Standına manyetik bir ayırıcı takarak başlayın. Manyetik ayırıcıya bir seçim sütunu bağlayın ve seçim sütununun üstüne 70 mikronluk bir hücre süzgeci yerleştirin. Akışı toplamak için seçim sütununun altına 50 mililitrelik bir tüp yerleştirin.
Fare beyin hücreleri% 80 birleşmeye ulaştığında, ortamı aspire edin ve hücreleri PBS ile durulayın. Yapışma hücrelerini ayırmak için% 0.25 tripsin ekleyin ve 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Ardından bir durdurma arabelleği ekleyin.
Hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Antikor boyama için, 100 mikrolitre PBS'de 10 ila yedi hücreyi yeniden süspanse edin. Ardından 10 mikrolitre LYVE-1 antikor solüsyonu ekleyin ve iyice karıştırın.
Karışımı karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Daha sonra bir mililitre PBS ekleyerek ve beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyerek hücreleri durulayın.
Mikroboncuk etiketleme için, peleti 100 mikrolitre PBS ve 20 mikrolitre mikro boncukta yeniden süspanse edin. Şişirin ve karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Ardından süspansiyonu santrifüjleyin ve peleti bir mililitre PBS ile yıkayın.
Yine, manyetik negatif dışlama için peleti dört mililitre PBS'de santrifüjleyin ve yeniden süspanse edin. Topakları ortadan kaldırmak için hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir süzgeçten geçirin. Seçim sütununu üç mililitre PBS ile durulayarak hazırlayın.
Ardından seçim sütununa hücre süspansiyonu ekleyin. Kolonu üç mililitre PBS ile yıkayın ve LYVE-1 negatif hücrelerini 50 mililitrelik bir tüpe toplayın. Manyetik pozitif seçim için, seçim sütununa altı mililitre PBS pipetleyin.
Ardından, LYVE-1 pozitif LLEC'ler elde etmek için pistonu seçim sütununa sıkıca iterek manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri yıkayın. Ardından, pozitif hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Santimetre kare başına 10 ila beşinci hücreyi, beş mililitre kültür ortamı içeren bir T25 şişesine yerleştirin.
Her alternatif günde bir ortamın %50'sini değiştirerek kültürü koruyun. Hücreler %80 birleşmeye ulaştığında, hücre geçişini gerçekleştirmeden önce daha önce gösterildiği gibi bunları ayırın. Akış sitometri analizi, ikinci pasajdaki LYVE-1 pozitif hücrelerin yüzdesinin, MACS'den sonraki üçüncü pasajdan önemli ölçüde farklı olmadığını ortaya koydu, bu da %95'ten daha yüksek bir saflığa işaret ettiİmmünofloresan boyama, LYVE-1'in PDPN, VEGFR-3 ve PROX1 ile birlikte boyanmasını doğruladı ve LLEC'lerin kimliğini oluşturdu.
LYVE-1 pozitif hücreler, LLEC'leri makrofajlardan ve fibroblastlardan etkili bir şekilde ayıran F48 ve trombosit kaynaklı büyüme faktörü beta eksprese etmedi. MACS'den önce leptomeningeal hücreler, yuvarlak kürelerden kaynaşmış lif şekillerine kadar değişen heterojen morfoloji sergiledi. Bununla birlikte, MACS sonrası, LLEC'ler, iğ ve parke taşı şekilleri gibi tipik endotel benzeri özellikler sergiledi.
