Washington Üniversitesi&#39;nde toplu bilgi Bu protokol mümkün kıldı tüm Maurer grubu tanımak istiyoruz. Ulusal Akıl Sağlığı Enstitüsü (1R01MH085495) tarafından bu iş için finansman sağlanır.

1. Desenli Master (Şekil 1) hazırlanması <ol><li> Merkezi Silikon spin-lak gofret gofret ve Tablo 1&#39;de iki zamanlı spin programının ilk adımı sırasında aseton ile durulayın. Aseton, temiz, kuru bir gofret terk spin programının ikinci adımı sırasında buharlaşır. </li><li> Yaklaşık 1 ml uygulayın AZ9245 Tablo 1&#39;de açıklanan şartlar kullanarak gofret ve spin-kat fotorezist / (çapı). </li><li> Yumuşak fırında 110 fotorezist kaplı gofret ° C yüksek bir tekdüzelik ocak kullanarak 2 m. </li><li> Photopattern ya doğrudan yazma fotolitografi sistemi ya da bir maske hizalama sistemi ve uygun maske kullanarak substrat. Maskeler bir dizi ticari kaynaklardan satın alınabilir. Ayrıca, optik bir düz bantlanmış UV emici mürekkep ile basılmış saydamlar büyük özellikleri ile kalıplarını üretmek için kullanılıyor olabilir. </li><li> 1 m 45 s yavaşça sallanarak yarı-iletken sınıfı deiyonize su: 01:02 400K geliştirici desenli gofret geliştirin. Yarı-iletken sınıfı deiyonize su ve azot (N 2) gaz akışı kuru ile iyice durulayın. Desen geliştirme UV filtresi ile bir mikroskop kullanılarak kontrol edilebilir. Desen tam gelişmiş değilse, gofret, ek süre için gelişmekte olan çözüm iade edilebilir. </li></ol> Not: En iyi sonuç için, temiz bir ortamda photopatterning yürütülen olmalıdır. 2. PDMS Damga hazırlanması (Şekil 2) <ol><li> 10:1 kilo reçine sertleştirici karışım hazırlayın: Sylgard 182 (PDMS) ve tamamen tek bir petri karışımı ile master (photopatterned gofret) kapsayacak. </li><li> De-gaz PDMS kaplı kabarcıklar görülebilir ve damga 1,5 saat boyunca 65 ° C&#39;de fırında tedavisi için izin kadar usta bir vakum desikatöre Kür için, önce ana çanak alt yüzeyi de gazla adım sırasında artabilir emin olun önemlidir. </li><li> Ana dışarı damga PDMS kesin ve uygun boyutu ile düzeltin. Pul, toz ve enkaz korumak için kapalı bir kap (up özelliği tarafı) saklayın. </li></ol> 3. Desenli Altın Yüzey Hazırlama (Şekil 3) <ol><li> No 25 mm hazırlayın. 10 m. oksijen plazma ile onları tedavi için 1 yuvarlak cam metal birikimi lamelleri N 2 gaz akışı ile her adım arasında kurutma, etanol ile iki kez 18.2 M deiyonize su ile iki kez durulayın. </li><li> Elektron demeti biriktirme sistemi kullanarak bir çok cep 150 Å altın, mevduat 50 Å titanyum izledi. Titanyum tabakası birikimi ve altın tabakası arasındaki evaporatör havalandırma etmeyin. Alternatif olarak, altın kaplı lamelleri bir tedarikçi çeşitli satın alınabilir, ancak, metal katmanlar, elektron ışını, buharlaşma ve termal değil buharlaşma tarafından hazırlanan olduğu önemlidir. Kullanmadan önce 11: dışında bir kaynaktan satın aldıysanız, altın substratlar plazma oksidasyon veya &quot;piranha&quot; (% 30 H 2 O 2 07:03 Conc H 2 SO 4) tarafından temizlenebilir olabilir. </li></ol> Not: &quot;Piranha&quot; çözüm organik bileşiklerin varlığını patlayıcı. <ol start="3"><li> Damgalama çözüm, mutlak etanol içinde 10 mM hexadecanethiol, ve dolgu çözüm, mutlak etanol içinde 1 mM glikol sonlandırılmış tiyol hazırlayın. </li><li> Etanol ile damga N 2 gazı ile durulayın ve iyice kurulayın. Tamamen kaplı kadar PDMS damga damla damla çözüm damgalama uygulayın. N 2 gaz damga ile iyice kurulayın. 5a ve 5b PDMS damga özelliklerine göre uygun olarak devam edin. </li><li><ol class="lalpha"><li> Altın yüzey üzerine hafifçe damga basın ve tek tabaka oluşturmak için izin vermek için 15 sn </li><li> Yüzey batık sağlanması, altın substrat 18.2 M deiyonize su içeren bir petri kaplarına yerleştirin. Altın yüzey üzerine hafifçe damga basın ve tek tabaka oluşturmak için izin vermek için 15 sn </li></ol></li><li> N 2 gazı ile kurutma, her yıkayın ve bir petri substrat yerleştirdikten sonra etanol ile damgalı yüzey iki kez durulayın . </li><li> Çözüm dolgu Kapak Yüzey ve buharlaşmasını önlemek için parafilm çanak mühür. </li><li> Arka plan tek tabaka, 12-14 saat süreyle karanlıkta form izin ver </li><li> Dolgu çözüm desenli lamel çıkarın ve her durulama sonra N 2 gazı ile kurutma, etanol ile iki defa yıkayınız . </li></ol> 4. Desenli Yüzey Protein ve Hücreler uygulanması <ol><li> 500 mcL 1 Dulbecco&#39;nun Fosfat ml ile küçük bir petri veya hücre kültür odası ve kapak desenli lamel Place (DPBS) Tuzlu Tamponlu. DPBS tamamen hatta protein kapsamı sağlamak için protein inkübasyon sırasında yüzey kapsamalıdır. </li><li> DPBS protein konsantre bir çözüm ekleyin ve boru çözüm karıştırmakting birkaç kez. Yüzey protein karışımı 37 ° C&#39;de için 1 saat Final laminin ve fibronektin konsantrasyonu tipik olarak sırasıyla 12 mcg / mL ve 20 mcg / ml. Protein kolay desen görünüm için izin amin reaktif floresan boya ile etiketli olabilir. Ancak, protein etiketli, etiketsiz protein ile protein etiketleme 01:01 biyolojik aktivite ile müdahale karıştırılmalıdır. </li><li> Inkübasyondan sonra, Yüzey kuru veya hava-su arayüzü üzerinden getirmek için özen bağlanmamış protein kaldırmak için DPBS (4 5x) ile yüzey iyice durulayın. Ilk üç durular sonra, ıslak bir zemin korumak için tam bir hücre büyümesi medya yaklaşık 500 mcL ekleyin. </li><li> Taze medya ile yüzey durulama için kullanılan büyüme ortamı değiştirin. </li><li> Ilgimiz yüzeye kaplama için hücreleri saymak. CHO-K1 hücreleri gibi hipokampal nöron, ya da hücre hatları ölümsüzleştirdi Ya ayrışmış, birincil hücreler kullanılabilir. </li><li> Plaka ayrışmış hücreler yüzeye. Genellikle 30 ila 200 hücre / mm 2 kullanılır. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 desenli ana fotolitografik hazırlanması için genel şematik. Bu süreçte, bir silikon yonga, aseton ile temizlenir, ilgi desen maruz fotorezist ile kaplı ve model geliştirilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 PDMS pul hazırlanması için Genel şematik. Bu süreçte, desenli ana Sylgard (10:1 reçine sertleştirici) ile kaplıdır, 60 yaşında bir fırın tedavi bir vakum desikatörde ° C de gaz verilerek ve büyüklüğüne göre kesilmemiş. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 substrat desenlendirme için genel şematik. Bu süreçte, cam yüzeyler bir elektron ışını glikol sonlandırılır Alkan tiyoller yeniden toprakla PDMS damga kullanarak microcontact baskı hexadecanethiol tarafından desenli evaporatör, ve floresan etiketli protein ile kaplı titanyum (50A) ve altın (150A) ile kaplıdır. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4 Desenli ana (A) ve (B) PDMS damga açıklanan yöntemler kullanılarak hazırlanmıştır. Ölçeği bar 100μm. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig5.jpg" alt="Şekil 5"/> Şekil 5 Desenli SAMs AlexaFluor 647 etiketli fibronektin (A) ve CHO-K1 hücre hapsi (B) ile görüntülendi. Ölçeği çubuklar 100 mikron. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig6.jpg" alt="Şekil 6"/> Şekil 6 E18 in vitro 4 gün fare hipokampal nöronlar Desenli laminin numaralı seribaşı. AlexaFluor, 350-konjuge anti-laminin antikor desen görselleştirme (A) için kullanılır ve E18 fare hipokampal nöronlar MitoTracker Red 580 (B) ile boyandı. Ölçeği çubuklar 100 mikron. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig7.jpg" alt="Şekil 7"/> Şekil 7 desenli yüzey hazırlığının potansiyel tuzaklar AlexaFluor fibronektin adsorpsiyon 647-konjuge tarafından görüntülendi. Düzensiz protein adsorpsiyonu (A) Yetersiz karıştırma yol açar. (B) kısmi patten transferi yol açar damgalama sırasında basınç Düzensiz uygulama. (C) damgalama sırasında aşırı basınç çöküşü damga yol açabilir. (D), durulama sırasında hava ile su yüzeyi desenli yüzey Pozlama arka plan protein adsorpsiyonu neden olabilir. Ölçeği çubuklar 100 mikron. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig8.jpg" alt="Şekil 8"/> Şekil 8 - Batık desenlendirme, hava geleneksel microcontact baskı yazdırmak için zor küçük özellikleri ile desen üretebilir. Görüntüler (A) ve (B), aynı desenin farklı bölgelerinde hava aynı PDMS damgası (A) veya deiyonize su (B) ile yazdırılan göstermek. Surround desen (damgası çöküşü önlemeye yardımcı eklendi) 10μm çapında destek hatları (A), ancak resimde gösterildiği gibi küçük nokta özellikleri (B) görmedim. Görülür. Bu hava bu baskı daha geniş özellikler için iyi çalışır, ancak su basarken küçük özelliklere sahip modelleri için gerekli olabilir göstermektedir. Ölçek çubuklar 20 mm. <table border="1"><tbody><tr><td> Devir </td><td> Hızlandırma Oranı (dev / s) </td><td> Nihai Hızı (rpm) </td><td> Zaman (s) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 500 </td><td> 1000 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3800 </td><td> 3800 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> Tablo 1.