1. Maya Hazırlıklar <ol><li> Bir gal1-GFP-Y68L (UBC9 ts) kaseti taşıyan plazmid ile maya suşları Transform. </li><li> 16 saat veya O / N için 24 saat süreyle% 2 rafinoz içeren sentetik medya maya büyümek ve geri% 2 galaktoz içeren ortam seyreltilir 200 rpm&#39;de sallama sırasında 30 ° C &#39;de hücreler inkübe edin. </li><li> Ertesi sabah, OD 600 = 0.2 için sorgu zorlanma sulandırmak. Kültürü = 0.8-1.0 OD 600 ulaşıncaya kadar 30 ° C (200 rpm) 4-6 saat boyunca çalkalayınız. </li><li> Ifade (yani GFP-Ubc9 ts sadece zaten tercüme ve katlanmış havuzu izlemek için),% 2 glukoz (SD) öncesi görüntüleme için 30 dk ile takviye sentetik ortam değişikliği medya bastırmak için. </li><li> Tedavi - Isı şoku 37, 20 dakika için hücreler ° C misfolding indüklemek için, ya da sürekli olarak ısı-şok protein birleştirme koşulları izlemek için mikroskop kuluçka makinesi içinde. Not - RT, ön ısıtma fo üzerinde herhangi bir sıcaklıkta mikroskop kullanıyorsanızmikroskop ve hedeflerinin gövdesi (bkz. aşağıda) boyunca sıcaklık denge sağlaması için 2 saat yaklaşık r. </li></ol> 2. Tabak \ Slayt Hazırlıklar <ol><li> Uygun plaka seçin. Ana dikkate görüntüleme edinimi sırasında odak korumak için yeteneğidir. Aşağıdaki noktaları 2B zaman geçerse veya 3D görüntüleme için 4D görüntüleme için kritik ve değildir. <ol><li> Çoklu kuyular plaka farklı kuyunun altındaki (yani kuyu amaç göre farklı yüksekliklerde yer alacaktır) homojen olmayabilir. Bu zor olursa olsun otomatik odaklama tekniği kullanılmış olma, xy noktaları ve zaman noktaları arasında odak sağlamak için yapacaktır. </li><li> Slayt malzeme: cam vs plastik. Cam dipli slaytlar daha z-homojen kuyuları arasındaki, ancak daha pahalıdır. </li><li> Plakanın alt kalınlığı: biz genellikle lamel-alt plakalar indeksi 1.5 kullanabilirsiniz, ancak endeks 1 amaca bağlı olarak da kabul edilebilir. </li></ol></li><li> Cov10 dakika için ConA (0.25 mg / ml) ile plaka arasında er alt \ kayar. ConA zaman içinde bir tek hücre ardından sağlayan slayt, hücre yapışma kullanılır. </li><li> ConA çıkarın ve böylece aşırı ConA buharlaşıp gidecek bir kimyasal kaputu slayt inkübe. </li><li> Iyi ConAed içine maya örnek Plate 200 ul (OD 600 = 0.5). </li><li> Hücreler plaka yüzeyine tutunur sağlamak için olduğu gibi, 15 dakika için inkübe edin. </li><li> Orta ayıklayın ve hücrelerin bir tabaka elde etmek için yeni bir orta ile üç kez yıkayın. Not: Uzun bir zaman atlamalı planlanmış ise, tohum hücreleri seyrek böylece yeni tomurcuklar doldurmak ve ilgi bölgenin engel olmayacağından emin. </li></ol> 3. Mikroskop Hazırlıklar <ol><li> Biz birkaç standart olmayan değişiklikler ile Nikon A1Rsi konfokal mikroskop kullanmak. Kadar, maya ve görüntüleme için biz 4 lazerler (ve 640 nm, 40 mW KÜP lazer; 457-514 nm, 65 mW Argon iyon lazer;; 561 nm, 50 mW Safir lazer 405 nm, 50 mW CUBE lazer) kadar kullanabilirsiniz ile donatılmış 4 Proje Yönetim Ekiplerifiltreler. Bizim görüntüleme çoğu EGFP için yeşil filtre seti ve mCherry ve tdTomato için kırmızı bir filtre seti ile yapılır. GFP ve mCherry ile orada neredeyse hiç bleedthrough, bu nedenle sık sık Eşzamanlı tarama kullanın. Bununla birlikte, çizgi tarama da o zaman meydana gelir bleedthrough önlemek için de kullanılabilir. Bizim konfokal da 2-3 saniyede z yığınlarının (30-50 bölümleri) etkinleştirerek, z 3 msn adımları yapabilirsiniz PInano Piezo aşaması (MCL) ile donatılmıştır. Bir galvano tarayıcı ve bir rezonans tarayıcı - sistemleri de bir spektral dedektörü, Perfect Odak (lazer ofset), ve iki tarayıcılar vardır. </li><li> Uygun hedefi seçin. Ana konuları: <ol><li> Su / Yağ / Hava hedefi: ana dikkate numunenin orta vs görüntüleme ortamın kırılma indeksi olduğunu. <ol><li> Yağ hedefi avantajları: <ol><li> Yağ hedefleri yüksek sayısal diyafram (yağ sonları su daha hafif, ve bu nedenle daha fotonlar objektif geri dönmek) olabilir. Petrol hedefleri kadar olabilirNA 1.49, su için 1,27 karşılaştırılan. (Ancak, bu aslında çözünürlükte büyük bir fark değildir). </li><li> Yağ kırılma indisi camın kırılma indisi eşleşir, dolayısıyla herhangi bir foton amaç için, camdan, örnek gidiş kaybolur. (Not - Hedefiniz ve lamel için uygun bir refraktif indekse sahip bir immersiyon yağı seçti). </li><li> Buharlaşması olmadığından Petrol sorunsuz uzun zaman geçerse sağlar. </li></ol> Yağ Amaç dezavantajları: <ol><li> Hafif sulu bir ortamda (örneğin, bir hücre gibi) aracılığıyla seyahat etmek varsa yağ hedeflerinin yüksek NA tarafından etkinleştirilmiş yüksek çözünürlük hızla düşürür. </li><li> Görüntüler genellikle daha küresel sapmaları var ve bir 3D efekti &quot;uzattı&quot;. </li><li> Petrol, yapışkan dağınık ve hedefleri için bir tehlike olduğunu. </li></ol></li><li> Su objektif avantajları <ol><li> Hücrenin kendini sulu, bu nedenle z daha az çarpıklıklara, bir vardırnd çözünürlük sulu bir numune içine yüksek derin kalır. </li><li> Temiz ve kullanıcı dostu. Su hedefi dezavantajları: buharlaşır hızlı, hedefe devamlı su pompalamak için yapılan özel düzenlemeler olmadan uzun filmler için bu nedenle uygun değildir. </li></ol></li><li> Hava amacı avantajları: 1. Hiç bir malzeme çoklu nokta edinimi veya uzun bir film sırasında / buharlaşır kaybolur. 2. Temiz ve kullanıcı dostu. Dezavantajı: düşük çözünürlükte ve düşük sinyal hassasiyeti. </li></ol></li><li> Oda ve inkübatör sıcaklığı: değişen sıcaklık maddenin özelliklerini etkilemektedir ve narin sistemlerinde odak değiştirir. Sıcaklık edinimi için puan seçmeden önce ayarlanmalıdır. Edinimi sırasında sıcaklık değiştirme görüntüleme bozacak ve odak kaybına neden olacaktır. Biz mikroskop sistemi görüntülemesi önce istenilen sıcaklıkta 2 saat dengeye izin. </li><li> Düzeltme yaka: Birçok amaçları sağlayan bir düzeltme halkası ile birlikte gelirAmaç belirli bir kapak kayma kalınlığı için ayarlanır. Biz nokta dağılım fonksiyonu görselleştirmek için floresan boncuk kullanarak düzeltme yaka ayarlamanızı öneririz. Bu, her örnek için doğru ayarları sağlayacaktır. </li><li> Kararlı örnek tutucular: biz çoğu piyasada bulunan numune tutucuları mikroskop zayıf parçası olduğunu bulmak. Bunlar genellikle titrek ve düz değildir. Bu, yüksek çözünürlüklü, çoklu-nokta 4D görüntüleme için bir felaket olur. Biz düz olan kendi örnek tutucuları tasarım ve sahneye sıkıca kapanmış. Bunlar gerektiğinde aşağı cıvatalı olabilir. </li><li> Çok noktalı edinimi: Bizim görüntüleme sistemi temelde bir lazer tabanlı otomatik odaklama mekanizması Nikon &quot;Mükemmel odak&quot; sistemi ile donatılmıştır. Sistem bir çok sürüklenme etmez, özellikle, ancak, otofokus, 4D görüntüleme ile mutlaka gerekli değildir. </li></ol></li></ol> 4. Görüntüleme <ol><li> Sistemi açın: lazerler, sahne, kontrolör, kamera ve computer yazılımı. </li><li> Sahnede tutucu plakayı, düzgün güvenli ve stabilize. </li><li> Maya konumu ve yönünü belirlemek için göz noktası kullanın. </li><li> Aydınlık kullanarak, şekil ve doku göre hücre sağlığı ve canlılığı değerlendirmek. </li><li> İlgili fluorofor (GFP örn. FITC filtresi) göre epifluorescent ışık açın ve araştırma tabidir fenotipi gösteren hücreleri üzerinde durulacak. Birden fazla dalga boyunda floresan yüksek olan hücreler