Bu çalışma, C. VA Araştırma Servisi-MT NIH ve Başarı bir RO1 tarafından desteklenen ve CWL bireysel bir NRSA

Genel tasarım konuları Fotoğraf stimülasyon dalga boyu optogenetic deneyler gibi görünür aralığı ise, sistemin düzenini UV fotoliz deneyler için çok daha basit olacaktır. Bir tek mikroskop şirketlerin tüm kullanılabilir bir çift kamera port modülü satın almak gerekiyor. DMD düzlemde iki kamera limanlarından birini eşlenik görüntü düzlemine yerleştirilmiş olabilir. Ama kamera görüntüleme tüp lens, piyasada bulunan mikroskoplar herhangi bir UV dalgaboyu için düzeltilmiş çünkü UV fotoliz DMD kaynaklanan ışık, epi-aydınlatma yolu (Şekil 3A) aracılığıyla getirilen olmalıdır. 350 nm&#39;de görüntüleme tüp lens küresel aberasyon, dar bir noktaya ışık odaklanmak için yeterli uzaysal çözünürlük oluşturmak için yeteneği engelleyecek kadar şiddetli. Collimated bir lazer ışını aynı optik eksen boyunca getirilen tüp lens kaldırılmış olduğundan, bu sorun konfokal mikroskopi karşılaşılan değildir. Orada tüp lensler, UV dalga boyunda küresel aberasyon kısmen giderilmiştir, çünkü UV aydınlatma sorunu epi-floresan yolu ışık getirmek tarafından çözülebilir. Biz herhangi bir derecede dergi dilek optik mikroskoplar genişletebilirsiniz. Bilimsel topluluk bu konuda genel hızlı ilgi ve iyi öğreten pek çok kaynak var. Mikroskop değişiklikleri en aza indirmek ve epi-floresan birim sıkı alan kısıtlamaları nedeniyle amacıyla, DMD bir röle lens (DMD ünitesi pozisyonu ile ilgili olarak işaret tarafından oluşturulan yeni oluşturulan eşlenik görüntü düzlemi yer almaktadır mikroskop). Ticari bir UV röle objektif (diyagram ve mikroskop işaret) (Özel Optik) satın alındı ​​düzeltildi. DMD aydınlatma Ikili giriş aldıktan sonra micromirror olumlu ve olumsuz bir 12 ° eğim çip düzlemine göre arasında geçiş yapabilirsiniz. Dönme eksenine çapraz köşeleri boyunca her ayna (çip taraf için 45 °). Ayna dönüş yönünü çip ön yüzeyi bir köşesinde altın renkli üçgen ile belirlenir. Micromirror eğim açısı gelen ışık demetinin pitch ve azithmus hizalama belirler. Aydınlatma demetinin adım DMD çipi ve azithmus ihtiyaçlarını ayna dönme eksenine dik dik eksen ile 24 ° olması gerekir. Hassas ışın uyum verimli çalışması için kritik öneme sahiptir. Prototip sistem tasarım ve işleme yetersizliklerini düzeltmek için izin birden fazla manuel tilt ayarlamaları tasarlanmıştır. Bu gereklidir göre çok daha hantal bir sistem sonuçlandı. Işık getirmek için alternatif, daha kompakt bir düzenleme (faydalı gördüğü takdirde alternatif tasarım) mümkündür. Fotoliz deneyler için bir lazer kaynağı, yüksek ışık yoğunlukta odaklanmış ışın hızlı uncaging için gerekli oluşturmak için gereklidir. Optogenetic deneyler için yüksek yoğunluklu keskin odaklanmış ışık gerekli değildir, tutarlı olmayan bir ışık kaynağı yeterli olacaktır. Fotoliz deneyi burada açıklanan yarı-sürekli bir diyot frekansı NdVO4 lazer (1 W, 355 nm) üçe katı hal (DPSS) pompalanır kullandı. (Fotoliz ışık kaynağı seçenekleri ayrıntılı bir tartışma için bkz. Referansı 2). Nispeten yüksek güçlü lazer DMD bir sistemi kullanarak lazer çıkışı sadece küçük bir bölümünü aslında numune teslim edilir, çünkü burada açıklanan deneyler gereklidir. Miktar numune teslim ışık, lazer ışını ile aydınlatılan bölgenin içinde ON / OFF aynalar sayısının oranına orantılıdır. Bir lazer ışık kaynağı gerekiyorsa, DMD aydınlatmak için doğru ekseni boyunca kolayca konumunu ve odaklı böylece multimode fiber lazer çıkış başlatmak için en iyisidir. Fiber optik ışık Verici tutarlı aydınlatma doğasında speckle desenler nasıl ortadan kaldırmak için, ikinci bir sorunu çözer. Fiber ~ 40 kHz dolaşacaktır bir piezoelektrik fiber sedye (model 915, Kanada Enstrümantasyon ve Araştırma Ltd) etrafında sarılır. (Teçhizat nokta bu dışarı) fiber uzanan mikroskopik bu nedenle etkili speckling etkisini ortadan kaldırarak, her fotoğraf stimülasyon darbe milisaniye süresince pek çok kez desen speckle hamle için yeterli. Fiber optik çıkış, daha sonra bir UV mikroskop (Olympus DApo20UV) amacı ile collimated. (Bu çıkış noktası), sistemin optik çözünürlük bir kalibrasyon Şekil. 3b. Etkili fizyolojik çözünürlük fotoğraf spot pozisyonun bir fonksiyonu olarak akım genliği ölçülenstimülasyon Şekil. 3C. Şekil farklı yoğunluklarda photostimulation mevcut tepkiler gösterilmiştir. 