İki döngüsü spin program bir silikon yonga üzerinde AZ9245 4,5 mikron kalınlığında kaplama oluşturmak için kullanılır. Desenli yüzeyler, paslanmaz çeliğin bir ana oluşumu için PDMS pulları hazırlamak için ilk olarak imal edilir (Şekil 1 ve 4A). Ana pulu ters ve ya doğrudan yazma litografi sistemi ya da bir maske hizalama kullanılarak oluşturulur. Gibi AZ9245 olarak olumlu fotorezist, ana üretim için kullanıldığında, karşı kaplı gofret son substrat görünecektir aynı deseni ile ışığa maruz kalmaktadır. Her zaman mümkün olmasa da, PDMS pul ustaları için ideal boy oranı (kalınlığı direnmeye özelliği boyutu) 01:02 olduğu rapor edilmiştir. 13 niteliğine bağlı olarak, 1:40 boy oranları mümkün olduğunu bulduk desen. Burada açıklanan koşullar altında AZ9245 kaplı silikon gofret nominal kalınlığı 4.5 mm ile paslanmaz çeliğin vermek. AZ9245 bu kalınlığı&gt; 100 mm 2 mikron arasında değişen özellikleri ile PDMS ustaları üretmek için kullanılan olabilir bulduk. PDMS pulları fotorezist (Şekil 2) fabrikasyon ana kullanarak Sylgard 182 (veya Sylgard 184) dökme. Rezist ustaları aynı damga birçok kopyalarını oluşturmak için birden çok kez kullanılabilir. Sertleştirme PDMS sonra, pullar, bir tıraş bıçağı ve damga pulu özelliği yan cam lamel (Şekil 4B) koyarak mikroskop altında görüntülenebilmekte kullanarak ana kaldırılır Floresan etiketli protein (Şekil 3 ve 5) uygulaması ile görülebilmesi keskin, net protein desen Uygun damgalama sonuçlanır. Alternatif olarak, immünhistokimya hücre sabitleme sonra protein deseni (Şekil 6) görselleştirmek için kullanılıyor olabilir. Hücre büyümesi ölümsüzleştirdi hücre hatları ve birincil hücreler (Şekil 5 ve 6) hem de protein desen de sınırlı. Bu tekniği kolayca hakim olmakla birlikte, bazı ortak sorunlar ortaya çıkabilir. DPBS konsantre bir protein solüsyonu yeterli karıştırma olmadan protein uygulaması düzensiz protein desenleri (Şekil 7A) yol açabilir. Yanlış damgalama kısmi desen transfer veya damga çöküşü (Şekil 7B-C) yol açabilir. Buna ek olarak, hava adsorbe protein içeren arka planda azalmış direnç (Şekil 7D) neden tek tabaka bozabilir desenli substrat ortaya. Çok küçük (&lt;5 mm) ve yüksek boy oranları oluşan desenler çoğu batık microcontact baskı kullanılmasını gerektirir. Bu prosedürü (3.5b) su (Şekil 8) desen dışında yüzeye yatırma hexadecanethiol önlemek için bir bariyer olarak kullanılan 14