ve bu yüzden ölü autofluorescent olabilir. Biz bir SV40 NLS sinyali (NLS-TFP) erimiş bir tdTomato florofor ile nükleus görselleştirmek. TFP iki defa GFP boyutu ve çekirdeğin difüzyon sınırın üzerinde bu nedenle, bu nedenle de bir nükleer işaretleyici olarak çok iyi çalışır. Biz de GFP gibi aynı anda bir yeşil (488 nm) lazer ile TFP heyecanlandırmak, ama spektral çözünürlüğü için iki ayrı Proje Yönetim Ekipleri içine yeşil ve kırmızı emisyon toplayabilir. </li><li> Gürültüyü en aza indirmek için aşağıdaki ayarları yapınve doygunluk: <ol><li> Lazer güç - photobleaching ve görüntünün fototoksisite vs parlaklığını düşünülmelidir. </li><li> Kazanç: kamera hassasiyetini etkiler, böylece Sinyal Gürültü Oranı. </li><li> İğne deliği çapı - kısa dalga boylu lazer göre ayarlanmalıdır. İğne deliği çapı optik bölümün kalınlığı (yüksekliği) görüntülenmiş belirler. Böylece, iğne deliği açarak daha fazla ışık (daha fotonlar izin) toplamak, ancak z (daha az confocality) çözünürlüğü düşecektir. </li></ol></li><li> Faydalı ipuçları: <ol><li> Farklı floroforlar uyuşan dalgaboyu yayarsak, sanal filtrelerin seçimi sağlayan Spectral Dedektör özelliğini kullanın. Spektral dedektörleri düzenli Proje Yönetim Ekipleri daha az duyarlı olduğunu unutmayın. </li><li> Farklı floroforlar aynı lazer tarafından heyecanlıyız, satır tarama özelliğini kullanın. </li><li> Bir Galvano tarayıcı daha fazla hassasiyet sağlar, ancak photobleaching için daha yüksek bir risk vardır. Bir Rezonans tarayıcı daha hızlı bir olanakcquisition, böylece photobleaching için riskini azaltarak, ama daha az duyarlıdır. </li><li> İmajlar 2 ile 16 arasında değişen, ortalama gürültü oranı sinyal artırır, ama tabii ki, edinim yavaş ve yapar, lazer için numune daha fazla maruz kalma içerir. </li><li> Süresi biyolojik soru (örn. JUNQ ve IPOD oluşumu ~ 2 saat sürer) edinim ile bağlıdır. Biz time-lapse 3D kadar 30 saat için rezonans tarayıcı ile maya imaged var. </li><li> Zaman atlamalı aralıklarla-küçük aralıklarla daha tutarlı bir film yaratacak ancak beyazlatma ve dolayısıyla sinyal kaybı fotoğrafı neden olabilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gershenson, A., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+in+the+cell:+challenges+and+progress.">Protein folding in the cell: challenges and progress.</a> Current opinion in structural biology. 21, 32-41 (2011).</li><li>Aguzzi, A., Calella, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions:+protein+aggregation+and+infectious+diseases.">Prions: protein aggregation and infectious diseases.</a> Physiological reviews. 89, 1105-1152 (2009).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteotoxic+stress+and+inducible+chaperone+networks+in+neurodegenerative+disease+and+aging.">Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging.</a> Genes &amp; development. 22, 1427-14 (2008).</li><li>Cohen, E., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin+paradox:+aging,+proteotoxicity+and+neurodegeneration.">The insulin paradox: aging, proteotoxicity and neurodegeneration.</a> Nature reviews. Neuroscience. , (2008).</li><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, (1998).</li><li>Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+for+controlling+protein+aggregation.+Nature+reviews.">Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 11, 777-788 (2010).</li><li>Treusch, S., Cyr, D. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+deposits:+Protection+against+toxic+protein+species?.">Amyloid deposits: Protection against toxic protein species?.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex.). 8, 1668-1674 (2009).</li><li>Spokoini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confinement+to+Organelle-Associated+Inclusion+Structures+Mediates+Asymmetric+Inheritance+of+Aggregated+Protein+in+Budding+Yeast.">Confinement to Organelle-Associated Inclusion Structures Mediates Asymmetric Inheritance of Aggregated Protein in Budding Yeast.</a> Cell Rep. , (2012).</li><li>Weisberg, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+superoxide+dismutase+1+(SOD1G93A)+aggregates+determines+their+toxicity.">Compartmentalization of superoxide dismutase 1 (SOD1G93A) aggregates determines their toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15811-15816 (2012).</li><li>Kaganovich, D., Kopito, R., Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misfolded+proteins+partition+between+two+distinct+quality+control+compartments.">Misfolded proteins partition between two distinct quality control compartments.</a> Nature. 454, 1088 (2008).</li><li>Betting, J., Seufert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+Ubc9+mutant+protein+with+temperature-sensitive+in+vivo+function+is+subject+to+conditional+proteolysis+by+a+ubiquitin-+and+proteasome-dependent+pathway.">A yeast Ubc9 mutant protein with temperature-sensitive in vivo function is subject to conditional proteolysis by a ubiquitin- and proteasome-dependent pathway.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 25790 (1996).</li><li>Tongaonkar, P., Beck, K., Shinde, U. P., Madura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+temperature-sensitive+mutant+of+a+ubiquitin-conjugating+enzyme+and+its+use+as+a+heat-inducible+degradation+signal.">Characterization of a temperature-sensitive mutant of a ubiquitin-conjugating enzyme and its use as a heat-inducible degradation signal.</a> Analytical biochemistry. 272, 263 (1999).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biyokimyasal süreçler hakkında sezgilerimiz tepken ve ürünlerinin iyi karma çözüm bir behere dengeye ulaşmak için izin verilen masa üstü deneyler türetmek. Böyle bir ortamda, verilen bir kimyasal türlerin konsantrasyonunun bir makroskopik hacim moleküllerin bir molar miktar oranı olan bir tek sayı olarak ifade edilebilir. Hücrelerin bütün nüfusun homojenatlarında özler yürütülen batı blot, centrifugations ve spektrofotometrik ölçümler: Much biz protein yapısı ve işlevi hakkında bildiklerimizin klasik, toplu reaksiyon resmi yansıtacak yöntemler kullanılarak türetilmiştir. Biz büyütme altında hücrelerde bakmak için kullanabilirsiniz teknolojisi çarçabuk geliştirir, çoğu biyokimyasal reaksiyonları in vivo yer aldığı koşullarda klasik masa üstü senaryo bu sadece ufak bir benzerlik olmadığı kadar açık hale gelir. Sadece cel iç kısmıdırla yoğun kalabalık etkileri büyük ölçüde çeşitli reaktifler faaliyetlerini değiştirmek hangi, aynı zamanda iyi karıştırılmış oldukça tersidir, çevre dolu. In vitro olarak ve kompleks makromoleküler reaksiyon geniş bir aralık içinde in vivo etkinlikleri arasında sık eşitsizlik için hesaplar. Nowhere in vivo katlama, misfolding ve proteinlerin agregasyonu ile ilgili sorular gibi yanıltmak için daha eğilimli vitro biyokimyasal deneyler klasik kaynaklanan sezgileri vardır. Toplu reaksiyonlarda protein kimyası çalışmaları basit bir evet ya da hayır sorusu olarak verilen bir proteinin katlanma sorunu davranabilirsiniz Oysa bir canlı hücresinde makromoleküllerin bütün nüfus dinamiklerini izlemek için herhangi bir girişimde olası bütün dağıtım duyarlı olmalıdır bir polipeptid zincirini için