Biz floresan proteinleri kodlayan plazmid DNA sağlamak için Mike W. Davidson (Florida Eyalet Üniversitesi) teşekkür ederim. Bu çalışma, Sağlık hibe GM72048 (dwp) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir.

1. Floresan protein damlacık numunelerin hazırlanması Bir floresan protein damlacık örnek su aşamasında bulunan floresan protein ile 1-octanol/water emülsiyon oluşur. Bu emülsiyon mikroskopi uygulamaları için bir mikroskop lamı ve 22 mm kare cam kapak arasında sıkışmış. <ol><li> Floresan protein damlacık örnekleri yapmadan önce mikroskop slayt ve kapak camları hidrofobik bir ajan ile temizlenmeli ve kaplanmış olması gerekir. </li><li> Cam, aseton ile 5 dakika yıkayarak temizleyin ve hava ile kurumaya bırakın. (İsteğe bağlı olarak, cam temizlendikten sonra plazma temiz optimal kaplama sonuçları elde etmek için 30 saniye boyunca tedavi edilebilir). </li><li> Bu çözüm bir 2 dakika inkübasyon sırasında, aseton ve kat cam% 2 methyltrimethoxysilane çözüm hazırlayın. Çözüm cam kaplama sonra çıkarın ve hava ile kurumaya bırakın. Sonra bir sprey şişesine% 70 etanol ile yıkayın ve tekrar kurumaya bırakın. (İsteğe bağlı olarak, bu noktada cam ° C kovalent cam kaplama bağlamak için 1 saat 80 pişmiş olabilir). Kaplamalı cam, en az bir ay süreyle saklanabilir. </li><li> Floresan proteinlerle E. Onun 6 etiketli protein olarak saflaştırılmış. Coli 1. Saflaştırılmış protein absorbans spektrumu ölçün ve STE tampon (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH: 8, 1 mM EDTA) ~ 0.1 optik yoğunluk ile stok seyreltme hazırlamak,% 0.1 sığır serum albümin içeren (BSA) . Buna ek olarak 10 ml 15 ml konik bir tüp içerisinde 1-oktanol ve STE tampon 1:1 karışımı hazırlar ve şiddetle karıştırın. Karıştırma terk ettikten sonra, faz ayrılması tamamlanana kadar. Üst faz 1-oktanol. (Dikkat: 1-oktanol güçlü bir kokusu vardır Çünkü 1-oktanol ile temas gelir her şey için kapalı bir atık kabı kullanmak önemlidir.) </li><li> Emülsiyon pipet 45 ul 1-oktanol ve bir mikrofuge&#39;de tüp içinde 5 ul floresan protein yapmak için. Emülsiyon oluşumunu başlatmak ve sonra sonication banyosunda 30 saniye boyunca tüp sonikasyon parmağınızla birkaç kez tüp dokunun. Bu arada kaplı bir mikroskop lamı ve kapak cam hazır. Sonication sonra emülsiyon tamamen bulutlu olmalıdır. Kaplamalı bir mikroskop lamı üzerine tüp orta sonikasyon pipet 4 ul emülsiyon hemen sonra kaplı bir cam kapak ile kaplayın. </li><li> Emülsiyon işlemi yapılırsa doğru mikroskop slayt ve nesne cam arasında eşit olarak yaymak gerekir. Birkaç dakika içinde örnek çapı değişen ~ 10 mikron kalınlığında floresan damlacıkları oluşan kararlı olmalıdır. Büyük damlacıkları örnek merkezine yakın ve küçük kenarlara doğru daha da bulunmaktadır. </li></ol> 2. Bir Fotoçevrim deneme ayarlama Aşağıdaki yordam, bir floresan protein Fotoçevrim deney kurmak için genel bir strateji. Bu prosedür, canlı hücrelerin yanı sıra proteinler saflaştırılmış için uygulanabilir. <ol><li> Aşağıdaki parametreler Fotoçevrim denemeyi ayarlamak için genel bir başlangıç ​​noktası sağlar: 40x 1.3NA immersiyon yağı hedefi Görüntü boyutu = 512 x 512 piksel Tarama zum = 4 Piksel süresi = 6 μsec yaşamak. Z-çözünürlüklü (iğne deliği boyutu) = 3 mikron </li><li> Ilk ve photoconverted floresan için iki algılama kanal, yanı sıra bir &quot;Fotoçevrim kanalı&quot; yapılandırın. Bu örnekte, saflaştırılmış bir turuncu-kırmızı photoconvertible floresan protein protein, mOrange2 kullanabilirsiniz. 561 nm eksitasyon ve floresan 570 nm ve 630 nm arasında toplanan turuncu türler kullanılarak tespit edilmiştir. Photoconverted kırmızı türler 633 nm eksitasyon ve floresan 640 nm ve 700 nm arasında toplanan kullanarak tespit edilmiştir. &quot;Fotoçevrim kanal&quot; 488 nm eksitasyon ve 490 nm ve 540 nm arasında floresan toplamak için. (Not: Fotoçevrim kanal görüntüleme kesinlikle gerekli değildir) </li><li> Lazer gücü ve en iyi görüntü kalitesi için dedektör kazancı ayarlamak için sürekli tarama ile ilk floresan görüntüleme için kanal kullanın. </li><li> Fotoçevrim kanal etkinleştirin ve düşük bir lazer güç