklı nöron ölümünün tedavisi için güçlü bir yöntem sunar. Nörotrofik faktörler, olgun nöronların büyümesi ve gelişmekte olan sinir hücrelerinin hayatta kalma olarak bakım ve plastisite için gereklidir. Bir dizi çalışma, merkezi ve periferik sinir sisteminde nöronların (sinir sistemi ve periferik) ilk büyümesini ve farklılaşmasını teşvik nörotrofik faktörlerin önemli roller göstermiştir ve ayrıca, in vitro olarak ve rejenerasyonu uyarabilirsinir yaralanması 1 Nimal modelleri. Beyin-türevli nörotrofik faktör (BDNF) yüksek CNS ifade ve nöral gelişimi, sinaptik plastisite ve onarım 2. düzenleyen önemli roller oynar. Glial hücre çizgisi türevli nörotrofik faktör (GDNF), dopaminerjik ve nörotoksinlerini 3 de dahil olmak üzere çok çeşitli nöronların hayatta kalmasını teşvik eder. Bu nedenle, sinir tamiri için önemli bir stratejidir sinir sisteminin zarar gören ya da hastalıklı bölgelere nörotrofik faktörlerin dışsal kaynaklarını sağlamaktır. Multipotent kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler (MKH) hasarlı ya da hastalıklı sinir sistemini tedavi etmek için terapötik proteinlerin teslimat için büyük bir potansiyele sahip. Onlar, 2) multipotansiyel kapasite, 3) küçük etik kaygılar, 4 izolasyon ve bakım 1) göreli kolaylığı da dahil olmak üzere bir çok avantaj var çünkü MKH transplantasyonu hastanın uyumlu hücre tabanlı tedaviler geliştirmek çabalarında de dikkat çekti) Hayatta ve otolog transplantasyon 4,5 için nakli ve 5) potansiyeli aşağıdaki göç yeteneği. Ümit verici sonuçlar, omurilik yaralanması, 6,7, felç 8,9, miyelin yetmezliği 10 ve retinal dejenerasyon 11-13 dahil olmak üzere farklı nörodejeneratif koşullar, bir dizi hayvan modellerinde naif ve genetik olarak MSC kullanımı ile bildirilmiştir. Genetik olarak kök hücrelerden nörotrofik faktörlerin teslim hücre nakli Kaplin yeni ve önemli sinir onarım stratejisidir. Hücre tabanlı tedavi faktör teslim sistemlerinin geliştirilmesinde önemli bir adım mühendislik hücrelerin normal sağlığını belirlemektir. Gibi, bu çalışmanın temel amacı, genetik olarak erişkin kök hücrelerin genel büyüme parametrelerini değerlendirmektir. Hızla birden fazla hücre parametrelerini değerlendirmek için önemli bir yaklaşım hücresel görüntü tabanlı yüksek yoluyla Ekranlanması istihdam etmekg (HTS), genellikle yüksek içerik tarama (HCS) prosedürleri 14 anılacaktır. Bu teknoloji otomatik görüntü toplama ve analiz sağlar ve bu yaklaşım kök hücre araştırma uygulamaları için özellikle uygundur. Bu projede genetik mühendisliği erişkin kök hücreler HCS sistemi kullanan hücre tabaka tercihleri ​​ve hücresel fonksiyonların hızlı karakterizasyonu ve optimizasyonu sağlayan bir profil platformu geliştirdi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655090</td>
			<td>96 well plates selected for use in ImageXpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Abcam (Cambridge, MA)</td>
			<td>Ab16667</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>C7661</td>
			<td>Collagen from rat tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL(Entactin-Collagen-Laminin)</td>
			<td>Millipore/Chemicon (Temecula, CA)</td>
			<td>08-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Chemistry Store (Ames, IA)</td>
			<td>12003510</td>
			<td>100%, 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>CB-40008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbeccos Medium (IMDM)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P285</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P288</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminine (mouse)</td>
			<td>Trevigen (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice</td>
			<td>Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA)</td>
			<td></td>
			<td>Isolated from bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF)</td>
			<td>These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>O4042</td>
			<td>4% PFA in 0.1M PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% (EDTA 1X)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>12440&#8211;046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridoma-qualified FBS</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>ImageXpress micro</td>
			<td>High content screening system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Image acquisition and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput characterization of adult stem cells engineered for delivery of therapeutic factors for neuroprotective strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