<ol>
	<li>Wilbur, J., Kumar, A., Biebuyck, H., Kim, E., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers:+Applications+in+microfabrication.">Microcontact printing of self-assembled monolayers: Applications in microfabrication.</a> Nanotechnology. 7, 452-457 (1996).</li><li>Chang, J., Brewer, G., Wheeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+microstamping+technique+enhances+polylysine+transfer+and+neuronal+cell+patterning.">A modified microstamping technique enhances polylysine transfer and neuronal cell patterning.</a> Biomaterials. 24, 2863-2870 (2003).</li><li>Lange, S., Benes, V., Kern, D., Horber, J., Bernard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+DNA+molecules.">Microcontact printing of DNA molecules.</a> Analytical Chemistry. , 1641-1647 (2004).</li><li>Xia, Y., Mrksich, M., Kim, E., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+octadecylsiloxane+on+the+surface+of+silicon+dioxide+and+its+application+in+microfabrication.">Microcontact printing of octadecylsiloxane on the surface of silicon dioxide and its application in microfabrication.</a> J. Am. Chem. Soc. , 9576-9577 (1995).</li><li>Mrksich, M., Dike, L., Tien, J., Ingber, D., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver.">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental Cell Research. , 305-313 (1997).</li><li>Prime, K. L., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+proteins+onto+surfaces+containing+end-attached+oligo(ethylene+oxide)+-+a+model+system+using+self-assembled+monolayers.">Adsorption of proteins onto surfaces containing end-attached oligo(ethylene oxide) - a model system using self-assembled monolayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 115, 10714-10721 (1993).</li><li>Raghavan, S., Desai, R., Kwon, Y., Mrksich, M., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+Dynamically+Adhesive+Substrates+for+Cell+Migration.">Micropatterned Dynamically Adhesive Substrates for Cell Migration.</a> Langmuir. , 17733-17738 (2010).</li><li>Rogers, J., Bao, Z., Baldwin, K., Dodabalapur, A., Crone, B., Raju, V. R., Kuck, V., Katz, H., Amundson, K., Ewing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-like+electronic+displays:+Large-area+rubber-stamped+plastic+sheets+of+electronics+and+microencapsulated+electrophoretic+inks.">Paper-like electronic displays: Large-area rubber-stamped plastic sheets of electronics and microencapsulated electrophoretic inks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4835-4840 (2001).</li><li>Yanker, D., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+printing+of+trichlorosilanes+on+glass+for+selective+protein+adsorption+and+cell+growth.">Direct printing of trichlorosilanes on glass for selective protein adsorption and cell growth.</a> Molecular Biosystems. 4, 502-504 (2008).</li><li>Johnson, D., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+and+reusing+patterned+self-assembled+monolayers+for+cell+culture.">Recycling and reusing patterned self-assembled monolayers for cell culture.</a> Chemical Communications. , 520-522 (2011).</li><li>Herne, T., Tarlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+DNA+probes+immobilized+on+gold+surfaces.">Characterization of DNA probes immobilized on gold surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. , 8916-8920 (1997).</li><li>Hanson, E., Schwartz, J., Nickel, B., Koch, N., Danisman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bonding+self-assembled,+compact+organophosphonate+monolayers+to+the+native+oxide+surface+of+silicon.">Bonding self-assembled, compact organophosphonate monolayers to the native oxide surface of silicon.</a> J. Am. Chem. Soc. , 16074-16080 (2003).</li><li>Johannes, M., Cole, D., Clark, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscope+based+nanofabrication+of+master+pattern+molds+for+use+in+soft+lithography.">Atomic force microscope based nanofabrication of master pattern molds for use in soft lithography.</a> Applied Physics Letters. , (2007).</li><li>Bessueille, F., Pla-Roca, M., Mills, C. A., Martinez, E., Samitier, J., Errachid, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submerged+microcontact+printing+(S&#x03BC;CP):+An+unconventional+printing+technique+of+thiols+using+high+aspect+ratio,+elastomeric+stamps.">Submerged microcontact printing (S&#x03BC;CP): An unconventional printing technique of thiols using high aspect ratio, elastomeric stamps.