Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

CFTR 1. Saflaştırma NOT: Bu protokolde kullanılan ekipman ve malzeme listesi için Malzeme Tablosu ve Ekipmanları bakınız. Detaylı bir protokol Sf 9-bakulovirüs sentezleme sistemi 17,28 insan Wt-CFTR aşırı ifadesi ve mutantların ihtiyaç duyulmaktadır. CFTR aşırı ifade eden ve bu protokole göre Sf&#39;ye 9 hücreleri topaklar hazırlamak. <ol><li> Kaba membran hazırlanması <ol><li> Taze elde edilir ya da standart hücre kültür olarak elde edilen aşırı eksprese eden bir C-terminali His 10 -tag ile wildtype-, F508del- veya G551D-CFTR proteini hücre 500 ml&#39;lik bir kültürden bir dondurulmuş Sf 9 hücre pelletini çözülme daha önce 17,28 tanımladı. Hücre topakları, yaklaşık 5 ml&#39;lik bir hacme ve yaklaşık 5 g ıslak ağırlığa sahip olacaktır. </li><li> Süspanse Sf sağlanması, 4 ° C&#39;de proteaz inhibitör kokteyli ile fosfat tamponlu tuzlu su içinde 20 ml (PBS), pH 7.4 (1 tablet 50 ml solüsyon) içinde 9 hücreleri,Numune görsel homojen görünür ve hücrelerin hiçbir kümeleri kalır. </li><li> Geçit başına 2 dakika boyunca 10.000 psi (tercihen 15.000-20.000 psi) az ulaşan bir yüksek basınçlı hücre Topu (Malzeme ve Ekipman Tablo) ile Hücreleri. Liziz ve 4 ° C &#39;de örnek tutun. <ol><li> Sonra hemen hücre Topu numuneyi yeniden lizis süre sonra buz üzerinde bir tüp içinde örnek toplayın. Tekrar parçalama işlemi 3 kez. % 10&#39;dan daha az sağlam kalmasını sağlamak için bir mikroskop altında incelenmesi. Not: vb cam boncuklar gibi başka yöntemler lize hücrelerin, sıkı, ancak bir kullanıcı, diğer bir yöntem, uygun gelebilir, bu sistem için incelenmiştir edilmemiştir. </li></ol></li><li> 20 dakika boyunca 2000 x g&#39;de yüksek hızlı santrifüj içinde 4 ° C&#39;de santrifüje hücre parçalama malzemesi. Süpernatant toplayın ve pelet atmayın. 20 tüp arasında süpernatan bölün ve ultracen masa üstü 125,000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 1 saat süre ile numuneler santrifüjtrifuge. </li><li> Çıkarın ve kullanılana kadar az 2 ay boyunca -80 ° C de tüplerinde pelet ve mağaza peletler bozmamaya özen supernatant veya buz üzerinde muhafaza eden ve saflaştırılmadan devam edin. </li></ol></li><li> CFTR çözündürme <ol><li> 1-4 taze veya dondurulmuş Sf 9 Kaba membran pelet elde edilir ve Tampon 1, 1 ml her bir tekrar süspansiyon (% 2 fos -choline, tam bir tarifi için bakınız Tablo 1), buz üzerinde 4 ° C de, bir 25 G iğne ve 1 ile solüsyon kadar ml&#39;lik şırınga görünür hücre zarı kümeleri olmadan gözle homojen olduğunu. Birden fazla topak çözündürülmüş olan yerlerde, aşama 1.3.2 numuneler havuzu, paralel olarak aşağıda, tek bir pelet talimatlarına göre her bir örnek tedavi etmek için devam etmektedir. </li><li> 1 Tampon 2 ml 1 mini proteaz inhibitörü tablet çözülür (10 mM imidazol; bakınız Tablo 1) fos -choline 14 deterjan yoksun olan (proteaz inhibitörleri 10 katı daha sonra konsantrasyonlar olarakBu noktada tavsiye edilen seyreltme daha puan) ve yeniden süspanse ham membran pelet 100 ul (proteaz inhibitörleri bu noktada tavsiye edilen seyreltme altındadır) ekleyin. Ters çevirme ile 5 kez her 5 dakika karıştırılarak, 45-60 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir. </li><li> Santrifüj 125,000 x g ve 4 ° C&#39;de 25 dakika boyunca masa üstü bir ultrasantrifüjdeki Kaba membran pelet yeniden süspansiyon haline getirilmiştir. Çözünmüş CFTR içeren süpernatant, saklayın ve pelet atın. </li></ol></li><li> Kolon bağlayıcı, fosforilasyon ve elüsyon <ol><li> Nikel-NTA (nitrilotriasetik asit) agaroz bulamaç ya da Tampon 2, 1 ml eşdeğer reçine 400 ul yıkayın (10 mM imidazol; bakınız Tablo 1) deterjan yoksun olan, çözücü maddeyi ortadan kaldırmak ve 4 ° C&#39;de tampon. Tekrar yıkama iki kez daha. </li><li> (10 mM imidazol, Tablo 1 e bakınız), Tampon 2 ile 10 ml &#39;lik bir toplam çözündürülmüş CFTR, geri kalan proteaz inhibitörü (900 ul) ve nikel reçinesi (400 ul bulamaçtan) birleştirin ağırlıkarada tutarak bir ilave deterjan yoksundur. fos -choline 14 konsantrasyonu etkili bir şekilde (a / h) Bu adımda% 0.2 kadar seyreltilir. Birden çok boru varsa, çözündürülmüş CFTR, proteaz inhibitörleri, nikel-NTA reçinesi ve% 0.2 ihtiva eden tüm örnekler havuz (a / h) fos -choline-14 bu noktada. Nazik çalkalama ile 4 ° C&#39;de 60 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Küçük bir tarama kolonu (Tablo 1) veya eşdeğer bir boş sütun CFTR proteaz inhibitörü nikel NTA çözeltiyi geçirin. </li><li> Tampon 3 ilk pelet başına 4 ml ile, kolon içinde alıkonur ve nikel NTA reçinesi, yıkama (10 mM imidazol + DDM; bakınız Tablo 1) fos -choline 14 yoksun ama 1mM DDM (dodesil maltosit deterjan) içeren 4 ° C&#39;de ilave edildi. DDM deterjan eklenmesi önemli ölçüde bu tamponun pH değiştirmez. </li><li> 2500, protein kinaz A, katalitik alt birimi, cAMP-bağımlı U (p 25 ul MgATP (5 mM, nihai konsantrasyon) ilave etmek suretiyle, PKA-MgATP çözeltisi hazırlayınTablo 1) kolona, ​​Tampon 3 (10 mM imidazol + DDM 475 ul KA). Bir kapak ya da Parafilm ile sütunun alt ucunun kapatılmasını ve kullanılan her bir başlangıç ​​pelet için pKa MgATP çözeltisi 500 ul eklenmesiyle proteinin fosforile. </li><li> PKA, nikel NTA reçinesi bütün yüzeyi ile temas emin olmak için hafif karıştırma ile 1 ml pipet her 2 dakikada kullanılarak reçinenin yeniden süspansiyon haline getirilmesi ile 20 dakika boyunca oda sıcaklığında (20 ° C) inkübe edilir. </li><li> Kapağı çıkarın ve sütundan PKA / MgATP çözüm Zehir. Tampon 3 2 ml kolon yıkaması (10 mM imidazol + DDM; bakınız Tablo 1) 4 ° C&#39;de ilave edildi. </li><li> Izin kolona 4 ml tampon ilave edilerek 4 ° C&#39;de, (bakınız Tablo 1, 50 mM imidazol + DDM) Tampon 4 ml bu sayı 4. Yıkama kolon deneyde kullanılan peletler çarpın bu sütunun yanında 4 ml lik ekleyerek yoluyla ve hemen akmaya. </li><li&gt; Zehir 1 Tampon 5 ml (600 mM imidazol + DDM; bakınız Tablo 1) geçen protein kolon kuruması için bir duraklama olmadan aynı anda, sütun içinden 1 ml kullanılan başlangıç ​​pelet başına 4 ° C &#39;de, ve tek bir tüp içinde saflandırıldı CFTR içeren tüm eluat toplar. </li><li> 10 mi Tampon 6 arasında bir toplam, örneğin Malzeme ve Ekipman veya başka benzer bir cihaz, Tablo l&#39;de tarif edildiği gibi (100.000 molekül ağırlıklı bir kesim) bir santrifüj filtre cihazı kullanılarak imidazol ve düşük molekül ağırlıklı bozunma ürünlerinin ayrılması için protein örneği konsantre edin (75 mM ki + DDM; bakınız Tablo 1 2000 x g &#39;de santrifüj ile) ve 4 ° C, (non-iyodür akış deneyleri için Tamponu 7, 25 mM HEPES + DDM olarak Tablo 1) ya da 1mM DDM ihtiva eden tercih edilen bir başka tampon olabilir bakınız örnek kadar yaklaşık 20 dakika 200 ul ile elde edilebilirler. 