MSC büyüme parametreleri farklı yüzeylerde MKH farklı popülasyonlar kültürlenmesiyle incelendi. MSC alt tipleri (MSC, GFP MSC&#39;ler BDNF-GFP MSC&#39;ler, GDNF-GFP MSC&#39;ler ve BDNF / GDNF-GFP MSC&#39;ler) beş farklı popülasyonlar 96 oyuklu doku kültür plakalarına farklı ile önceden kaplanmış kaplanmıştır Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, alt-tabakalar. kültür dört gün sonra, plakalar sabittir ve imüno-ve / veya uygun reaktifler ile boyandı ve daha sonra HCS sistemi kullanılarak incelendi ve görüntü elde etme ve analiz yazılım programı ile yapılan analizleri yapıldı. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52242/52242fig1highres.jpg" width="650" /> Şekil 1:. Şablon gösterilen deney tasarımı için 96 oyuklu plaka şablonu 96-yuvalı plakalar, çeşitli substratlar ve kuyu ile kaplandı projelendirilmiş kök hücreleri ile tohumlanmıştır. Bir örnek olarak, sadece welsatırlar BF mı bu deneyde kullanıldı. Satırlar A, G ve H boş bırakılmıştır. Kısaltmalar - MKH: mezenkimal kök hücreler; GFP-MKH: yeşil floresan protein ifade MKH; BDNF-GFP-MKH: Beyin nörotrofik faktör-GFP ifade MKH türetilmiş; GDNF-GFP-MKH; Glial nörotrofik faktör-GFP-ifade MSC hücre-türevi; BDNF / GDNF-GFP-MKH; BDNF ve GDNF- GFP ifade MSC&#39;ler; ECL: entactin-Kollajen IV-laminin). DAPI counterstaining ardından Anti-Ki67 immünoyaftalama, farklı yüzeyler mühendislik MSC (Şekil 2A) farklı popülasyonlar çoğalmasını etkilemiş olup olmadığını değerlendirmek için kullanıldı. Ki67 antijen ifadesi hücre döngüsünün G1, S, G2 ve M, geç aşamalarında, tercihen oluşur ve dinlenme fazında hücreler (G 0) tespit edilmez ve dolayısıyla proliferasyon 15 hücresel marker olarak yararlı olan . 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), yaygın olarak kullanılan bir nu olanDNA 16 bölgelere AT bağlanması üzerine mavi floresan yayar açık ve kromozom counterstain. bir alandaki hücre sayısı DAPI lekeli çekirdeklerin sayısını sayarak tespit edilebilir. Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi, bir varyasyon çoğalan MSC yüzdelerinde olmasına rağmen, bütün alt tabakalar yine MSC alt tiplerinin her biri için önemli bir hücre çoğalmasını desteklenir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" width="700" /> Şekil 2: Ki67 hücresi çoğalma tahlili. (A) Birleştirilmiş, Ki67 immunolabeling (kırmızı) ve DAPI (mavi) nükleer boyanma çift floresan görüntü. MSC çoğu Ki67 antikor (kırmızı) ile immunolabeled edildi. Ölçü bar = 50 um. Polistiren (PS) üzerinde büyümüş MSC alt tipi imüno-Ki67 yüzdeleri, poli-L-lisin (PLL) gösteren (B), çubuk grafik, fibronektin, kolajenin vitro (DIV) 5 gün boyunca ben, laminin, ya entactin-kolajen IV-laminin (ECL) yüzeylerde yazın. N bir deney =. Her çubuk, her durum için 2 kuyudan 8 görüntülü sitelerden toplanmış verileri ortalama temsil etmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Propidyum iyodür (PI) boyama farklı alt-tabakalar, hücre hayatta kalma (Şekil 3) etkileyip etkilemediğini değerlendirmek için kullanıldı. Propidium iyodür yaygın olarak kullanılan bir kırmızı floresan nükleer ve kromozom counterstain olduğunu. Propidium iyodür membran geçirgenliği olmayan ve genellikle canlı hücreler dışında, ve böylece popülasyonda ölü hücreleri tespit etmek yararlıdır. bir alan içinde tüm hücreleri belirlemek için örneğin DAPI gibi genel bir nükleer etiket ile bir araya getirildiğinde, belirli bir durum içinde Ölü hücrelerin oranı tespit edilebilir. PI-pozitif hücrelerin yüzdesi incelenen tüm yüzeylerde düşük (Şekil 3). PI reaktif için pozitif bir kontrol olarak MSC içeren birkaç kuyu,% 70 etanol içinde Şekil 3B ve 3C&#39;de gösterildiği gibi, PG-işaretli hücrelerin yüksek oranda ortaya çıkan en hücrelerini öldürmek için bilinen bir durum kuluçkalanmıştır (etanol pozitif tedavi kontrol). <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" width="700" /> Şekil 3: Propidyum iyodür hücre ölümü deneyi. (A) Birleştirilmiş, propidyum iyodür (kırmızı) ve DAPI (mavi) boyama için çift floresan görüntü. Canlı hücreler tüm çekirdekleri DAPI (mavi) ile boyandı, ancak hiçbir propidyum iyodid lekeleme MSC. (B) hemen hemen tüm MSC&#39;ler,% 70 etanol maruz kaldıktan sonra, propidyum iodid ile boyanmış saptandı. A Ölçek çubukları ve B = 100 um. Propidyum iyodür (PI) yüzdelerini gösteren (C), bir bar grafiktir lekeli MSC alt tipipolistiren (PS), poli-L-lisin (PLL), fibronektin, in vitro (DIV), 5 gün boyunca kollajen tip I, laminin veya entactin-kolajen IV-laminin (ECL) alt-tabakalar üzerinde büyüdü. Etanol Kontrol: Bu durum, PI boyama reaktif için bir pozitif kontrol olarak görev yapmıştır. PI leke aşağıdaki etanol muamelesine tabi Çoğu hücreler ölü ve böylece olumlu PI reaktif lekeli. N bir deney =. Her çubuk, her durum için 2 kuyudan 8 görüntülü sitelerden toplanmış verileri ortalama temsil etmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> , Hücre göçü time-lapse dijital mikroskopi ve HCS sistemine iletilen ışık / çevre odası sistemi kullanılarak analiz edilmiştir mühendislik MSC davranışları farklı yüzeylerde olası etkisini araştırmak için (Ek video 1). Çoklu siteleri / kuyu time-lapse görüntülendive görüntü elde etme ve analiz yazılım programı kullanılarak farklı yüzeylerde büyüyen MSC farklı alt popülasyonlar için hücre göçü oranlarını hesaplamak için kullanılan. Şekil 4C&#39;de gösterildiği gibi, genel olarak, MSC her alt tipi, hücre dışı matris kaplı yüzeyler için (fibronektin, kolajen, laminin ve ECL) ve non-kaplamalı polistiren yüzeylerde yavaş en hızlı göç oranı göstermiştir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" width="700" /> Şekil 4:. Hücre izleme ve göç MKH görüntü elde etme ve analiz yazılımı ile takip etti. 29 saat sonra time-lapse görüntüleme oturumun sonunda en time-lapse görüntüleme ve (B) (A) baştan iletilen ışık ve floresan görüntülerin Bindirme görüntüleri (Ek video 1). Hücre göç izleri renkli li gösterilirnes. Ölçek çizgisi:. 50 um (C), bir bar grafiktir ortalama geçiş oranlarını gösteren (mm / saat olarak ifade edilir), MSC alt-tipleri için (PS), polistiren üzerinde yetişen, poli-L-lisin (PLL), fibronektin, kolajen tip I, laminin in vitro (DIV) 2 gün süreyle veya entactin-kolajen IV-laminin (ECL) yüzeylerde. N bir deney =. Her çubuk, her durum için 2 kuyulardan en az 10 görüntülü hücrelerin ortalamasını temsil etmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar GDO&#39;lu MKH bu subpopülasyonunun benzer büyüme özelliklerini görüntülemek yönünde ön kanıtlar sağlamıştır. Bu sonuçlar Lentiviral bu tarama platformu kullanılarak incelenmiştir büyüme parametreleri üzerinde dramatik saptanabilir zararlı etkileri kaynaklı bu MKH genetik değişiklikler aracılı dair güçlü kanıtlar sunmaktadır. Ek Video 1. Time-lapse dijital video. göç yolu, iki MSC için var [1 (yeşil hat izleme) ve 2 (Mavi izleme hattı) olarak belirtilmiştir] gösterilmiştir. Video, 29 saat süresince ele geçirdi. Görüntüler her 5 dakikada yakalandı. GFP-ifade MSC floresans görüntüleri video hazırlama zaman atlamalı görüntüleme için kullanılmıştır. Kalibrasyon çubuğu 50 mikron =. Bu tip bir analiz, hücre göçü ve hücre bölünmesi de dahil olmak üzere hücre davranışlarını araştırmak için yararlıdır.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies at JoVE.com