</a> Langmuir. , 12060-12063 (2005).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+microcontact+printing+as+a+microlithographic+technique.">Extending microcontact printing as a microlithographic technique.</a> Langmuir. , 2059-2067 (1997).</li><li>Biasco, A., Pisignano, D., Krebs, B., Pompa, P. P., Persano, L., Cingolani, R., Rinaldi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+microcontact-printed+proteins+by+atomic+force+miroscopy+molecular+sizing.">Conformation of microcontact-printed proteins by atomic force miroscopy molecular sizing.</a> Langmuir. , 5154-5158 (2005).</li><li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+proteins+for+cell+biology.">Microcontact printing of proteins for cell biology.</a> J Vis Exp. (22), e1065-e1065 (2008).</li><li>Piner, R., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Dip-pen"+nanolithography.">"Dip-pen" nanolithography.</a> Science. 283, 661-663 (1999).</li><li>Ryan, D., Parviz, B. A., Linder, V., Semetey, V., Sia, S. K., Su, J., Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+multiple+aligned+self-assembled+monolayers+using+light.">Patterning multiple aligned self-assembled monolayers using light.</a> Langmuir. , 9080-9088 (2004).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Litografik PDMS damgası yaratılması için kullanılan ana üretim sorunları çok sayıda ortaya çıkabilir. Yetersiz pozlama muğlak ve belirsiz desenler ve genişlemiş ya da eksik özelliklere karşı kaplı gofret sonuçlarının aşırı maruz kalma dirençli kaplamalı gofret sonuçları. Genel olarak, küçük özelliklere sahip ustaların photopatterning ve gelişme parametreleri geniş optimizasyonu (fotorezist üretici tarafından önerilen parametrelerin dışına) gerektirebilir büyük özelliği boyutl...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Silikon gofret </td><td> Gofret Hizmetler düşürmemek </td><td></td><td> 2 inç </td></tr><tr><td> Spin lak / sıcak plaka </td><td> Brewer Bilim </td><td> Cee 200CB Spin-Bake Sistemi </td><td></td></tr><tr><td> AZ9245 rezist </td><td> Mays Chemical Company </td><td> 105880034-1160 </td><td></td></tr><tr><td> Direct-yazma fotolitografi sistemi </td><td> Microtech srl </td><td> LW325 LaserWriter Sistemi </td><td></td></tr><tr><td> Maske Aligner </td><td> HTG </td><td> 3 saat </td><td></td></tr><tr><td> AZ 400K Geliştirici </td><td> Mays Chemical Company </td><td> 105880018-1160 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 182 Silikon Elastomer Kiti </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> No 25 mm. 1 yuvarlak cam lamelleri </td><td> VWR </td><td> 16004-310 </td><td></td></tr><tr><td> Plazma Oksitleyici </td><td> Diener </td><td> Femto </td><td></td></tr><tr><td> Titanyum adet Kamis </td><td> Anonim </td><td></td><td> Saf 99.95% </td></tr><tr><td> Altın pelet </td><td> Kamis Incorporated </td><td></td><td> % Saf 99.999 </td></tr><tr><td> Elektron-ışın evaporatör </td><td> Kurt J. Lesker </td><td> PVD 75 İnce Film Biriktirme Sistemi </td><td> elektron-ışın aksesuar </td></tr><tr><td> Hexadecanethiol </td><td> Alfa Aesar </td><td> A11362 </td><td></td></tr><tr><td> 1-mercaptoundec-11-il) tetra (etilenglikol) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 674508 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Pharmco-aaper </td><td> 111000200 </td><td> 200 kanıtı, mutlak </td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> VWR </td><td> 52858-000 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> VWR </td><td> 4500-434 </td><td> Kalsiyum ve magnezyum olmadan </td></tr><tr><td> Fare Laminin I </td><td> VWR </td><td> 95036-762 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan Plazma Fibronektin </td><td> Invitrogen </td><td> 33016-015 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 647 karboksilik asit, succinimidyl ester </td><td> Invitrogen </td><td> A-20006 </td><td></td></tr><tr><td> MitoTracker Kırmızı 580 </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 350 karboksilik asit, succinimidyl ester </td><td> Invitrogen </td><td> A-10.168 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-laminin antikor </td><td> Fisher Scientific </td><td> AB2034MI </td><td></td></tr></tbody></table>