seçin. Görüntüleme başlayın ve zaman atlamalı serisi ilk floresan beyazlatma önemli görülünceye kadar yavaş yavaş Fotoçevrim lazer artırmak. Yaklaşık% 75&#39;i ilk floresan beyazlatılmış kadar tarama devam edin. </li><li> Fotoçevrim kanalı kapatmak ve photoconverted floresan için algılama kanalı etkinleştirmek. Görüntüleme, yüksek bir dedektör kazanç ve düşük lazer gücü ile başlatın ve photoconverted floresan tespit edilinceye kadar, kademeli olarak lazer gücünü artırmak. Bir kere, lazer gücü ve en iyi görüntü kalitesi için dedektör kazanç ayarlayabilirsiniz photoconverted floresan algılar. </li><li> Son olarak, lazer güç kullanılırFotoçevrim süresi Fotoçevrim gibi iyi optimize edilmesi gerekir. Fotoçevrim oranı hızlandırmak Fotoçevrim lazer gücü artırılması, ancak çok fazla lazer güç protein photobleach. </li><li> Optimal Fotoçevrim lazer gücü ve süresi, tespit edildikten sonra, bu parametrelerin standart bir photobleaching veya sıkı bağlamak modülü ve &quot;Fotoçevrim kanalı&quot; gerekli artık yapılandırmak için kullanılabilir. </li></ol> 3. MOrange2 ve Dronpa Dual-optik prob vurgulama Çünkü kırmızı-kaymıştır spektral özellikleri, mOrange2 4 ayrı hücre (organel) popülasyonları seçici vurgulayarak izin çift prob optik vurgulamak için yeşil photoswitchable floresan protein Dronpa ile kombinasyon halinde kullanıldığında olabilir. <ol><li> Hücreler cam alt Mattek yemekler büyüdü ve standart Lipofectamine2000 transfeksiyon 1 kullanarak görüntüleme önce 24 saat transfekte. </li><li> 2 numaralı bölümde açıklandığı gibi mOrange2 Fotoçevrim mikroskop ayarlayın. </li><li> Dronpa photoswitching mikroskop yapılandırın. Dronpa floresan mOrange2 &quot;Fotoçevrim kanalı&quot; (adım 2.2 &#39;e bakınız) kullanarak görüntülü olabilir. (Not: görüntüleme Dronpa için kullanılan lazer gücü en aza indirin, çünkü çok fazla lazer gücü Dronpa inaktivasyonu neden olacaktır.) Dronpa fotoaktivasyon için bir kanal ekleyin. Biz iki foton uyarma 800 nm fotoaktivasyon için kullanır, ama alternatif olarak 405 nm eksitasyon kullanılarak elde edilebilir. Lazer görüntüleme için gerekli güç, fotoaktivasyonu ve Dronpa floresan photoinactivation belirleyin. </li><li> Dikkat: mOrange2, Fotoçevrim ve Dronpa inaktivasyonu hem de 488 nm uyarma üzerine ortaya çıkar. Çünkü mOrange2 Fotoçevrim için gerekli yüksek lazer gücü bu da Dronpa floresan inaktive edecek. Öte yandan, Dronpa inaktivasyon zaten, çok daha düşük lazer güç oluşur ve önemli mOrange2 Fotoçevrim olmadan yapılabilir. </li><li> MOrange2 Fotoçevrim ve Dronpa photoswitching için parametreleri ayarladıktan sonra, çift optik prob vurgulayarak aşağıdaki adımları ile elde edilir. Birincisi, düşük güç 488 nm eksitasyon manzaralı tüm alanında Dronpa floresan inaktive. İkinci olarak, faiz ve yüksek güç 488 nm eksitasyon ile photoconvert mOrange2 bir bölge seçin. Son olarak, faiz Dronpa floresan etkinleştirmek için bir bölge seçin. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Damlacık numune hazırlama A) Doğru hazırlanmış bir damlacık örnek . B) Örnek mikroskop slayt ve kapak cam kaplama olmadan hazırlanmış. C)% 0,1 BSA eklemeden örnek hazırlanmıştır. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. MOrange2 Fotoçevrim Fotoçevrim lazer gücü ve süresi Etkisi Tek damlacıkları mOrange2 protein içeren sürekli farklı miktarlarda 488 nm lazer güç kullanarak photoconverted. Fotoçevrim için kullanılan Bağıl lazer gücü% 10 (katı),% 25 (kesikli), ve% 100 (noktalı) oldu. A) Portakal floresan türler. B) Photoconverted kırmızı floresan türü. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. MOrange2 ve Dronpa Dual-optik prob vurgulayarak mitokondri çekirdeği ve yeşil floresan turuncu floresan gösteren Fotoçevrim önce mOrange2 Histon H2B ve Dronpa-Mito ifade A) Hücre,. B) Dronpa floresan mOrange2 minimal Fotoçevrim neden, düşük güç 488 nm eksitasyon ile kapalı idi. C) yüksek güç 488 nm eksitasyon mOrange2 kırmızı photoconverted. D) Dronpa floresan 800 nm 2-foton uyarma tekrar kullanarak açık. Diferansiyel girişim kontrastlı görüntü panelleri ile birlikte floresan görüntü bindirmeleri.