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Nöroprotektif Stratejileri Tedavi Faktörleri teslimi için tasarlandı Erişkin Kök Hücre Yüksek Verimli Karakterizasyonu

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

high-throughput-characterization-adult-stem-cells-engineered-for

Research

JoVE Journal

Medicine

10.7K Görüntüleme.  Iowa State University. This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Video: High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

Protein Therapeutics İmalat Hücre Hatları Kalkınma Yüksek throughput Otomatik Platformu

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Tıp

Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation can induce a progressive and debilitating decline in cognition that may, in part, be caused by the depletion of neural stem cells. Given the increased survival of patients diagnosed with brain cancer, quality of life in terms of cognitive health has become an increasing concern, especially in the absence of any satisfactory long-term treatments.
To address this serious health concern we have used stem cell replacement as a strategy to combat radiation-induced cognitive decline. Our model utilizes athymic nude rats subjected to cranial irradiation. The ionizing radiation is delivered as either whole brain or as a highly focused beam to the hippocampus via linear accelerator (LINAC) based stereotaxic radiosurgery. Two days following irradiation, human neural stem cells (hNSCs) were stereotaxically transplanted into the hippocampus. Rats were then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and for the expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. Our cognitive testing paradigms have demonstrated that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function. Unbiased stereology reveals significant survival (10-40%) of the engrafted cells at 1 and 4-months after transplantation, dependent on the amount and type of cells grafted. Engrafted cells migrate extensively, differentiate along glial and neuronal lineages, and express a range of immature and mature phenotypic markers.
Our data demonstrate direct cognitive benefits derived from engrafted human stem cells, suggesting that this procedure may one day afford a promising strategy for the long-term functional restoration of cognition in individuals subjected to cranial radiotherapy. To promote the dissemination of the critical procedures necessary to replicate and extend our studies, we have provided written and visual documentation of several key steps in our experimental plan, with an emphasis on stereotaxic radiosurgey and transplantation.

Brain tumor patients routinely undergo cranial radiotherapy, and while beneficial, this treatment often results in debilitating cognitive dysfunction. This serious unresolved problem has at present, no clinical recourse, and has driven our efforts to devise stem cell based therapies for the recovery of radiation-induced cognitive decrements.

Kranial Radyoterapi neden Bilişsel Disfonksiyon Restorasyon Kök Hücre Transplantasyon Stratejileri

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Uzaktan Yüksek throughput fenotipleme için Fare Göz Enükleasyon

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve diagnostic and prognostic testing in a clinical setting and may help guide therapeutic interventions. When large numbers of candidate proteins are identified, it may be difficult to validate candidate biomarkers in a timely and efficient fashion from patient plasma samples that are event-driven, of finite volume and irreplaceable, such as at the onset of acute graft-versus-host disease (GVHD), a potentially life-threatening complication of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT).
Here we describe the process of performing commercially available ELISAs for six validated GVHD proteins: IL-2R&alpha;5, TNFR16, HGF7, IL-88, elafin2, and REG3&alpha;3 (also known as PAP1) in a sequential fashion to minimize freeze-thaw cycles, thawed plasma time and plasma usage. For this procedure we perform the ELISAs in sequential order as determined by sample dilution factor as established in our laboratory using manufacturer ELISA kits and protocols with minor adjustments to facilitate optimal sequential ELISA performance. The resulting plasma biomarker concentrations can then be compiled and analyzed for significant findings within a patient cohort. While these biomarkers are currently for research purposes only, their incorporation into clinical care is currently being investigated in clinical trials.
This technique can be applied to perform ELISAs for multiple proteins/cytokines of interest on the same sample(s) provided the samples do not need to be mixed with other reagents. If ELISA kits do not come with pre-coated plates, 96-well half-well plates or 384-well plates can be used to further minimize use of samples/reagents.

High throughput validation of multiple candidate biomarkers can be performed by sequential ELISA in order to minimize freeze/thaw cycles and use of precious plasma samples. Here, we demonstrate how to sequentially perform ELISAs for six different validated plasma biomarkers1-3 of graft-versus-host disease (GVHD)4 on the same plasma sample.

Akut Graft-Versus-Host Hastalığı Biyomarkörler onaylanması için Yüksek Verimli Sıralı ELISA

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

Hazırlık ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mıknatıslanmış karakterizasyonu Endotel Hücreleri miR-modifiye

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

Bir Fare Modelinde Tedavi Edici Kök Hücrelerin Glioblastomaya İntranazal Dağıtımı

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...