3D. Sistemin işleyişi: DMD aynalar ile birlikte kayıt CCD piksel Bir in-house yazılım görüntüleme CCD kamera belirli piksel bireysel DMD ayna yazışmalar belirler yazılmıştır. Bu yazılım içinde grafik kullanıcı arayüzü (GUI) sonra kullanıcının fare ile etiketlenen CCD görüntü bölgeye karşılık gelen DMD aynalar atamanıza olanak sağlar. Böylece, fotoğraf uyarılması için yerini sadece bilgisayar ekranında görüntülenen resmin üzerine imleci hareket ve ilgi etiketli bölge tıklayarak etiketlenir. (Dendritik çardak Bir floresan görüntü bilgisayar ekranında görüntülenir. Öğrenci, bilgisayar ekranındaki görüntü üzerinde bir takım yerlerden işareti olacaktır.) Işık teslimat için desen Programlama Operatör tarafından bilgisayar ekranında işaretlenmiş desen ayrı bir görüntü bir dizi olarak saklanır. Her mekansal desen için lazer darbeleri zamanlaması sonra, veri toplama programı (pClamp) ile entegre yazılımı içine programlanmıştır. (Bunu göstermek). DMD desen lazer bakliyat Koordinasyon Veri toplama programı başlatan ve hedef nöron elektrik sinyali kelepçeli DMD elektronik, lazer yolluk ve yama satın alma zamanlaması koordinatları. (Bilgisayarda bu sıra taklit) Deneysel veriler: Distal dendritik dallanma noktaları arasında non-lineer toplamı Elektrotlar ile Dendritik entegrasyon geleneksel yerine ayrık noktada stimülasyon genliği değişen sabit bir yoğunluğunu korurken stimülasyon alanında genişleyen yapılmıştır. Electrogenesis doygunluğu ve konum bağımlı kanallar alımı ile ilgili Sorunlar ve sonuç sonucu etkileyebilir. Dağıtılmış dendritik stimülasyon DMD tabanlı bir sistem (Şekil 4A) kullanarak kolayca uygulanabilir. Giriş yoğunluğu photostimulation, noktaların sayısını artırarak göre değişmektedir. Biz mekansal toplamı iki kızı dallar üzerinde gelen artan girdi genlikleri ile giderek supra-lineer hale dallanma noktaları arasında non-lineer olabilir görebilirsiniz. Supra-doğrusallık büyük ölçüde NMDA reseptörleri aracılık eder ve kapılı kanalları (Şekil 5) gerilimi Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 DMD micromirrors Operasyonu. (Yandan görünüm) bireysel aynalar yönelik Elektrostatik kuvvetler, iki olası yönelimleri 12 ° yatay bir ayna yatırılabilir neden olur. ON konumunda bir olay ışını çip optik eksen dik boyunca yönetti. KAPALI konumunda olay ışın 48 ° off eksen yönlendirilir. Işık aynalar arasında ince boşluklar vurur 24 ° eksen yönlendirilir. (Üstten görünüm) eğim yönelik 45 ° aynalar ve çip taraf için saygı ile. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 modern floresan mikroskop Temel düzen. Filtre küp, nesnel ve tüp objektif arasındaki &quot;sonsuz alan&quot; bir konuma sahiptir. Kamera yol açar ve örnek ışık getiren bir aydınlatma yolu bir görüntüleme yolu yoktur. Bu iki ışık yolu için tüp lens genellikle tasarım ve odak uzaklığı farklıdır. Aydınlatma, ama görüntüleme, tüp lens UV spektrumu içinde çalışması için tasarlanmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 UV bazlı DMD sistemi için Düzen. Aydınlatma UV spektrumu ise, o zaman UV düzeltilir tüp lens aracılığıyla getirilen olmalıdır. Görüntüleme yolu tüp lens UV için dizayn edilmemiştir. Bir röle sistemi kolayca erişilebilir bir eşlenik görüntü düzlemi oluşturmak için gerekli. Mikroskop farklı eşlenik görüntü uçakları noktalı kırmızı bir çizgi ile işaretlenir. Parlak bir görüntü düzlemi modellerini diğer konjuge uçakları tahmin edilmektedir. Görüntüleme sırasında örnek düzlemde desen dedektör / kamera yansıtılıyor. Aydınlatma için DMD tarafından oluşturulan desen örnek yansıtılıyor. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4, görünür ışık DMD projeksiyon sistemi için Düzen . Aydınlatma ışığı görünür aralığı ise, görüntüleme ışık yolu DMD oluşturulan ışık deseni getirmek mümkündür. Bu commerci ile kolayca uygulanabiliral çift kamera takılabilir ve uygun dikroik ayna. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 sistem Lateral çözünürlük. (A) floresan hedef Optik çözünürlük ~ 2 mm. (B) bir dendrit arasında kafesli glutamat fotoliz tarafından ölçülen Etkin çözünürlük ~ 5 mm. Mesafenin artması glutamat difüzyon ve dendrit sonlu genişlikte bir kombinasyonu kaynaklanmaktadır. (C) Fotoliz kinetiği sinaptik olayların taklit edebilir. Gerilim aile mevcut yanıtları dendrit teslim ışık enerjisi farklılıklar nedeniyle kelepçeli. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6 dendritik dallanma noktaları arasında non-lineer toplamı. (A) Dağıtılmış girişleri iki dendritik dalları için ayrı ayrı uygulanır. Kendi gerilim yanıtları aşağıda gösterilmiştir. (B) uyaranlara daha sonra aynı anda verilmiştir. Ölçülen tepki (kırmızı eser) iki ayrı yanıtlar (gri iz) aritmetik toplamından daha farklı. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7 Supralinear toplamı NMDA reseptör bağımlı. (A) APV, seçici bir NMDA reseptör antagonisti supralinear toplamı engeller. (B) uyaran yoğunluğu ilişki ve NMDA reseptör antagonisti olan duyarlılığını çizilir.