<ol>
	<li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 6, 355-358 (2009).</li></ol>

Saflaştırılmış floresan protein damlacık örnek kinetik ve Fotoçevrim kinetiği photobleaching çalışma örneğin, floresan proteinleri photophysical karakterizasyonu için çok uygun bir örnek biçimidir. Photobleaching ve küvet tabanlı sistemler gerçekleştirmek için zor olabilir Fotoçevrim deneyler, son derece küçük damlacık hacmi (~ 20 picolitre) kolaylaştırır. Buna ek olarak, damlacık örnek ideal Fotoçevrim uygulamalar için bir konfokal mikroskop kurmak için uygundur burada gösterilir. H...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microsope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR Scientific</td>
<td>48312-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22 mm cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>2940-245</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-octanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O4500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>methyltrimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MatTek dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-019</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells

Photoconvertible floresan proteinleri (pc-FP) floresan renk, belirli bir dalga boyunda ışığa maruz tarafından değiştirilebilir anlamına gelir &quot;optik işaretleme&quot; özelliğine sahip bir sınıf, floresan proteinleri. Optik vurgulayarak, noninvaziv bir ICSI&#39;nin floresan moleküllerin işaretlenmesi sağlar ve bu nedenle tek hücreler veya organeller izlemek için idealdir. Verimli Fotoçevrim için kritik parametreleri Fotoçevrim ışık şiddeti ve maruz kalma süresi. Yoğunluğu çok düşükse, Fotoçevrim yavaş ya da hiç ortaya olacaktır. Öte yandan, çok fazla yoğunluk ya da çok uzun süre maruz kaldıklarından protein photobleach ve böylece Fotoçevrim etkinliğini azaltmak. Bu protokol, pc-FP Fotoçevrim uygulamalar için bir konfokal lazer tarama mikroskobu nasıl kurmak için genel bir yaklaşım açıklanmıştır. İlk olarak, saflaştırılmış protein damlacık numunelerin hazırlanması için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu örnek biçimi mikroskop altında floresan proteinleri photophysical davranış eğitimi için çok uygundur. İkincisi, biz Fotoçevrim için mikroskop nasıl yapılandırılacağı göstermek için protein damlacık örnek kullanabilirsiniz. Ve nihayet, mOrange2 ve Dronpa çift prob, optik vurgulayarak dahil olmak üzere, canlı hücreleri, optik vurgulama nasıl gerçekleştirileceği gösterecektir.

Watch this Scientific Journal Video about Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells at JoVE.com

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Bu protokol bir konfokal lazer tarama mikroskobu, floresan proteinleri Fotoçevrim gerçekleştirmek için genel bir yaklaşım açıklar. Biz Fotoçevrim puried protein örneklerinin yanı sıra, mOrange2 ve Dronpa canlı hücreleri çift prob, optik vurgulama için prosedürler açıklanmaktadır.

Canlı Hücrelerde Floresan Proteinleri ve Çift prob Optik Vurgulama Saf, Fotoçevrim

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

photoconversion-purified-fluorescent-proteins-dual-probe-optical

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Görüntüleme.  Vanderbilt University. Bu protokol bir konfokal lazer tarama mikroskobu, floresan proteinleri Fotoçevrim gerçekleştirmek için genel bir yaklaşım açıklar. Biz Fotoçevrim puried protein örneklerinin yanı sıra, mOrange2 ve Dronpa canlı hücreleri çift prob, optik vurgulama için prosedürler açıklanmaktadır.

Video: Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biyoloji

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Mikroskop Uygun Bakım ve Temizlik

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Canlı Hücre Görüntüleme için SNAP-tag Fusion Proteinler ifade COS-7 Floresan Etiketleme

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

Floresan Proteinleri Polarize Translokasyon Xenopus Wnt Sinyalizasyonu Cevabı Ektoderm

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Bir Deniz Tubeworm Canlı Optik ve Elektron Mikroskobu Teknikleri Kullanılarak kalsifikasyon Olaylar Karakterizasyonu

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...