10 ml örnek seyreltilir ve konsantrasyon adımı tekrarlanır. NOT: Bizim tecrübelerimize göre (yayımlanmamış), imidazol anlamlı INHICFTR ATPaz aktivitesi bitleri ve örnek fonksiyonel ölçümler için kullanılacak ise, en az iki kat seyreltme ve konsantrasyon ile bu aşamada çıkarılmalıdır. </li><li> Konsantre arıtıldı CFTR toplayın. 1-2 gün içinde kullanıma kadar DDM tamponu mevcudiyetinde 4 ° C&#39;de tutun veya sulandırma aşamasından hemen devam edin. Biz düşük aktivite gözlemlemek bizim deneyim gibi, saflaştırılmış protein dondurma etmeyin. </li></ol></li></ol> CFTR 2. Sulandırma <ol><li> Lipid Preparasyonu Not: CFTR başarılı Yumurta PC, POPC içine 2 yeniden edilmiştir: 1 Yumurta PC (ağırlık / ağırlık): POPC (1: 1 a / a) karışımı, veya PE bir karışımı: PS: PC: ergosterol, 5: 2 : 2: 1 (a / a). <ol><li> Iyodür akış deneyleri, kuru Yumurta PC 5 mg payreks bir ya da düz (non-borosilikat oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bir argon gazı akışı altında (25 mg / ml stok, 200 ul, Malzeme ve Ekipman Tablo) ) cam tüp. </li><li> 280 nm&#39;de emicilik kullanılarak, bir ELISA, birssay veya başka bir yöntem olup, saflaştınlmış CFTR proteini numune konsantrasyonunun tahmin edilmektedir. 1 lipid oranı: 300-1: 3000 yeterli bir sinyal üretmek için (a / a) vahşi tipli CFTR iyodür akış deneyler için, bir protein kullanırlar. Akış aktivitesi tespit etmek için 1,200 (ağırlık / ağırlık): 200-1: Yaklaşık 1 lipid oranının: G551D- ve F508del-CFTR, bir protein kullanırlar. </li><li> Her bir sistem için lipit oranı: Protein Optimize. Gerekli saflaştırılmış protein miktarını hesaplayın. = Tampon hacmi (protein gerekli çözeltinin hacmi) - 1 mi, örneğin, 1 ml &#39;lik bir son hacim için gerekli olan, 1 mM DDM ile tampon hacim hesaplanır. <ol><li> Kurutulmuş lipid 1 mM DDM ile istenilen tampon sisteminin hesaplanan hacim ekleme (ancak şu anda CFTR proteini katmayan) ve Parafilm ile cam tüp kapağı. Iyodür akış deneyler için, tampon 6 lipitleri tekrar süspansiyon (75 mM ki + DDM; bakınız Tablo 1). Diğer deneyler Tampon 8 tekrar süspansiyon için (25 mM HEPES + DDM, bkzTablo 1) ya da 1mM DDM ihtiva eden bir başka istenen iç tampon eklendi. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika vorteksleyin DDM tamponu içinde yağ ve süspansiyon yardımcı olmak için. Seçenek olarak ise, vorteks önce 1-2 dakika süre ile 37 ° C örnek ısıtın. </li></ol></li><li> Lipid film tüpü kenarlarında görünür hale gelene kadar 1 ml şırınga ve 25 G iğne ile oda sıcaklığında arka arkaya lipid süspanse edin. Ince kabarcıklar üretmek ve iyodür ve lipidlerin oksidasyonu yardımcı olur solüsyon içine hava enjekte kaçının. </li><li> Parafilm içinde süspansiyon haline getirilmiş lipit bir sonikatör banyosu ihtiva eden bir buz içinde 20 sn kaymasının tüpü kapalı sonikasyon, ve daha sonra 1 dakika boyunca buz hemen aktarın. 3 kez tekrarlayın. NOT: Yoğun sonication oksidasyon nedeniyle sarı iyodür çözümler döner. Bu nedenle aşırı sonikasyon kaçının. Renk değişiklikleri için örnek izleyin. Bir renk değişimi tespit edilirse, örnek atmak ve tekrar hazırlamak. nedeniyle bazı oksidasyonu renk değişikliğiiyodür, aynı koşullar altında lipid oksidasyonuna neden olur. Çözüm sonicating önce argon gazı ile tüp havayı yerinden lipid ve iyodür oksidasyonunu önlemeye yardımcı olur. Yoğun sonication kalitesiz veya numune kaybına neden çizik cam tüpler kırabilir. </li><li> 1 ml&#39;lik bir son hacim elde etmek için bir ses dalgalarına maruz bırakıldı, lipid numune için adım 2.1.3 hesaplanan arıtıldı CFTR hacim. 25 G iğne ile 1 ml şırınga ile tabanda 10 kez lipit ve deterjan çözeltisi ile protein karıştırın. </li><li> Tüp döndürme ile 30 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir lipid ve protein numune 5 kez her 5 dakika karıştırın. </li></ol></li><li> Deterjan bağlayıcı sütun hazırlanması <ol><li> 1 ml hacim kapasiteli bir tek kullanımlık ticari deterjan bağlayıcı spin kolon (Malzeme ve Ekipmanları Tablo bakınız) elde edilir ve sütun akan başlamak için alt sekmesini kırmak. </li><li> Depolama b çıkarmak için 2000 x g&#39;de 2 dakika süre ile sütun santrifüjuffer ve bu tampon atın. </li><li> Tampon 7 5 ml kolonuna (75 mM KI, Tablo 1 &#39;e bakınız) ve daha sonra yıkama tamponu elüt edilmesi için 4 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj. Depolama tamponu tüm izlerini çıkarmak için 3 yıkamadan toplam Bu adım 2 kere daha tekrar edin. Tüm flow-through atın. NOT: Bu sütun yıkamak için kullanılan tampon DDM ya da başka bir deterjan içermeyen önemlidir. Sütun deterjan için sınırlı bir bağlanma kapasitesine sahip olan bir deterjan ihtiva eden bir tampon maddesi kullanıldığında, kolon protein lipit deterjan örnek deterjan kaldırılması etkisiz olacaktır. </li><li> Dikkatle kolon reçinenin üst kısmına lipid deterjan protein, tüm numune 1 ml bir örnek ve oda sıcaklığında 2 dakika için sütunun üst kısmında örnek inkübe edilir. </li><li> 2000 x g&#39;de, 4 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüjleyin ve temiz bir 1.5 ya da 2 ml mikrofüj tüpüne bulutlu proteoliposome örnek ya da bir cam tüp toplamak ve Sam yerBuz üzerinde ple. </li><li> Kolonun üstüne 200 Tampon 7 ul (75 mM KI, Tablo 1) ya da (deterjan olmadan) için diğer tampon çözeltisi ilave edilerek kolon içerisinde geri kalan proteoliposomes toplayın ve 2 dakika boyunca santrifüj adımı tekrarlanır. </li><li> Bulutlu görünüyor eğer proteoliposome örnek ikinci eluatın ekleyin. </li><li> Gece boyunca 4 ° C &#39;de örnek saklayın, ya da iyodür akış ölçümleri için hemen kullanılır. </li></ol></li></ol> Saflaştırılmış yeniden oluşturulmuş CFTR 3. iyodür dışarı atım Ölçümler <ol><li> Proteoliposomal zarı boyunca bir iyodür gradyan üretilmesi <ol><li> Tampon 9 Ön kabarma Sephadex G50 boncuklar (yaklaşık 5 g kuru boncuk 50 mi tampon maddesi içinde) veya arzu edilen dış Tampon, oda sıcaklığında en az 2 saat süreyle ya da 4 ile (75 mM K-Glu potasyum glutamat, Tablo 1 e bakınız) gecede ° C. </li><li> Tampon 9 doymuş 4 Sephadex G50 sütun hazırlayın ya da (75 mM K-Glu, Tablo 1 e bakınız)¾ en azından sütununda tam reçine yükleyerek küçük tarama sütunlarda tampon. </li><li> Reçine aşırı tampon kaldırmak için 2.000 xg&#39;de 4 dakika