<ol>
	<li>Scanziani, M., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930-939 (2009).</li><li>Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolysis+of+caged+neurotransmitters:+Theory+and+procedures+for+light+delivery.">Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+Technology+Feature,+Cell+imaging:+Light+activated.">Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated.</a> Nature. 456, 826-827 (2008).</li><li>Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+photolysis+of+caged+neurotransmitters.">Holographic photolysis of caged neurotransmitters.</a> Nature Methods. 5, 821-827 (2008).</li><li>Hornbeck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Digital Light Processing and MEMs: An overview. , .</li></ol>

DMD tabanlı photostimulation yaklaşımın avantajı en belirgin durumlar için hedef, göreceli olarak büyük bir alanı kaplar. Ilgi hedef birkaç dendritik dikenler gibi, çok küçük ise, sıralı tarama konfokal ve 2-foton sistemleri daha iyi bir yaklaşım olması muhtemeldir. DMD yaklaşım önemli zayıflık mevcut ışık verimsiz kullanımı. Mevcut ışık toplu mutlaka OFF aynalar ve kullanılmaz. DMD tabanlı sistem, en iyi görünür aralığında işlem için uygundur. Biz ...

Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Modern upright fluorescent microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD camera and image acquisition software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer and data acquisition/interface system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DLP Discovery Developer Kit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ALP3 USB interface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>S2 + Optics w/LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dual camera port unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DPSS Laser Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser shutter Model LS6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Uniblitz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Canadian Instrument and Research, Ltd </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>100 um core multimode fiber</td>
</tr>
<tr>
<td>Multimode Fiber launcher </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Oz Optics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Signal generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>up to 50 kHz</td>
</tr>
<tr>
<td>Beam collimator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>DApo20UV340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UV relay lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Special Optics</td>
<td>#: 54-25-60-355</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

patterned photostimulation with digital micromirror devices to investigate dendritic integration across branch points