müsait konformasyonel sonuçlarını ve misfolding ve toplama riski, özellikle de. Örneğin, bir toplu hücre ly incelemek olabilirWestern blotting ile bir araya protein doyurmak ve çoğunlukla protein çözünmeyen ve Ubikitine olmadığını belirler. Bununla birlikte, canlı hücre içinde birçok hücre üzerinde ortalama zaman tespit etmek zordur, protein alt-nüfusu bir ayrık, çözünür ve türlerin lokal konsantrasyonu çok yüksek ise, belirli bir bölme içinde Ubikitine olabilir. İkinci senaryoda büyük toplu alt-nüfusa oranla hücre canlılığı için önemli sonuçlar doğurabilir. Şaperonlar pleiotropik davranışları ve in vitro çeşitli fonksiyonları görüntüler ise Dahası, o hücreye kendi kesikli fonksiyonların mekansal ve zamansal olarak sınırlı olduğu açık hale geliyor. Biyokimya anlamak için yeni ortaya çıkan paradigma, konsantrasyon hücre nano-çevre her belirli bir değişken özelliği olur ve biyolojik süreçlerin altında yatan moleküler olaylar değil sadece zaman test edilmelidir, ama aynı zamanda spac içindee. Burada sunulan 4D görüntüleme yaklaşımı, diğer biyolojik süreçlerin herhangi bir sayı incelemek için kullanılabilir ve nasıl zaman, mekan düzenlenmiştir olsa, canlı hücrelerde protein misfolding hassas modelleme sağlayan ve çevre koşullarında değişiklikler sonrasında. Bu yazıda etkili sitoplazmada protein agregasyonunu başlangıcı ile başa çıkmak için aşamaları ve seçenekleri gösterir Ubc9 ts katlama sensörü kullanın. Toplama kalite kontrol hücre biyolojisi gösteren ek olarak, bu yaklaşım, proteostasis (örneğin Ubc9 ts oksidasyon cevap olarak protein katlanması stres ölçmek için kullanılabilir üzerinde belirli düzensizliklerin veya genetik mutasyonların etki şifresini çözmek için bir güçlü bir araç olarak hizmet edebilir kalite kontrol yolu üzerinde toksik bir agrega veya mutasyonlar) ifadesi. 4D görüntüleme doğru iki farklı protein arasındaki protein yerelleştirme veya kolokalizasyon belirlemek için de önemlidirs, ve belki geçici ama önemli olması olayları algılamak için. Örneğin, özellikle bira mayası gibi küçük bir küresel organizmada, o 4D görüntüleme bu sadece muayene açısı bir dışlayıcı olduğunu ortaya çıkarabilir, oysa bir yapı veya agrega, juxtanuclear lokalizasyonu olduğu durumda görünebilir. Burada mevcut örnekte deneyde, bir modelin kullanımı sitoplazmada zaman ve mekan içindeki agregasyonu kalite kontrol takip etmek için protein, Ubc9 ts, katlanan göstermektedir. Müsamahakâr sıcaklıkta, Ubc9 ts katlandığında ve çekirdek ve sitoplazmada dağınık. Isı kaynaklı misfolding üzerine, başlangıçta hızla proteozomal bozulması için işlenir difüzyon küçük agrega Stres Foci oluşturur. Proteazom kısmen inhibe edildiğinde, bu Stres Foci yaklaşık 2 saat boyunca JUNQ ve IPOD kapanımları dönüştürülür. Ubikuitin-aracılı yıkımı bir kalite kontrol seçeneği, Ub olarak mevcut değilsec9 ts hemen koruyucu toplama için IPOD dahil yeniden yönlendirilir. Bu araçlar agregasyon kalite kontrol dahil yeni genetik faktörler keşfetmek ve hücre kendi zamansal ve mekansal düzenleme keşfetmek için inanılmaz fırsatlar sunuyor.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG132</td>
			<td>Mercury</td>
			<td>mbs474790</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>con A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom plates</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>ibd81158</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation 
			Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60X water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d imaging of protein aggregation in live cells

Herhangi bir canlı hücrenin önemli görevlerinden biri sürekli değişen çevre koşulları ve intraselüler ortamda sıkışık olduğunu, yapışkan ve protein stabilitesinin 1 için tehlikeli karşısında yeni sentezlenen proteinlerin doğru katlanır sürdürmektedir. Dinamik protein üretimi, katlama ve yıkımı denge yeteneği olan mutlak bir zorunluluk zaman arızalar iyi görülmektedir yüksek uzman kalite kontrol amaçlı, ister. Böyle ALS, Alzheimer, Parkinson ve Kistik Fibrozis bazı şekilleri gibi hastalıklar protein katlanması kalite kontrol bileşenleri 2 doğrudan bir bağlantı vardır ve bu nedenle gelecekteki terapötik gelişme temel süreçlerin temel bir anlayış gerektirir. Bizim deneysel meydan hücreleri hasara sinyalleri entegre ve farklı koşullara uyarlanmış tepkileri monte nasıl anlamaktır. Protein misfolding varoluşsal thre temsil neden birincil sebebihücreye de agrega için yanlış katlanmış proteinlerin eğilimi böylece kalabalık ve hassas intraselüler Katlama ortamının 1 küresel bir pertürbasyon neden olduğunu. Katlama sağlık veya hücresel proteomun &quot;proteostasis,&quot; ayrıntılı bir kalite kontrol sistemi 3,4 farklı mekanistik birimlerin koordineli eylemi tarafından, hatta yaşlanma, stres ve oksidatif hasarın baskı altında tutulur. Moleküler chaperones bir uzman makine yerli olmayan polipeptitler bağlamak ve yerel devlet 1 içine katlanabilir teşvik edebilir, ubikuitin-proteazom sistemi 5 tarafından bozulması için onları hedef, ya da koruyucu toplama kapanımlar 6-9 yönlendirmek. Juxtanuclear kalite kontrol bölmesi (JUNQ) ve çözünmeyen protein yatağı (IPOD) (- modeli Şekil 1): Ökaryotlarda sitosolik toplama kalite kontrol yük iki bölme 8-10 arasında bölüştürüldü.Protein katlanması kalite kontrol makine tarafından Ubikitine proteinler onlar proteozom tarafından yıkımı için işlenir JUNQ, teslim edilir. Ubikitine değildir katlanan proteinleri, aktif bir koruyucu bölmeye toplanır IPOD, yönlendirilir. Bu noktaya kadar, canlı hücre floresan mikroskop metodolojik paradigması büyük ölçüde etiket proteinlere olmuştur ve iki boyutta zaman noktalarında ve genellikle belirli bir noktadaki hücre içindeki konumları izlemek. Yeni teknolojiler canlı hücrelerde deneyciler Mikronaltı ölçeğine görülmemiş erişim izni başladı gibi, sitoplazmada dinamik mimarisi deneysel karakterizasyonu için zorlu bir yeni sınır olarak görünümü haline gelmiştir. Hızla saat boyunca maya sitozol içinde birden fazla fluoresan etiketli proteinlerin 3D mekansal dağılımları izlenmesi için bir yöntem sunmaktır. 3D timelapse (4D görüntüleme) değil, sadece teknik bir sorundur; sıçanOnu, o da hücresel yapısının incelenmesinde kullanılan kavramsal çerçeve içinde dramatik bir değişim kolaylaştırır. Biz hızlı 4D floresan görüntüleme kullanarak, hücresel agregasyon kalite kontrol katlanan proteinleri için ayrı kaderi görselleştirmek için canlı maya sitozolik bir katlama sensörü proteini kullanır. Ubc9 protein 10-12 (Ubc9 TS) ısı duyarlı mutant hücresel proteostasis bir sensörü, ve izleme toplama kalite kontrolü için bir fizyolojik örnek olarak her ikisi son derece etkilidir. Çoğu ts proteinlerde olduğu gibi, Ubc9 ts aktif hücresel şaperonlar nedeniyle ılımlı sıcaklıklarda tamamen katlanmış ve işlevseldir. 30 ° C üzerinde ya da hücre misfolding stres, Ubc9 ts misfolds yüzler ve mutasyon, ısı denatürasyon, ya da oksidatif hasara bağlı olarak katlanan olan bir yerli proteinin küresel kader izlediğinde. O Stres Foci oluşturur, ya da olduğu gibi fırınlarında bu GFP veya diğer floroforlar için, 3D izlenebilir diJUNQ veya IPOD için düzeltilmelidir.

<html><img alt="Şekil 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1.jpg" /> Şekil 1. . Kalite kontrol amaçlı farklı fonksiyonları ile farklı bölmelere katlanan proteinleri yönlendirir katlanan proteinleri Alt hücresel bölümlendirme: Model Çözünür proteinlerin yıkımı için hedeflenen, poli-ubikuitinasyon geçmesi ve Ju XTA-N uclear Q uality kontrol bölmesi (JUNQ gönderilir ). Ancak bunlar aktif toplama tabi burada Ubikitine edilemez çözünmeyen proteinler vakuol bitişik bir nsoluble Pr otein D eposit (IPOD), karşı koruyucu haciz için gönderilir. es.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. GFP-Ubc9 ts Modelleme proteinin hatalı katlanması. Normal şartlar altında, GFP-Ubc9 ts (yeşil) yerel katlanır ve nükleus ve sitoplazmada diffüz lokalizedir. Nukleus NLS-TFP (kırmızı) ile etiketlenmiştir. Ubc9 ts İfade Tüm deneylerde görüntüleme öncesinde% 2 glukoz ilave edilerek kapatmak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50083/50083fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <ol><li> 37 ile ısı değişimi üzerine ° C, GFP-Ubc9 ts (yeşil) katlanan ve sitosolik gerilme Foci oluşturur. Nukleus NLS-TFP (kırmızı) ile etiketlenmiştir. </li><li> 23 ° C, ısı şok kurtarma üzerine termal denatüre GFP-Ubc9 ts düşer, azaldıkça floresans düzeyi ile gösterilir. </li><li> 80 Mm MG132, GFP-U ile 37 ° C ve proteazom inhibisyonu sıcaklık kayması üzerine<html> bc9 ts JUNQ ve IPOD kapanımlar halinde katlanan ve işlenir. Nukleus NLS-TFP (kırmızı) ile etiketlenmiştir. </li><li> 37 Sıcaklık kayması üzerine ° C ve ubikuitinasyon inhibisyonu, GFP-Ubc9 ts IPOD dahil içine katlanan ve işlenir. Nukleus NLS-TFP (kırmızı) ile etiketlenmiştir. Ubikitin Proteaz 4 (Ubp4) Ubc9 ts ubikuitinasyon engellemek için aşırı eksprese edilmektedir. </li></ol><img alt="Şekil 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3.jpg" /> Şekil 3,. JUNQ ve IPOD oluşumu Zaman atlamalı. 37&#39;ye sıcaklık kayması üzerine ° C ve 80 Mm MG132 ile proteazom inhibisyonu, GFP-Ubc9 ts Stres Foci JUNQ ve IPOD kapanımlar halinde işlenir. Nukleus NLS-TFP (kırmızı) ile etiketlenmiştir. 3D görüntüler 4 dk aralıklarla elde edildi. (Ayrıca Film 1&#39;e bakınız).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.

Watch this Scientific Journal Video about 4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells at JoVE.com

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Hücresel canlılığı proteinin hatalı katlanması zamanında ve etkin yönetimine bağlıdır. Inklüzyonlarınca refolding, bozulması veya sekestrasyon: Burada bir katlanan proteinin farklı potansiyel kaderi görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz Ubc9, katlanabilir sensör kullanımını göstermek<sup&gt; Ts</sup&gt;, Izleme proteostasis ve 4D mikroskopi kullanılarak canlı hücrelerde toplama kalite kontrol için.

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

4d-imaging-of-protein-aggregation-in-live-cells

Research

JoVE Journal

Biology

17.2K Görüntüleme.  Hebrew University of Jerusalem. Hücresel canlılığı proteinin hatalı katlanması zamanında ve etkin yönetimine bağlıdır. Inklüzyonlarınca refolding, bozulması veya sekestrasyon: Burada bir katlanan proteinin farklı potansiyel kaderi görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz Ubc9, katlanabilir sensör kullanımını göstermek Ts, Izleme proteostasis ve 4D mikroskopi kullanılarak canlı hücrelerde toplama kalite kontrol için.

Video: 4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Biyoloji

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

In Vitro toplama Deneyler hiperfosforile tau proteini kullanılarak

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

Confocal mikroskobu ortaya hücre yüzey reseptör toplama görüntü korelasyon spektroskopisi ile

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

Maya 4D mikroskopisi

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) provide accurate information about PPIs in live cells. FLIM-FRET relies on measuring the fluorescence lifetime decay of a FRET donor at each pixel of the FLIM image, providing quantitative and accurate information about PPIs and their spatial cellular organizations. We propose here a detailed protocol for FLIM-FRET measurements that we applied to monitor PPIs in live Pseudomonas aeruginosa in the particular case of two interacting proteins expressed with highly different copy numbers to demonstrate the quality and robustness of the technique at revealing critical features of PPIs. This protocol describes in detail all the necessary steps for PPI characterization - starting from bacterial mutant constructions up to the final analysis using recently developed tools providing advanced visualization possibilities for a straightforward interpretation of complex FLIM-FRET data.

We describe here a protocol to characterize protein-protein interactions between two highly-differently expressed proteins in live Pseudomonas aeruginosa using FLIM-FRET measurements. The protocol includes bacteria strain constructions, bacteria immobilization, imaging and post-imaging data analysis routines.

Canlı Bakterilerde Protein-Protein Etkileşimlerinin FLIM-FRET Ölçümleri.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...