santrifüj. Santrifüjleme aşamasının sonunda kolonuna paketlenmiş hidratlanmış reçinenin yaklaşık 2.25 mi olmalıdır. NOT: Reçine hafifçe sulu ancak sıvı dalmış ve bir sonraki kısa sıkma tampon önemli hacimlerde Zehir olmamalıdır değil edilmelidir. Bu sütun reçine ne çok ıslak ne de çok kuru ve kullanıcı en başarılı tampon değişimi koşullarına aşina olmak için sütunları ile denemeniz gerekebilir olan proteoliposome numunenin başarılı elüsyondan için çok önemlidir. </li><li> Dikkatlice 2,000 x g&#39;de, 4 dakika boyunca, her bir sütun ve santrifüj üstüne proteoliposome örnek 125-150 ul ekle. </li><li> Havuz proteoliposome iyodür efflux veya diğer deneylerde hemen kullanım için bir arada sıvı kısımlar. NOT: Her kolondan ses kabaca olmalı150 ul ve örnek biraz bulutlu, ancak orijinal numune daha az bulutlu olmalıdır. Büyük hacimler veya net eluatlar sütunları yeterince kurutulmuş değil, ya da çok fazla, sırasıyla kurutulmuş edilmiş ve başarılı bir iyodür akış deneyinde neden olmaz düşündürmektedir. </li></ol></li><li> Iyodür akış deneyi <ol><li> Yoğun bir de-iyonize su ile (Malzeme ve Ekipman Tablo) bir iyodür seçici mikro elektrot yıkayın ve daha sonra Tampon 10 deneyden önce 20 dakika süreyle kuluçkalayın (15 uM KI, bakınız Tablo 1). Deiyonize su ile tekrar kapsamlı elektrot yıkayın. </li><li> Tampon 9 tahlilde kullanılır (10 uM bir nihai konsantrasyon elde etmek için 20 uM, tipik konsantrasyon) ilacın 150 ul ekle 96 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna Tamponu 9 ya da araç (75 mM K-Glu, Tablo 1 e bakınız) Küçük bir pire karıştırma çubuğu ile. <ol><li> Mevcut hava kabarcığı olmadığından emin olun. Sokak kaldırmak için bir pipet kullanınkabarcıklar. Bir ilaç çözeltisi kullanılıyorsa, göz içindeki son DMSO konsantrasyonu ((tipik olarak% 0.1-0.2 v / v)) en az% 1 (h / h) olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Tampon 9, Bölüm 3.1&#39;de üretilmiş yeniden CFTR proteininin 150 ul ekle plakasının her bir oyuğuna 300 ul toplam hacim elde etmek için, ilaç ya da tampon maddesi ile bir oyuğa (75 mM K-Glu, bakınız Tablo 1). </li><li> Bir karıştırıcı plaka üzerinde 96 oyuklu plaka yerleştirilir ve 130 rpm&#39;de (ya da yaklaşık olarak dörtte maksimum hızının bir orta hızda) karıştırılmıştır. </li><li> Dikkatle ucu kuyunun dibine dokunmadan değil veya karıştırma çubuğu ile vurulduktan şekilde numune ile kuyuya iyodür seçici elektrot ucu yerleştirin. Referans elektrot, ayrı ise, iyi çözelti ile temas halinde olduğundan emin olun. </li><li> Elektrot ile arayüzleri bir ev yapımı ya da ticari bilgisayar programı kullanarak Kayıt kopyalamaları (detaylar için Materyallerin Tablo ve Ekipmanları bakınız).Bir düşük geçiş filtresi içinden sinyal filtreleme ile 2 Hz&#39;lik bir numune alma oranı, kullanın. </li><li> Örnek kayıt sırasında düz ve sabit ya da yakınındaki yassı bir temel hat üretmek için 5 dakika boyunca dengelenmeye bırakın. </li><li> 3 ul MgATP (KOH ile dH 2 O hazırlandı ve pH 7&#39;ye ayarlandı, 100 mM stok, 1 mM nihai konsantrasyon) ilave örneğe proteini aktif hale getirmek için. ~ 5 dk yeni bir kararlı bir temel ulaşmak için bekleyin. Her zaman dış tampon pH değişiklikleri önlemek için kullanmadan önce nötr 100 mM MgATP stokunun pH ayarlamak. </li><li> CFTR ile iyodür seçici iletkenlik tarafından üretilen potansiyel farkı değişiklikleri şant örnek (20 nM nihai konsantrasyon 2 uM) stok Valinomycin 3 ul ekle. En az 5 dakika süre ile bağlı CFTR aracılı iyodür akış aktivitesi azalan eğimi (mV azalma) kaydedin. </li><li> , Proteoliposome lümeninde iyodür bindirme yeterli olduğundan emin olmak% 10 3 ul eklemek (h / h) Triton X-100 örnek. Significant ve ani iyodür salma yeterli iyodür tutucu 3.2.9 belirlenen eğim değişiklikleri daha çok CFTR aracılı etkinliği için sınırlayıcı bir faktör değildir, öyle ki veziküller sıkışıp olduğunu gösterir. </li><li> Bu reaktiflerin tüm izlerini sonraki numunenin kirlenmesini önlemek için çıkarılmış olmak üzere ilaç veya Triton X-100 ile örnekleri tedaviden sonra de-iyonize su ile iyice elektrot ve bir karıştırma çubuğu yıkayın. </li><li> Tamponu içinde nanomolar aralıkta 9 mikromolar seyreltilmiş KI bir seri yoğunluğunun hazırlanması (K-Glu tamponu, bakınız Tablo 1). Hazırlanan en yüksek konsantrasyonda 0 ilâ her bir konsantrasyonu için elektrot mV yanıtı kaydeder. Prob yanıtı (mV) molar iyodür konsantrasyonunun günlüğüne karşı çizilen bir standart eğri Construct. Serbest iyodür konsantrasyonuna akış deney sırasında prob mV tepkisini dönüştürmek için standart eğri kullanın. NOT: Bir kalibrasyon cur hazırlayınBir kullanıcı emin olana kadar haftalık olarak ziyaretinde ne kadar hızlı sistemi değişiklikleri tepkisi. Zamanla prob cevap ve hassasiyet bir sürüklenme olacaktır. Prob yaş olarak, yanıt düşer. Bu kısmen periyodik iç çözümler değişen ve kullanımdan sonra su prob ucunun geniş yıkama, prob yüzeyine moleküllerin muhtemel sınırları bağlılık tarafından iptal edilebilir. </li><li> MgATP ilave edilmeden önce son 30 saniye boyunca her proteoliposome numune için zaman grafiği konsantrasyona hattının ortalama eğimi belirlemek ve Valinomycin ilave edilmesinden sonra, ancak, Triton X-100 ilave edilmeden önce. Bu örnek CFTR-aracılı iyodür akış etkinliğini belirlemek için Valinomycin bazal eğim çıkarın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+mechanisms+underlying+CFTR+channel+activity,+the+molecular+basis+for+cystic+fibrosis+and+strategies+for+therapy.">Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy.</a> Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).</li><li>Bear, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+functional+reconstitution+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Cell. 68 (4), 809-818 (1992).</li><li>Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-resolution+single-channel+recording+to+functional+studies+of+cystic+fibrosis+mutants.">Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants.</a> Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).</li><li>Kerem, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+genetic+analysis.">Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis.</a> Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+defective+anion+transport+in+L+cells+expressing+recombinant+forms+of+CFTR.">Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR.</a> Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).</li><li>Mendoza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+efficient+correction+of+DeltaF508+CFTR+revealed+by+analyses+of+evolved+sequences.">Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences.</a> Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).</li><li>Rabeh, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+both+NBD1+energetics+and+domain+interface+is+required+to+restore+DeltaF508+CFTR+folding+and+function.">Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function.</a> Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).</li><li>Aleksandrov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulation+balances+thermodynamic+stability+and+restores+function+of+DeltaF508.">Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508.</a> CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).</li><li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation.">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li><li>Riordan, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+recombinant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+from+Chinese+hamster+ovary+and+insect+cells.">Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells.</a> J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).</li><li>Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> JoVE. (61), (2012).</li><li>Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).</li><li>Peng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+affinity+isolation+of+recombinant+protein+using+the+baculovirus/insect+cell+expression+system.">One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system.</a> Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).</li><li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).</li><li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).</li><li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+reconstitution+of+epithelial+chloride+channel+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).</li><li>Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+protein+derived+from+the+baculovirus+expression+system+using+glutathione+affinity+agarose.">Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose.</a> Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).</li><li>Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+potentiator+VX-770+(ivacaftor)+opens+the+defective+channel+gate+of+mutant+CFTR+in+a+phosphorylation-dependent+but+ATP-independent+manner.">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner.</a> J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).</li><li>Alkhouri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+properties+of+molecular+probes+for+the+rescue+site+on+mutant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).</li><li>Eckford, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VX-809+and+Related+Corrector+Compounds+Exhibit+Secondary+Activity+Stabilizing+Active+F508del-CFTR+after+Its+Partial+Rescue+to+the+Cell+Surface.">VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface.</a> Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).</li><li>Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+corrector+modifies+the+channel+function+of+F508del-CFTR.">A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR.</a> Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).</li><li>Verkman, A. S., Galietta, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+channels+as+drug+targets.">Chloride channels as drug targets.</a> Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).</li><li>Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interaction+of+a+small-molecule+modulator+with+G551D-CFTR,+a+cystic+fibrosis-causing+mutation+associated+with+severe+disease.">Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease.</a> Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).</li><li>Norez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+CFTR+chloride+channel+activity+and+pharmacology+using+radiotracer+flux+methods.">Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods.</a> J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).</li><li>Whitney, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+alginate+secretion+across+the+bacterial+outer+membrane.">Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).</li><li>Islam, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-dependent+gating+and+proton+uptake+by+Wzx+support+O-antigen-subunit+antiport+across+the+bacterial+inner+membrane.">Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane.</a> mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).</li><li>Ramjeesingh, M., Conn, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+16.">Ch. 16.</a> Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. , 337-357 (2010).</li><li>Wellhauser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability.">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+purified+human+Hv1+H++channels.">Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels.</a> J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).</li><li>Chang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+(PKA)+still+activates+CFTR+chloride+channel+after+mutagenesis+of+all+10+PKA+consensus+phosphorylation+sites.">Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites.</a> J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).</li><li>Gadsby, D. C., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CFTR+Cl-+ion+channels+by+phosphorylation+and+dephosphorylation.">Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation.</a> Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).</li><li>Ma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinone+CFTR+inhibitor+identified+by+high-throughput+screening+blocks+cholera+toxin-induced+intestinal+fluid+secretion.">Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion.</a> J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).</li><li>Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+CFTR+inhibition+by+a+thiazolidinone+derivative.">On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative.</a> J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).</li><li>Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+new+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+inhibitor+on+Cl-+conductance+in+human+sweat+ducts.">Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts.</a> Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).</li></ol>

Yazarlar burada anlatılan saflaştırma yöntemlerinin geliştirilmesi sırasında Dr. Mohabir Ramjeesingh tavsiye kabul. Bu çalışmalar Sağlık Araştırması (CIHR) ve Kistik Fibrozis Kanada (CFC) Kanada Enstitüleri CEB İşletim Hibe tarafından desteklendi. PDWE CIHR ve CFC üzerinden Kardeşlik ödülleri kısmen desteklenmiştir. Yazarlar Kistik Fibrozis Vakfı Therapeutics (CFFT) tarafından düzeltici, kuvvetlendirici ve Dr. R. Köprülerin (Tıp Rosalind Üniversitesi ve Bilim) den inhibitör bileşiklerin ve dağıtım sağlanmasını kabul. Yazarlar ayrıca bakülovirüs sistemini kullanarak WT ve mutant CFTR proteini ifade Baylor Hücre Kültürü Tesisi (NIH hibe P30 CA125123) tarafından üstün hizmet kabul. inaktif VX-770 analog, V-09-1188, Vertex İlaç bir hediye oldu.

Hücresel aşırı ekspresyonu sistemleri çeşitli, tam uzunluktaki fonksiyonel CFTR izolasyonu için saflaştırma protokolleri sınırlı sayıda olmuştur. Bu ATP ve düzlemsel iki tabakalı, tek kanallı ölçümleri de dahil olmak üzere kanal fonksiyonunun doğrudan ölçümleri, aşağıdakileri içeren deneylerde son derece işlevseldir, Wt-CFTR veya orta miktarlarda F508del- ve G551D-CFTR yüksek zenginlikte hızlı saflaştırılmasına olanak tanımaktadır burada tarif edilen yöntem avantajlıdır, Küçü...

Akciğer, bağırsak, pankreas ve ter bezleri gibi dokularda epitel hücrelerinin apikal membranlar arasında Klorür taşıma öncelikle ABC Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR), bir ATP ve fosforilasyon-regüle üyesi (ATP aracılık 1 gözden membran proteinlerinin Kaset) C alt ailesini () Bağlayıcı. ABCC alt ailesinin diğer üyeleri gibi CFTR nükleotid-bağlayıcı etki tek mütevazı ATPaz aktivitesine sahip (NBDs), ara yüzünde oluşan iki nükleotid bağlama sahalarında ATP bağlanan bir geniş, çok geçişli bir integral membran proteinidir sitesi. Ancak, diğer ABCC alt familyası üyeleri aksine, CFTR eşsiz düzenlenmiş Cl kanalı olarak yerine aktif bir çözünen taşıyıcı olarak gelişmiştir. Morbi giden CFTR neden Kistik Fibrozis, akciğerler, gastrointestinal sistem, pankreas ve üreme yolu da dahil olmak üzere birçok organı etkileyen bir hastalık mutasyonlar,Genç erişkinlerde dity ve ölüm. Akciğer hastalığı, genellikle iletken solunum yollarının yüzey epiteli üzerine CFTR fonksiyon kaybı neden olur Kistik Fibrozis erken mortalite ve çoğu durumda hesapları. siliyalı solunum epiteli apikal yüzeyinde sıvı tabakası değiştirmek için yüzey epiteli boyunca ve su hareketi - CFTR klorür kanal aktivitesinin eksikliği hem Cl azalmaya neden olur. Bu kirpikli solunum epitel hücrelerinin yeteneğini bozar viskoz havayolu yüzey sıvı sonuçlanır hava yollarının dışında etkin bir açık patojenler için. Sonuç olarak, çoğu CF hasta akciğer enfeksiyonu ve iltihabı nedeniyle akciğer hasarı atakları muzdarip. Beklendiği gibi, normal bir CFTR proteininin etki mekanizmasının çalışmaları öncelikle kanal yolluk aktivitesinin detaylı elektrofizyolojik çalışmalar üzerinde duruldu. Tek kanallı çalışmalar bir pKa bağımlı Cl gibi doğrudan bu CFTR fonksiyonlarını göstermişlerdir- ATP düzenlenmiş kapısı 2 sahiptir kanalı. Çalışılmıştır herhangi bir tek bir kanal özellikleri dolayısıyla tüm CFTR kanallarının nüfus ve tek kanal yansıtıcı olup olmadığı detaylı elektrofizyolojik çalışmalar tek CFTR kanalları 1,3 bilgilerin büyük bir sağlamak, ancak endişe olabilir Sonuçlar her zaman makroskobik nüfusu çalışma yöntemleri ile birlikte düşünülmelidir. Saflaştınldı CFTR nüfus kanal aktivitesinin doğrudan tahlil hastalığa neden olan mutasyonlar ile bağlantılı moleküler bozukluğun ilişkin bilgi sağlar ve kimyasal modülatörleri tamir mutan CFTR proteini keşfini potansiyeline sahiptir. Bugüne kadar, Kistik Fibrozis 4 neden olduğu düşünülmektedir CFTR 1.900 farklı mutasyonlar aşan vardır. Kuzey Amerika ve Avrupa&#39;da hastaların yaklaşık% 90&#39;ında en az bir alleli bulunan büyük mutasyon, F508del-CFTR, protein hatalı katlanması yol açarendoplazmik retikulum 5 nci tutma. F508del-CFTR da arızalı kanal faaliyeti 6-9 dahil olmak üzere diğer sonuçları vardır. hücre yüzeyinden CFTR elde edilen olmaması şiddetli hastalık ile ilişkilidir. G551D-CFTR, daha az yaygın mutasyon, düzgün henüz katlanmış hücre yüzeyinde 6 bir klorür kanalı olarak işlevsiz olduğunu düşünülmektedir. küçük molekül düzelticisi ve güçlendiricileri gelişimi sırasıyla hücre yüzeyi üzerinde mevcut olan bir katlama ve / veya hücre yüzeyine F508del-CFTR gibi mutantların kaçakçılığı ve güçlendirici düzeltilmesi veya bu gibi G551D mutasyonların kanal aktivitesini arttırma amacı vardır . 150 mg KF hastalarında&gt; 6 yıl en az bir G551D ile her 12 saatte de kullanılan, VX-770); düzelticiler, VX-809 ve VX-661 (henüz hastalarda kullanımı, güçlendiricisi Kalydeco (ivacaftor onaylanmayan da -CFTR mutasyon ve daha yakın zamanda hastalar için G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255P biriyleve G1349D. Kalydeco CF hastalığının 10 klinik önlemler, bu küçük molekülün eylem Ancak mekanizması zayıf hastalarda kullanılmak üzere FDA onayı sırasında anlaşılmıştır iyileştirilmesi güvenli ve sonuçları hem de. CFTR saflaştırma yöntemleri bir avuç önce tamamlamak için önemli bir zaman uzunluğu gerekli çoğu 2,11-18 tarif edilmiştir. Son zamanlarda yayınlanan 19, özel bir hızlı saflaştırma ve yeniden çözme yöntemi Sf 9 hücre ifade sistemi içinde aşırı ifade CFTR için tarif edilmiştir ve tanımlanan lipid sistemleri bu saflaştırılmış protein CFTR oluşan bir popülasyon için bir CFTR halojenür kanal etkinliği test geliştirmek için kullanılmıştır moleküller. Tahlil CFTR fonksiyonu fosforilasyon, nükleotidler ve inhibitörlerinin bilinen etkilerini özetler. Sistem bir potansiyatör etkilerini sorgulamak için kullanılmıştır VX-770 / Kalydeco ağırlıkça (vahşi tip), F508del- ve G551D-CFTR ve ilk için gördüilaç için bir nüfus açısından CFTR ve nükleotidler ve küçük moleküller ile mutantların etkileşimi çalışmasında bu yöntemlerin kullanımını, uygulanabilir gösteren, bir ATP-bağımsız bir şekilde, kanal aktivitesini güçlendirmek için, CFTR proteini ile doğrudan etkileşime giren bir zaman protein hakkında klinik olarak ilgili sorulara cevap. yöntemler, başka potansiyatör molekülleri ve bunların türevleri 20, hem de protein 21 aktivitesine küçük bir molekül düzeltici etkilerini incelemek için kullanılmıştır. Efflux deneyleri daha önce elektrotlar, radyoaktif izleyiciler ve florofor 22,23 kullanılarak bütün hücre tahlilleri, iyon seçici elektrotlar 24 ile zar vezikülleri dahil olmak üzere CFTR mutantlarının aktivitesini ve etkinliği üzerindeki CFTR modülatör bileşiklerinin etkilerini araştırmak üzere pek çok çalışmada kullanılmıştır ve radyoaktif izleyiciler 25 ile yeniden CFTR saflaştırılmış. Ancak thsaflaştırılmış yeniden CFTR çalışma iyon seçici elektrotlar e kullanımı ilk geçenlerde 19 bildirilmiştir. Mevcut yöntemin bir adaptasyonu yeniden ve Pseudomonas aeruginosa, ortak bir KF patogen içinde iki membran proteinlerinin fonksiyonel karakterizasyonu için kullanılmıştır. Iyodür akış ölçümleri ile birlikte saf hale alge dış zar proteininin yeniden oluşturulması, bu taşıyıcı 26 boyunca anyonik alginat salgılama için bir model desteklemek için kullanılmıştır. Sulandırma ve iyodür akış ölçümleri, bir model bu protein 27 ile bakteri iç zarı boyunca lipit bağlantılı oligosakarit translokasyon için bir H + -bağlı antiport mekanizması ileri sürdüler izin saflaştırılmış Wzx protein uygulanmıştır. Bir yerel bir alt-tabaka için beklenebilir daha Her iki durumda da iyodür daha düşük kapasite ile de olsa, anyonik alt-tabaka için bir vekil olarak kullanılmaktadır. yöntem c başka proteinler adaptasyon için uygunanyonik yüzeyler için ationic taşıma veya iletim yolları. Burada bir hızlı saflaştırma prosedürü CFTR proteini ve tanımlanan lipid proteoliposomes içine yeniden tarif edilmiştir. hızlı yeniden oluşturma işlemi kolayca arıtılmadan kullanılan deterjan türü burada kullanılan yöntemler ile ayrıştığı ya da rekonstitüsyon işlem öncesinde uygun bir deterjan için değiştirilebilmesi şartıyla, diğer yöntemlerle arıtılır CFTR ile kullanım için uygun hale getirilebilir. Saflaştırılmış ve yeniden CFTR proteininin kanal aktivitesinin ölçülmesi için iyodür akış yöntemi ayrıntılı olarak tarif edilmiştir ve bu yöntem kullanılarak elde edilen bazı tipik sonuçlar sunulmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1269">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:403px;">fos-choline 14 detergent</td>
			<td style="width:515px;">Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)</td>
			<td style="width:145px;">F312</td>
			<td style="width:207px;">Affymetrix: Anatrace Products; CAS#&#160;:77733-28-9</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td>
			<td>04 693 132 001</td>
			<td>EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini:1 in 10 mL) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack&#160;</td>
			<td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td>
			<td>05 892 791 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qaigen GmbH</td>
			<td align="right">1018240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisherbrand Screening columns</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>11-387-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K</td>
			<td>Millipore (www.millipore.com)</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit</td>
			<td colspan="2">New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)</td>
			<td>Peirce PKA is also suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PC, Chicken Egg</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td>
			<td>840051C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PS, Porcine Brain</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td>
			<td>840032C</td>
			<td>(CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w))</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PE, Chicken Egg</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td>
			<td>841118C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ergosterol</td>
			<td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td align="right">45480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pierce Detergent removal spin column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">87779</td>
			<td>1 ml capacity columns</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">valinomycin</td>
			<td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>V-0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VX-770 (ivacaftor)</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iodide selective microelectrode</td>
			<td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)</td>
			<td>LIS-146ICM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Clampex 8.1 software</td>
			<td>Axon Instruments (www.axon.com)</td>
			<td></td>
			<td>we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alternate Software: ArrowLabb System&#160;</td>
			<td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)</td>
			<td>LIS-146LICM-XS</td>
			<td>Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.&#160; This software should serve a similar function to our setup</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">small stir bars</td>
			<td>Big Science Inc (www.stirbars.com)</td>
			<td>SBM-0502-CMB</td>
			<td>choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sephadex G50, fine</td>
			<td>GE Health Care (www.gelifesciences.com)</td>
			<td>17-0042-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies Co, Inc.</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td>Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional reconstitution and channel activity measurements of purified wildtype and mutant cftr protein

Kistik fibroz membran geçirgenliğinin düzenleyicisi (CFTR), taşıyıcıların Kaset (ABC) süper ailesinin ATP bağlayıcı bir benzersiz bir kanal oluşturan bir üyesidir. CFTR fosforilasyon ve nükleotid bağlı klorür kanal etkinliği sık bütün hücre sistemleri ve kesilen membran yamalar tek kanal olarak incelenmiştir. Birçok Kistik Fibroz-neden olan mutasyonlar bu aktiviteyi değiştirmek için gösterilmiştir. Arıtma protokolleri az sayıda yayınlanmış olsa da, kanal aktivitesini muhafaza eden bir hızlı yeniden oluşturma yöntemi ve saflaştırılmış bir sistem içinde nüfus kanalı etkinliğini incelemek için uygun bir yöntem, eksik edilmiştir. Burada hızlı yöntemler düzenlenmiş bir halid kanalı olarak etkinliğini muhafaza eden, lipid tanımlanan bileşimin proteoliposomes haline getirilerek, ve tam uzunluktaki CFTR proteininin işlevsel olarak yeniden tarif edilmiştir. Birlikte kanal aktivitesi olan yeni bir akı bazlı deneyde Bu yeniden oluşturma yöntemi için uygun bir sistemdirvahşi tip CFTR nüfus kanal özelliklerini ve hastalık yapıcı mutantlar F508del- ve G551D-CFTR okuyan. Özel olarak, yöntem, fosforilasyon, nükleotidler ve bu tür CFTR kanal aktivitesi üzerindeki kuvvetlendirici ve inhibitörleri olarak küçük moleküllerin doğrudan etkilerinin araştırılması yararlıdır. yöntem aynı zamanda, anyonik maddeler için başka membran kanal / taşıyıcıların çalışma için uygun.

Bu yazılı yayında tarif, arındırmak sulandırmak ve CFTR proteininin düzenlenmiş kanal aktivitesini ölçmek için yöntemler bulunmaktadır. 1a saflaştırma, yeniden ve iyodür akış prosedürleri için iş akışını göstermektedir. Iyodür akı yeniden oluşturma ve kanal Aktivite ölçümleri için yöntemler de ilgili video daha ayrıntılı olarak gösterilmektedir. Proteoliposomes içine CFTR saflaştırma ve yeniden çözme <p class="j...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein at JoVE.com

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Burada anlatılan Kistik Fibrozis kusurlu olan bu klorür kanalı, etkinliğini korur saflaştırılmış yabani tip ve mutant CFTR proteininin fonksiyonel yeniden bir hızlı ve etkili bir yöntemdir. CFTR aracılık ettiği yeniden proteoliposomes gelen iyodür akış kanalı aktivitesinin çalışmaları ve küçük moleküllerin etkilerini sağlar.

Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

functional-reconstitution-channel-activity-measurements-purified

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Görüntüleme.  Hospital for Sick Children.  Burada anlatılan Kistik Fibrozis kusurlu olan bu klorür kanalı, etkinliğini korur saflaştırılmış yabani tip ve mutant CFTR proteininin fonksiyonel yeniden bir hızlı ve etkili bir yöntemdir. CFTR aracılık ettiği yeniden proteoliposomes gelen iyodür akış kanalı aktivitesinin çalışmaları ve küçük moleküllerin etkilerini sağlar. 

Video: Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biyoloji

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

Steroid Reseptör Biyokimyasal Sulandırma Ligand • Protein Hsp90 Kompleksleri ve Yeniden bağlayıcı

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

Lizin demetilaz Faaliyet Kantitatif Ölçümler MassSQUIRM Uygulaması

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell migration, gene expression, cell cycle progression and cell adhesion 1. Rho proteins are molecular switches that are active in GTP-bound and inactive in GDP-bound state. Their activation is mediated by a family of Guanine-nucleotide Exchange Factor (GEF) proteins. Rho-GEFs constitute a large family, with overlapping specificities 2. Although a lot of progress has been made in identifying the GEFs activated by specific signals, there are still many questions remaining regarding the pathway-specific regulation of these proteins. The number of Rho-GEFs exceeds 70, and each cell expresses more than one GEF protein. In addition, many of these proteins activate not only Rho, but other members of the family, contributing further to the complexity of the regulatory networks. Importantly, exploring how GEFs are regulated requires a method to follow the active pool of individual GEFs in cells activated by different stimuli. Here we provide a step-by-step protocol for a method used to assess and quantify the available active Rho-specific GEFs using an affinity precipitation assay. This assay was developed a few years ago in the Burridge lab 3,4 and we have used it in kidney tubular cell lines 5,6,7. The assay takes advantage of a "nucleotide free" mutant RhoA, with a high affinity for active GEFs. The mutation (G17A) renders the protein unable to bind GDP or GTP and this state mimics the intermediate state that is bound to the GEF. A GST-tagged version of this mutant protein is expressed and purified from E. coli, bound to glutathione sepharose beads and used to precipitate active GEFs from lysates of untreated and stimulated cells. As most GEFs are activated via posttranslational modifications or release from inhibitory bindings, their active state is preserved in cell lysates, and they can be detected by this assay8. Captured proteins can be probed for known GEFs by detection with specific antibodies using Western blotting, or analyzed by Mass Spectrometry to identify unknown GEFs activated by certain stimuli.

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

The method presented here describes an assay to follow activation of RhoA specific GDP/GTP Exchange Factors (GEFs) in cultured cells by making use of a mutant RhoA GST fusion protein that has high affinity for activated GEFs. GEFs are precipitated from cell lysates, detected by Western blotting and quantified by densitometry.

Epitel Hücre lizatları bir GST-etiketli Mutant Rho Protein (GST-RhoA (G17A)) Kullanarak Active Rho-gefs ve Affinity Yağış

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

PDZ bağımlı CFTR makromoleküler Sinyal Kompleksleri İn Vitro Analizi

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls and carotenoids. In vivo, these proteins are folded with pigments to form complexes which are inserted in the thylakoid membrane of the chloroplast. The high similarity in the chemical and physical properties of the members of the family, together with the fact that they can easily lose pigments during isolation, makes their purification in a native state challenging. An alternative approach to obtain homogeneous preparations of LHCs was developed by Plumley and Schmidt in 19871, who showed that it was possible to reconstitute these complexes in vitro starting from purified pigments and unfolded apoproteins, resulting in complexes with properties very similar to that of native complexes. This opened the way to the use of bacterial expressed recombinant proteins for in vitro reconstitution. The reconstitution method is powerful for various reasons: (1) pure preparations of individual complexes can be obtained, (2) pigment composition can be controlled to assess their contribution to structure and function, (3) recombinant proteins can be mutated to study the functional role of the individual residues (e.g., pigment binding sites) or protein domain (e.g., protein-protein interaction, folding). This method has been optimized in several laboratories and applied to most of the light-harvesting complexes. The protocol described here details the method of reconstituting light-harvesting complexes in vitro currently used in our laboratory, and examples describing applications of the method are provided.

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Bitkiler ve Yeşil Alg Işık hasat Kompleksleri İn Vitro Sulandırma içinde

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...