Işık nöronal eksitabilite kontrol etmek için çok yönlü ve hassas bir araçtır. Kanal rodopsin ve kafesli nörotransmitterlerin gibi ışığa duyarlı etkileyiciler son giriş, ışık alan ve deneysel nörobilim için yararlı kalıplarını kontrol etmek için daha iyi anlamına gelir gelişmekte olan çıkarları için yol açmıştır. Konfokal ve 2-foton mikroskopi çalışan geleneksel bir strateji, bir kırınım sınırlı noktaya ışık odaklanma ve daha sonra ilgi bölge üzerinde sırayla o tek nokta tarama. Bu yaklaşım, geniş alanlar kısa bir zaman penceresi içinde, görüntüleme için daha photostimulation daha uygulanabilir bir sorun uyarılmış olması durumunda sorunlu olur. Alternatif bir strateji, bir dijital micromirror cihazı (DMD) yardımı ile hedef tam mekansal desen proje. DMD yaklaşım donanım bileşenleri nispeten ucuz olduğu için cazip ve ticari çıkarları tarafından desteklenmektedir. Böyle bir sistemin dik mikroskoplar için geçerli değildir, çünkü biz böyle bir DMD sisteminin inşaat ve operasyonlarında kritik konular ele alınacaktır. Optogenetic deneyler için çok daha basit görünür ışık sistemi oluşturmak için, öncelikle UV fotoliz sisteminin inşaat açıklayan olacak olsa da, değişiklikler de sağlanacaktır. UV fotoliz sistemi nörobilim temel bir soru çalışma deneyleri carryout için kullanılan mekansal distal dendritik dallanma noktaları arasında entegre girişleri nasıl dağıtılır. Entegrasyon şube noktaları arasında doğrusal olmayan ve supralinearity büyük ölçüde NMDA reseptörleri aracılık öneririz.

Watch this Scientific Journal Video about Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points at JoVE.com

Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

Dijital micromirror cihazları (DMD) nöronal eksitabilite kontrol etmek için zaman ve mekan karmaşık desenleri oluşturabilirsiniz. Tasarım, inşaat, ve DMD sistemlerinin işletilmesi ile ilgili konular görüşülüyor. Böyle bir sistem, distal dendritik dallanma noktaları arasında doğrusal olmayan entegrasyon gösteri sağladı.

Desenli Photostimulation Şube Noktaları Arasında Dendritik Entegrasyon Araştırma Digital Micromirror Cihazlar

Light is a versatile and precise means to control neuronal excitability. The recent introduction of light sensitive effectors such as channel-rhodopsin ...

patterned-photostimulation-with-digital-micromirror-devices-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.5K Görüntüleme.  University of Maryland School of Medicine. Dijital micromirror cihazları (DMD) nöronal eksitabilite kontrol etmek için zaman ve mekan karmaşık desenleri oluşturabilirsiniz. Tasarım, inşaat, ve DMD sistemlerinin işletilmesi ile ilgili konular görüşülüyor. Böyle bir sistem, distal dendritik dallanma noktaları arasında doğrusal olmayan entegrasyon gösteri sağladı.

Video: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Biyomühendislik

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. Additionally, traversing cellular barriers in the body is crucial for both oral delivery of therapeutic NCs into the circulation and transport from the blood into tissues, where intervention is needed. NC transport across cellular barriers is achieved by: (i) the paracellular route, via transient disruption of the junctions that interlock adjacent cells, or (ii) the transcellular route, where materials are internalized by endocytosis, transported across the cell body, and secreted at the opposite cell surface (transyctosis). Delivery across cellular barriers can be facilitated by coupling therapeutics or their carriers with targeting agents that bind specifically to cell-surface markers involved in transport. Here, we provide methods to measure the extent and mechanism of NC transport across a model cell barrier, which consists of a monolayer of gastrointestinal (GI) epithelial cells grown on a porous membrane located in a transwell insert. Formation of a permeability barrier is confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), transepithelial transport of a control substance, and immunostaining of tight junctions. As an example, ~200&#160;nm polymer NCs are used, which carry a therapeutic cargo and are coated with an antibody that targets a cell-surface determinant. The antibody or therapeutic cargo is labeled with 125I for radioisotope tracing and labeled NCs are added to the upper chamber over the cell monolayer for varying periods of time. NCs associated to the cells and/or transported to the underlying chamber can be detected. Measurement of free 125I allows subtraction of the degraded fraction. The paracellular route is assessed by determining potential changes caused by NC transport to the barrier parameters described above. Transcellular transport is determined by addressing the effect of modulating endocytosis and transcytosis pathways.

Many therapeutic applications require safe and efficient transport of drug carriers and their cargoes across cellular barriers in the body. This article describes an adaptation of established methods to evaluate the rate and mechanism of transport of drug nanocarriers (NCs) across cellular barriers, such as the gastrointestinal (GI) epithelium.

Modelleri ve Hücresel Engeller Arasında İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Transport Değerlendirmesinde Yöntemleri

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient Difüzyon Sistemi 3D Kollajen Matrix Kemotaksis Araştırma

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

Demir Oksit Nanopartiküller ile Fonksiyonlu Manyetik Bakteriyel Nanocellulose Fabrikasyon

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and provide information for follow-up treatment. Here, we demonstrate the development of a cotton-based urinalysis (i.e., nitrite, total protein, and urobilinogen assays) analytical device that employs a lateral flow-based format, and is inexpensive, easily fabricated, rapid, and can be used to conduct multiple tests without cross-contamination worries. Cotton is composed of cellulose fibers with natural absorptive properties that can be leveraged for flow-based analysis. The simple but elegant fabrication process of our cotton-based analytical device is described in this study. The arrangement of the cotton structure and test pad takes advantage of the hydrophobicity and absorptive strength of each material. Because of these physical characteristics, colorimetric results can persistently adhere to the test pad. This device enables physicians to receive clinical information in a timely manner and shows great potential as a tool for early intervention.

To investigate simple fabrication approaches for multiple assay needs, we created a fluid-absorbing channel system made of cotton material. This device was used to establish a multiple detection platform, and solve contamination issues that commonly affect lateral flow-based biomedical devices, for clinical urinalysis of nitrite, total protein, and urobilinogen.

Pamuk Analitik Cihazlar imalatı

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

3D Kağıt mikroakışkan Cihazlar Construct Yapışkan Desenlendirme kullanma

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

Deneysel ve Sonlu Eleman Protokolü Eklem Kıkırdak genelinde Nötr ve Yüklü Çözünenlerin Ulaştırma Araştırma

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Soft Lithographic Procedure for Producing Plastic Microfluidic Devices with View-ports Transparent to Visible and Infrared Light

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable microfluidic devices. Here, a protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices is demonstrated, where soft lithographic techniques are used to embed transparent Calcium Fluoride (CaF2) view-ports in connection with observation chamber(s). The method is based on a replica casting approach, where a polydimethylsiloxane (PDMS) mold is produced through standard lithographic procedures and then used as the template to produce a plastic device. The plastic device features ultraviolet/visible/infrared (UV/Vis/IR) -transparent windows made of CaF2 to allow for direct observation with visible and IR light. The advantages of the proposed method include: a reduced need for accessing a clean room micro-fabrication facility, multiple view-ports, an easy and versatile connection to an external pumping system through the plastic body, flexibility of the design, e.g., open/closed channels configuration, and the possibility to add sophisticated features such as nanoporous membranes.

A protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices with transparent view-ports for visible and infrared light imaging is described.

Görünüm-bağlantı noktaları görünür ve kızılötesi ışık şeffaf plastik mikrosıvısal cihazlar üretmek için yumuşak tekniğinde yordamı

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic respiration. However, the extent to which both pathways contribute to the landscape of cellular energy production is consistently overlooked. Transformed cells cultured in saturating levels of glucose often show a decreased dependency on oxidative phosphorylation for ATP production, which is compensated by an increase in substrate-level phosphorylation. This shift in metabolic poise allows cells to proliferate despite the presence of mitochondrial toxins. In neglecting the altered metabolic poise of transformed cells, results from a pharmaceutical screening may be misinterpreted since the potentially mitotoxic effects may not be detected using model cell lines cultured in the presence of high glucose concentrations. This protocol describes the pairing of two powerful techniques, respirometry and calorimetry, which allows for the quantitative and noninvasive assessment of both aerobic and anaerobic contributions to cellular ATP production. Both aerobic and anaerobic respirations generate heat, which can be monitored via calorimetry. Meanwhile, measuring the rate of oxygen consumption can assess the extent of aerobic respiration. When both heat dissipation and oxygen consumption are measured simultaneously, the calorespirometric ratio can be determined. The experimentally obtained value can then be compared to the theoretical oxycaloric equivalent and the extent of the anaerobic respiration can be judged. Thus, calorespirometry provides a unique method to analyze a wide range of biological questions, including drug development, microbial growth, and fundamental bioenergetics under both normoxic and hypoxic conditions.

This protocol describes calorespirometry, the direct and simultaneous measurement of both heat dissipation and respiration, which provides a noninvasive approach to assess energy metabolism. This technique is used to assess the contribution of both aerobic and anaerobic pathways to energy utilization by monitoring the total cellular energy flow.

Calorespirometry: Hücresel enerji metabolizması araştırmak için bir güçlü, invaziv olmayan bir yaklaşım

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

Yüksek çözünürlüklü desenli biyofilm ifade kullanarak pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...