creating two-dimensional patterned substrates for protein and cell confinement

Microcontact baskı doğrudan moleküllerin proteinler, 2 DNA&#39;nın, 3 ve silan, 4 benliğin oluşumu da dahil olmak üzere çok sayıda yazdırmak için istihdam edilebilir Microcontact baskı iyi tanımlanmış desenli yüzeylerin oluşturulması için hızlı, yüksek oranda tekrarlanabilir bir yöntem sağlar 1 monte altın uzun zincirli Alkan tiyoller mono tabakaları (SAMs) proteinleri ve hücreleri özel desenler içeren yapışkan ve dirençli bölgelerde sınırlandırmak için basit bir yol sağlar. Bu hapsi hücre morfolojisi kontrol etmek için kullanılan ve bir dizi protein ve hücre biyolojisi soruları incelemek için yararlı olabilir. Burada, biz hücresel çalışmalar için iyi tanımlanmış bir protein kalıplarının oluşturulması için genel bir yöntem açıklayacağız 5 Bu işlemi üç adımdan oluşur: fotolitografi kullanarak desenli ana üretim, bir PDMS damgası oluşturma ve microcontact baskı altın kaplamalı substrat. Bir kez desenli, bu hücre kültürü substratlar hapsetmesi proteinleri ve / veya desen hücreleri (birincil hücreler veya hücre hatları) yeteneğine sahiptir. Kendinden montajlı tek tabaka kimya protein / hücre desenli yapışkanlı bölgeler ve yapışkan olmayan bölgeler üzerinde tam kontrol sağlar; doğrudan protein damgalama kullanılarak elde edilemez. Hexadecanethiol, microcontact baskı adımda kullanılan uzun zincirli Alkan tiyol, kolayca çözüm protein adsorbe hidrofobik bir yüzey oluşturur. Yüzey baskılı olmayan bölgelerde asfaltlanması için kullanılan glikol-sonlandırılır tiyol, protein adsorpsiyonu dayanıklı ve büyüme bu nedenle hücre bir tek tabaka oluşturur. 6 tiyol Bu monomerler tam destek substrat bölgeleri tanımlamak oldukça yapılandırılmış mono tabakaları üretmek protein adsorpsiyon ve hücre büyümesi. Sonuç olarak, bu yüzeylerin oluşturulması mikroelektronik hücrelerarası davranış 7 çalışmanın geniş bir uygulama yelpazesi için yararlıdır. 8 Tek tabaka kimya diğer türleri trichlorosilanes kullanarak doğrudan cam yüzeylerde desenleri oluşturmak için grup çalışmaları da dahil olmak üzere hücre kültürü çalışmaları için kullanılmış olmasına rağmen, altın Alkan tiyoller oluşan 9 desenli mono tabakaları hazırlamak için düz ileri. Ayrıca, tek tabaka hazırlanması için kullanılan monomerlerin ticari, kullanılabilir istikrarlı ve inert atmosfer altında depolama veya işleme gerek yoktur. Alkan tiyoller hazırlanan Desenli substratlar da hücre hapsi korumak, birkaç kez geri dönüşümlü ve yeniden olabilir. 10

Watch this Scientific Journal Video about Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement at JoVE.com

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Uzun zincirli altın Alkan tiyoller oluşan Kendinden monte mono tabakaları (SAMs), protein desen ve hücre hapsi oluşumu için iyi tanımlanmış substratları sağlar. Microcontact baskı ile dolgu takip polidimetilsiloksan (PDMS) damga kullanarak hexadecanethiol glikol-sonlandırılır Alkan tiyol monomer damgalı hexadecanethiol bölgede sadece protein ve hücreler adsorbe bir desen üretir.

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

creating-two-dimensional-patterned-substrates-for-protein-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K Görüntüleme.  Washington University in St. Louis. Uzun zincirli altın Alkan tiyoller oluşan Kendinden monte mono tabakaları (SAMs), protein desen ve hücre hapsi oluşumu için iyi tanımlanmış substratları sağlar. Microcontact baskı ile dolgu takip polidimetilsiloksan (PDMS) damga kullanarak hexadecanethiol glikol-sonlandırılır Alkan tiyol monomer damgalı hexadecanethiol bölgede sadece protein ve hücreler adsorbe bir desen üretir.

Video: Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

Standart Mürekkep Püskürtmeli Yazıcı Kullanımı Geçici Hücre Zarı Gözenekler oluşturma

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

Biyomühendislik

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Photolithographically Tanımlı Parylene-C hücre Desenlendirme: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Yüzeyleri

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Tek Hücreleri ve 3D Sınırlaması Tek Embriyolar Sipariş: Yüksek İçerik Tarama için Yeni Bir Cihaz

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Bir Damlacık birleştirme sonra Floresan Kurtarma Fosfolipid Monolayer İki boyutlu Difüzyon Tedbir

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Hücre Davranış Nanotopographical Modülasyon için nano Substratları kullanma Dikiş Tekniği Genişleyen

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

Keratinosit yayılması üzerine iki ve üç boyutlu değerlendirilmesi tip ı kollajen yüzeylerde

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Doku Seviyesi Mekaniğinin Kontrol Altına Almak İçin Uyumlu Yüzeylerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kolonilerinin Geometrisinin Desenlemi

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler