Yazarlar Baker Vakfı ve Zerina Lokmic desteğiyle Kraliyet Çocuk Vakfı &#39;Bilim Kardeşlik Kadınları&#39; kabul etmek istiyorum. Andrew G. Elefanty ve Edouard G. Stanley NHMRC Kıdemli Araştırma Fellows vardır. Onların laboratuarlarında çalışmak NHMRC ve Kök Hücre Avustralya tarafından desteklenmiştir.

Etik bildirimi: lenfatik malformasyon ve üstderi dokuların toplanması için etik onay Kraliyet Çocuk Hastanesi, Melbourne, Avustralya İnsan Araştırmaları Etik Kurullarının alındı. İmzalı rıza ameliyat öncesinde hastanın ebeveynleri alındı. Doku örnekleri seçmeli sünnet geçiren klinik yönetiminin bir parçası olarak cerrahi girişim geçiren İcracı ve hastaların tanısı olan hastalarda toplandı. Tüm deneyler Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Avustralya esaslara uygun olarak yapıldı. Sünnet derisinin ve Lenfatik Malformasyon Dokular Hücre Süspansiyon 1. Hazırlık <ol><li> Tamponlar ve Medya hazırlanması. <ol><li> EGM-2 medya ısınma ve yavaşça 37 ° C su banyosunda kit bileşenlerini çözülme piyasada mevcut EGM-2 MV Bullet Kit kullanarak tam endotel hücre ortamı hazırlayın. Sınıf II biyogüvenlik kabini içinde, aseptikEGM-2 medya her bileşeni ekleyin. Tüm bileşenler ortama ilave edilir, &#39;tam endotel hücre medya&#39; olarak medyaya bakın. Kullanımdan önce muhtevanın karıştırılması için steril 50 ml pipet kullanın. Not: hücre kültüründe ilgili tüm adımlar bir sınıf II biyolojik tehlike kabini içinde gerçekleştirilir. Bütün çözeltiler, üreticinin talimatlarına uygun olarak 4 ° C&#39;de muhafaza edilir ve kullanımdan önce, oda sıcaklığına kadar ısıtılır. Tam endotel hücre ortamı, hücre kültürü tampon ve enzim çözeltiler kullanımdan önce 20 dakika boyunca 37 ° C&#39;de ısıtılır. </li><li> 50 ng / ml VEGF-C ile birlikte endotel hücre ortamı Supplement. Kullanılana kadar 4 ° C &#39;de 50 ml steril tüp ve deposuna ilave endotelyal hücre ortamı kısım. 4 ° C&#39;de depolanan ortam, en az 4 hafta süreyle stabildir. </li><li> 8,752 g NaCl, 1.416 gr Na 2 HPO çözülmesiyle kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) Hazırlama 4 .2H 2 O veSu 1000 ml 0.395 gr KH 2 PO 4. 7.4&#39;e pH ayarlayın. Filtre 4 ° C&#39;de 0.22 mikron filtre ve mağaza kullanarak PBS sterilize edin. (: 100 1 kullanılan) antibiyotik / antimikotik solüsyon ilave Kullanımdan önce. </li><li> Insan fibronektin hazırlanması steril su, 10 ml fibronektin, 1 mg eritin. Mağaza -20 ° C&#39;de 100 ul hacimde çözüm yeniden. Kullanım gün fibronektin kısım 100 ul steril PBS 10 ml üzerinde (10 ug / ml&#39;lik bir son çalışma konsantrasyonu vermek üzere). </li><li> Enzim ortam için, steril PBS içinde% 0.04 Dispase II,% 0.25 kollajenaz II ve 0.01% DNase I içeren bir solüsyon hazırlanır. İlk olarak, steril bir 50 ml tüp içinde dispaz ve kolajenaz, yer ağırlığı PBS gerekli hacmi ilave edin ve eritmek için, 37 ° C&#39;de çalkalama ile 30 dakika boyunca inkübe edin. Bir kez biyogüvenlik kaput filtre sterilize (0.22 mikron filtre) dispase / kollajenaz çözümü, çözünmüş. Aseptik olarak 37 ° C &#39;de, DNase I depola kadar enzimatik çözeltisini ekleyinkullanın. NOT: DNase I steril iyofilleştirilmiş toz halinde temin edilebilen bir ticari bir hücre kültürü dereceli reaktifidir. </li></ol></li></ol> Üstderi ve Lenfatik malformasyonlarından hücre süspansiyonu 2. Hazırlık <ol><li> DMEM /% 2 antibiyotik antimikotik çözelti 10 ml içeren 50 ml&#39;lik bir tüp tartılır. Bu tüp, doku toplanması için kullanılır. </li><li> Lenfatik malformasyon ve üstderi dokuların cerrahi olarak çıkarılması ardından, aseptik hücre kültürü laboratuvarında buz üzerinde tüp ve transfer doku örneği ekleyin. </li><li> Doku içeren tüp tartılır ve doku ağırlığı hesaplayın. Doku sindirmek için gerekli enzimatik solüsyon hacmini hesaplamak için bu ağırlık kullanın. </li><li> Sınıf II biyogüvenlik kabini, 100 mm doku kültürü kabına doku ve medya aktarmak için steril forseps kullanabilir. Ince ~ 1 mm 3 parçaya doku kıyma steril makas kullanın. </li><li> Aktarım kıyılmış doku medya i ile karıştırılırSteril, DMEM /% 2 antibiyotik antimikotik solüsyon ek bir 10 ml içeren 50 ml&#39;lik bir tüp nGoogle&#39;a. Doku yeniden askıya tersine çevirerek karıştırın. 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de örnek santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı. Doku ağırlığı üzerine dayalı olarak, önceden ısıtılmış (37 ° C), kolajenaz II kıyılmış 100 mg doku başına düşen / DNase I / II sindirimi Dispase çözeltisi 1 ml. Genel olarak, kıyılmış dokusunun yaklaşık 1 g enzim çözeltisinin 10 ml kullanımı. </li><li> Sabit 200 rpm&#39;de çalkalayarak 20-90 dakika boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde doku inkübe edin. Bu sürenin sonunda, neredeyse tüm doku ince parçalara sindirilir emin olun. Not: birincil dokular etkiler, hücre hayatta kalması ile ilgili izolasyon zamanda kolajenaz ve dispase hücrelerin maruz kalma. Biz fibrotik lenfatik malformasyon örnekleri sindirim 60-90 dk gerektirebilir oysa çoğu yenidoğan sünnet derisi örnekleri optimal sindirim 20-30 dk gerektiren deneysel bulduk. LM LEC verims Mevcut fibrozis miktarı etkilenir, daha fibröz doku muhtemelen kolajenaz II ve dispase II uzun süre maruz kalmanın zararlı etkilerine daha az hücre elde edilmiştir. </li><li> Sindirme işlemini takiben, biyo-güvenlik kabinine tüp transferi ve steril bir 50 ml tüp içine yerleştirilmiş, bir 70 mikron süzgecinden Sindirilmiş doku çözeltisi geçmektedir. Hücre dışı matriks sadece küçük izleri gözlenmektedir kadar lastik piston ile 3 ml şırınga pistonu kullanarak, kalan doku eziyet. </li><li> Elekten geçirilmesi ve enzimleri inaktive yapışmış hücreler geri enzim orta ayrışan hacmine endotel hücre ortamı eşdeğer bir hacmi ile hücre süzgecinden yıkayın. Örneğin, kıyılmış doku sindirmek için enzim orta ayrışan 2 ml için, enzimleri inaktive endotel hücre orta 2 ml ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücre çözümü Santrifüj ve süpernatant aspire. R&gt; 10 ml PBS hücreler, e-askıya. 300 xg&#39;de Santrifüj hücreleri5 dakika boyunca, daha sonra iki kez hücre yıkama tekrarlayın süpernatant kaldırmak. &gt; Endotel hücre ortamının 20 ml hücre pelletini. Tripan mavisi daha sonra, tohum ile hücre sayımı, 2 x 10&gt; 150 cm 6 hücre&gt; 2 şişeye endotel hücre ortamının 20 ml lik bir nihai hacim içinde, fibronektin ile önceden kaplanmış. Nemlendirilmiş kuluçka makinesi içinde% 5 CO&gt; 2 37 ° C &#39;de kültür.&gt; Not: Bu, tripan mavisi eksklüzyonu ile tahmin edildiği üzere çekirdekli hücrelerin% 75 -90% Doku sindirimi hayatta beklenmektedir. Başlangıç ​​hücre sayısı, hücre süspansiyonu içinde tüm çekirdekli hücreleri (yani keratinositler, lökositlerin, makrofajların, bağ dokusu hücreleri ve kan daman hücrelerinin) yansıtır. 5-7 gün hücre sayımı, ekli atlattı ve hücre kültürü sırasında çoğaldı hücreleri yansıtır. Fibronektin ile doku kültürü şişeleri Kaplama ayrıca müteakip LEC ve LM LEC sağkalım geliştirir. </li><li> Gece boyunca inkübasyondan sonra, P ile üç yıkamadan uzak bağlanmamış hücreleri yıkamakBS /% 1 antibiyotik-antimikotik çözelti ve taze endotel hücre ortamı ilave edin. Etkin bir şişede bulunan bağlanmamış hücreleri ve kırmızı kan hücreleri çıkarmak için üç yıkar yürütmek. Her ikinci gün medya değiştirin. Hücreler 5-7 gün sonra ~% 80 konfluent olacaktır. </li></ol> Akım Sitometrisi için Lenfatik Endotel Hücre Yüzey markerleri Hücreleri 3. Antikor Boyama <ol><li> Hücreler PBS ile% 80 izdiham, aspire orta ve durulama hücrelerini ulaşmıştır sonra. </li><li> Örneğin 150 cm, 37 ° C&#39;de 5-7 dakika boyunca 2 şişesi başına Accutase hücre ayrılma çözeltisi 7 ml ile inkübe edilmesi ile yapışmayan hücreler ayırın. </li><li> Hasat Ayrılan hücreler, endotelyal hücre ortamının 3 hacim ilave edilerek hücre kopması çözeltisi inaktive ve yeni bir steril tüpe hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Süpernatant aspire ve PBS 5 ml hücreleri yeniden askıya. 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de Santrifüj hücreleri, s kaldırmakupernatant daha sonra hücre yıkama tekrarlayın. PBS 5 ml hücrelerin yeniden askıya. </li><li> Canlı hücre sayısını. % 0.4 tripan mavisi 90 ul hücre süspansiyonu, 10 ul karıştırın. Bu süspansiyonun Transferi 10 ul sayım için hemasitometre. NOT: Nihai hücre verimi işlenmiş örneklem büyüklüğü bağlıdır. canlı hücreler 7 x 10 5-1,2 x 10 6 150 cm2 şişeye aralıkları her zamanki hücre verimi. </li><li> Hücre boyama antikor çözeltileri hazırlanır. Not: Aşağıdaki seyreltmeler 100 ul&#39;lik bir boyama hacminde 1 x 10 6 lekeleme için titre edildi. <ol><li> Seyreltik PE konjuge fare anti insan VEGFR-3 (01:50); PE-Cy7 konjüge fare anti insan konjuge CD34 (1: 200); APC-konjuge fare anti-insan CD31 (1: 100) ve Alexa 488-konjüge sıçan anti insan podoplanin (1: 200), 100 ul, doku numune başına steril% 5 FBS / PBS solüsyonu, toplam hacim içinde. Hazırlanması aşağıdakıAntikor çözeltisi, kullanılana kadar buz üzerinde tutun. Aynı şekilde kapılar akış sitometrisi ayarını kolaylaştıracak seyreltilmiş izotip kontrol antikor karışımı hazırlandı. </li></ol></li><li> Antikorların bağlanma, spesifik olmayan azaltmak için, santrifüj hücreler 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de, yüzer madde daha sonra steril bir% 5 FBS / numune başına PBS çözeltisi lekeli 100 ul hücrelerin süspansiyonu çıkarın. 4 ° C&#39;de 20 dakika süreyle buz üzerinde inkübe hücreleri. </li><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de Santrifüj hücreleri, konjuge antikor kokteyli hücreleri askıya sonra yeniden süpernatant kaldırmak. Ayrıca 100 ul izotip kontrol antikor karışımı hücreleri (1 x 10 5) daha küçük bir kısım leke. 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe hücreleri. </li><li> , Bağlanmamış antikor kaldırmak 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de FBS / PBS çözüme ve Santrifüj hücreleri% 2 2 ml ekleyin. Süpernatantı aspire ve yıkama tekrarlayın. </li><li> Izotip kontrolü ve antikor lekeli örnek hücre pelletini / ml propidyum io 0.5 mg 300 ul sıralanacakdide /% 2 FBS / PBS solüsyonu. Sıralama kadar buz üzerinde tüpler yerleştirin. </li></ol> 4. Hücre Ayırma <ol><li> Cihazı kurmak için aşağıdaki malzemeleri kullanın; örneğin Accudrop flüoresan boncuklar gibi ticari olarak temin edilebilen, floresan parçacıkların, fosfat-tamponlu tuzlu su bazlı kılıf sıvısı ve bırakma geciktirme boncuklar gibi hizalama boncuklar. </li><li> Çok parametreli floresans ile aktive edilen hücre tasnif cihazı üzerinde saflaştırılmış insan LECS izole edin. Cihazı Kurma ve üreticinin önerilerine göre hizalayın. Buna ek olarak, tazminat matris oluşturmak için her tür tek leke tazminat kontrolleri çalıştırmak ve böylece bu tür PE-Cy kanal içine PE olarak fluorochromes emisyon yoluyla önemli kanama ortadan kaldırmak için. NOT: 100 mikron nozul kullanılır ve hücreler endotel hücre ortama sıralanır eğer hücreler sıralanmış FACS daha yüksek bir oranda izolasyon hayatta. </li></ol> 5. Hücre Kültürü Mesaj FACS sıralaing <ol><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de sıralama, santrifüj hücreleri ardından. Süpernatantı aspire ve (hücrenin tohum için kullanılan balonun bağlı olarak) medya 5-10 ml hücreleri tekrar süspansiyon. En az 50.000 hücre kriteri ise, hücreler fibronektin kaplı 25 cm2 şişeye kültürlenmiştir. </li><li> Aksi takdirde, kültür% 5 CO2, hava ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de 75 cm2 fibronektin kaplı şişede hücreleri. 2 gün sonra ortam değiştirin. NOT: Ortam değişiklikleri arasındaki süreyi uzatmak olmayan endotel hücrelerinin hayatta lehine görünüyor çünkü Hücre ortamı her ikinci gün değiştirilir. Hücreler daha fazla genişleme 15 ilk bölünmüş zaman PROX-1, VEGFR-3, podoplanin, CD34 ve CD31: Biz belirteçlerin immünohistokimyasal algılama kullanarak lenfatik endotel hücre fenotipi doğrulamak. </li></ol>

<ol>
	<li>Baluk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+specialized+junctions+between+endothelial+cells+of+lymphatic+vessels.">Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels.</a> J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).</li><li>Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+button-like+junctions+in+the+endothelium+of+airway+lymphatics+in+development+and+inflammation.">Plasticity of button-like junctions in the endothelium of airway lymphatics in development and inflammation.</a> Am J Pathol. 180 (6), 2561-2575 (2012).</li><li>Zawieja, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+physiology+of+lymphatics.">Contractile physiology of lymphatics.</a> Lymphat Res Biol. 7 (2), 87-96 (2009).</li><li>Witte, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+function+relationships+in+the+lymphatic+system+and+implications+for+cancer+biology.">Structure function relationships in the lymphatic system and implications for cancer biology.</a> Cancer Metastasis Rev. 25 (2), 159-184 (2006).</li><li>Andrade, M., Jacomo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+human+lymphatic+system.">Anatomy of the human lymphatic system.</a> Cancer Treat Res. 135, 55-77 (2007).</li><li>Kumar, V., Abbas, A. K., Aster, J. C., Ch Fausto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cotran Pathologic Basis of Disease. 43-78. 2, (2009).</li><li>Shayan, R., Achen, M. G., Stacker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+in+cancer+metastasis:+bridging+the+gaps.">Lymphatic vessels in cancer metastasis: bridging the gaps.</a> Carcinogenesis. 27 (9), 1729-1738 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mulliken &amp; Young's Vascular Anomalies Hemangiomas and. , 1059-1076 (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mulliken &amp; Young's Vascular Anomalies Hemangiomas. 14, 562-594 (2013).</li><li>Bellini, C., Hennekam, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+disorders+of+primary+malfunctioning+of+the+lymphatic+system.">Clinical disorders of primary malfunctioning of the lymphatic system.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 187-204 (2014).</li><li>Schook, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+lymphedema:+clinical+features+and+management+in+138+pediatric+patients.">Primary lymphedema: clinical features and management in 138 pediatric patients.</a> Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2419-2431 (2011).</li><li>Brouillard, P., Boon, L., Vikkula, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+lymphatic+anomalies.">Genetics of lymphatic anomalies.</a> J Clin Invest. 124 (3), 898-904 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=for+the+Study+of+Vascular+Anomalies+(ISSVA)+classification.">for the Study of Vascular Anomalies (ISSVA) classification.</a> Available from: http://www.issva.org/classification.com. , (2014).</li><li>Croteau, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposiform+lymphangiomatosis:+a+distinct+aggressive+lymphatic+anomaly.">Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly.</a> J Pediatr. 164 (2), 383-388 (2014).</li><li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+lymphatic+malformation+endothelial+cells,+their+in+vitro+characterization+and+in+vivo+survival+in+a+mouse+xenograft+model.">Isolation of human lymphatic malformation endothelial cells, their in vitro characterization and in vivo survival in a mouse xenograft model.</a> Angiogenesis. 17 (1), 1-15 (2014).</li><li>Smith, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+malformations.">Lymphatic malformations.</a> Lymphat Res Biol. 2 (1), 25-31 (2004).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+histologic+features+and+immunohistochemical+staining+in+microcystic+and+macrocystic+lymphatic+malformations.">Similar histologic features and immunohistochemical staining in microcystic and macrocystic lymphatic malformations.</a> Lymphat Res Biol. 7 (2), 75-80 (2009).</li><li>Norgall, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+expression+of+VEGFR-3+in+lymphatic+endothelial+cells+from+lymphangiomas.">Elevated expression of VEGFR-3 in lymphatic endothelial cells from lymphangiomas.</a> BMC cancer. 7 (2), 75-80 (2007).</li><li>Garzon, M. C., Huang, J. T., Enjolras, O., Frieden, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+malformations.">Vascular malformations.</a> Part I. J Am Acad Dermatol. 56 (3), 353-370 (2007).</li><li>Osborn, A., Dickie, P., Adams, D., Dickie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 20th International workshop on Vascular Anomalies. ISSVA. , (2014).</li><li>Baluk, P., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+microscopic+imaging+of+lymphangiogenesis+and+angiogenesis.">Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis.</a> Ann N Y Acad Sci. 1131, 1-12 (2008).</li><li>Lokmic, Z., Mitchell, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+microcirculation.+Tissue+engineering.">Engineering the microcirculation. Tissue engineering.</a> Part B, Reviews. 14 (1), 87-103 (2008).</li><li>Lokmic, Z., Mitchell, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+and+stereological+assessment+of+blood+and+lymphatic+vessels.">Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels.</a> Histol Histopathol. 26 (6), 781-796 (2011).</li><li>Hagerling, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multistep+mechanism+for+initial+lymphangiogenesis+in+mouse+embryos+based+on+ultramicroscopy.">A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy.</a> EMBO J. 32 (5), 629-644 (2013).</li><li>Pollmann, C., Hagerling, R., Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+lymphatic+vessel+development,+growth,+and+function.">Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 167-186 (2014).</li><li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries:+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium.">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).</li><li>Kaipainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+fms-like+tyrosine+kinase+4+gene+becomes+restricted+to+lymphatic+endothelium+during+development.">Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3566-3570 (1995).</li><li>Schacht, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T1alpha/podoplanin+deficiency+disrupts+normal+lymphatic+vasculature+formation+and+causes+lymphedema.">T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema.</a> EMBO J. 22 (14), 3546-3556 (2003).</li><li>Kriehuber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+dermal+lymphatic+and+blood+endothelial+cells+reveal+stable+and+functionally+specialized+cell+lineages.">Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages.</a> J Exp Med. 194 (6), 797-808 (2001).</li><li>Florez-Vargas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+D2-40+and+LYVE-1+immunostaiing+in+lymphatic+malformations.">Comparative analysis of D2-40 and LYVE-1 immunostaiing in lymphatic malformations.</a> Lymphology. 41 (3), 103-110 (2008).</li><li>Makinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDZ+interaction+site+in+ephrinB2+is+required+for+the+remodeling+of+lymphatic+vasculature.">PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature.</a> Genes Dev. 19 (3), 397-410 (2005).</li><li>Connell, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+coding+regions+of+VEGFR3+and+VEGFRC+in+Milroy+disese+and+other+primary+lymphoedemas.">Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas.</a> Hum Genet. 124 (6), 625-631 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

LECS sıvı homeostazı, yabancı antijenler ve emilim ve bazı besin taşımaya bağışıklık karşılığının muhafaza edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. LEC homeostazı, örneğin bakteriyel enfeksiyonlar ve tümör metastazı gibi hastalık süreçlerinde etkilenebilir fakat LECS etkilenen hastalar için işlevsiz lenfatik damarların oluşumu ve önemli hastalıklara yol açtığı somatik mutasyonlara gelişebilir. In vivo implantasyonu ve ex vivo deney yoluyla lenfatik malformasyon e...

Lenfatik damar sisteminin önemli bir fonksiyonu, lenf, lipidler, proteinler ve hücre bileşenleri içeren bir aşırı interstisyel sıvı emer ve kan venöz sisteme yapmaktır. Lenfatik kapilerlerin bir ağ yabancı antijenlere immün gözetim ve yabancı antijenleri nötralize etmek için beyaz kan hücrelerinin dağıtım önemli bir işlem varlığı için taranmıştır lenf düğümlerine lenf yönlendirir. tek yönlü lenfatik sistem ilk lenfatik kılcal lenf girişini 1,2 izin özelleşmiş hücre kavşaklar ince duvarlı düz endotel hücreleri süreksiz tek tabaka ile benzersiz bir yapıya sahip dokularda başlar. Bu kılcal artan interstisyel basınç 3 mevcudiyetinde damar çökmesini engellemek için filamanların ankraj ile komşu bağ dokusu matrise bağlıdır. lenfatik kılcal toplama içine boş ilk lenfatik kılcalO büyük lenfatik damarların veya damarlar içine birleşerek. Karşılaştırıldığında lenf damarları daha kalın kap duvarları, ikili lenf valfleri olan ve bir kaç düz kas hücreleri, 4 gömülü olduğu bir süreksiz bir temel zar ile kapatılmış olan toplama lenf kılcal damarlar başlangıç. Düz kas hücrelerinin koordineli açılması ve lenfatik valf kapağı ve daralma lenf 3 akışını kolaylaştırır. Torasik kanal ve sağ lenfatik kanal: İnsanlarda, vücudun çeşitli bölgelerinden lenfatik damarlar iki lenfatik kanallar oluşturacak şekilde birleştirmek lenfatik gövdelerine oluşturmak için katılın. Torasik kanal göğüs altında vücudun sol tarafında ve sağ taraftan lenf drene olurken, baş, boyun ve toraks sağ kol ve sağ taraftan sağ lenfatik kanal drene lenf. Her iki kanallar boyun 5 subklavyen damarlar içine lenf yapıyoruz. Lenfatik sistem bozuklukları geniş edinilen a halinde gruplandırılmışnd, konjenital (Tablo 1). Edinilen durumların örnekleri lenfanjit ve ikincil lenfödem vardır. Lenfanjit bakteriyel enfeksiyona lenfatik damar iltihabıdır. Etkilenen lenfatikler dilate ve eksuda içeren polimorfonükleer hücreleri ile doldurun. Deride, bu lenf sıklıkla ilişkili lenf düğümüne (lenfadenit) 6 genişlemesi ile birlikte, kırmızı, ağrılı deri altı çizgiler olarak görünür. İkincil lenfödem lenfatik damar veya lenf nodu tıkanıklığı hasar veya tıkanma sonucu olarak ortaya çıkar. Bu hasar veya tıkanma lenf distalinde birikimi kronik ilerleyici şişme yol açar. Gelişmiş ülkelerde, sekonder lenfödem en yaygın metastaz tümörlerin lenf damarlarına veya bölgesel lenf nodları engel ya da anti-kanser tedavisinin bir sonucu olarak, lenf düğümleri, radyasyon sonrası fibroz ve post-enflamatuar trombositemili cerrahi olarak çıkarılması, aşağıdaki habislik ile bağlantılı olanBosis ve skar 7. Dünyanın diğer bölgelerinde, ikincil lenfödem gibi Wuchereria bancrofti 6 olarak parazitik kurtlar neden lenfatik obstrüksiyona sekonder olabilir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="4"> Lenfatik damar sistemi bozuklukları, </td></tr><tr><td> Edinilen </td><td colspan="3"> Doğuştan </td></tr><tr><td rowspan="3"> Lenfadenit İkincil lenfödem </td><td> İlköğretim Lenfödem 10 </td><td> Sporadik Lenfatik Malformasyonlari 13 </td><td> Sendromları 13 Lenfatik malformasyonlar İlişkili </td></tr><tr><td rowspan="2"> örneğin Milroy Sendromu Meige Sendromu </td><td> Basit: Lenfatik malformasyonlar </td><td rowspan="2"> örneğin Klippel-Tranaunay Sendromu Parklar Weber Sendromu Sturge-Weber Sendromu </td></tr><tr><td> Kombine: Kılcal-lenfatik malformasyonlar Kılcal-lenfatik-venöz malformasyon Kılcal-lenfatik-arteriyovenöz malformasyon Kılcal-lenfatik venöz-arteriyovenöz malformasyon </td></tr></tbody></table> Lenfatik damar sistemi hastalıklarının Tablo 1. Genel Bakış. Lenfatik sistemin konjenital hastalıklar, genetik mutasyonlar, lenfanjiektazi ve lenfatik sistem 8,9 anomalileri neden olduğu düşünülen birincil (idiopatik) lenfödem sayılabilir. Birincil lenfödem muhtemelen de novo mutasyonlar sonucu oluşan veya miras sporadik olabilir. Lenfatik bozukluklar ayrıca izole edilmiş olabilir ya da daha genel bir sendrom 10 bir kısmını ihtiva edebilir. Lenf pediatrik popülasyonda% 97ödem bölgesel lenf drenajı 11 bozan lenfatik damar yapısında anormallikler sporadik. Milroy hastalığı doğumda belirgin ya da kısa bir süre sonra 12 VEGFR-3 genindeki mutasyon neden birincil lenfödem bir örnektir. Çoğunlukla ailesel durumda olmasına rağmen, Milroy hastalığı da Milroy hastalığının 32 aile öyküsü olmayan bebeklerde tespit edilebilir. Herhangi bir lenfödem şiddeti lenf üretimi ve venöz dolaşımı 6 lenf geri taşıma yeteneği miktarına bağlıdır. Klinik bulgular ve yerinde endotel hücre çoğalmasında dayanarak, lenfatik sistemin anomalileri lenfatik tümörler veya lenfatik malformasyon 13 olarak sınıflandırılır. Kaposiform lenfanjiomatozis bir LEC tümör 14 örneğidir. Lenfatik malformasyonlar embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan ve çocuğa 15,16 oranında büyümeye düşünülmektedir. Onlar nadiren gerileme ama remai edebilirsinizn asemptomatik travma veya enfeksiyon klinik komplikasyonlara yol açan hızlı büyüme çöker kadar. Yukarıda tarif edilen venöz dolaşıma dokudan lenfatik ağ ve lenf iletiminin düzenli yapısı lenfatik sıvı ile dolu kistik anormal yapılar lokalize koleksiyonları oluşan lenfatik malformasyon olarak tedirgin olduğunu. Bu kistik gemiler de fonksiyonel lenfatik vanaları içeren lenfatik dolaşıma bağlı veya olduğunu hiçbir klinik veya deneysel kanıtlar olsa da, onların lenfatik kimlik gibi podoplanin, CD31, Lenf Gemi Endotel Reseptör 1 olarak lenfatik hücre belirteçleri aralığının ifadesi tarafından onaylandıktan (LYVE-1), Prospero homeobox protein 1 (PROX-1) ve VEGFR-3 15,17,18. Bu kistik yapılar, ya küçük (mikrokistik) veya büyük (makrokistik) olabilir, ama en lenfatik malformasyonlar mikrokistik ve makrokistik bileşenleri (Şekil 1) 16 her ikisini de içerir. Ameliyat sonrasında, injection skleroterapi ve / veya radyofrekans lenfatik malformasyonlar genellikle yeniden ortaya çıkması ablasyona. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" width="700" /> İnsan lenfatik damarların ve lenfatik malformasyonlar Şekil 1. Morfoloji. Normal insan lenfatik (A) ve podoplanin antikor ile etiketlenmiş lenfatik malformasyon damarları (B ve C) (kahverengi etiket, ok). İnsan lenfatik malformasyon damarları belirgin dilatasyon ve lümen boyutu önemli değişim ile karakterizedir. Bu lokalize anormal kistik yapıları küçük (mikrokistik, *) (B), ya da büyük (makrokistik, #) (C) olabilir. En lenfatik malformasyonlar hem mikrokistik ve makrokistik bileşenleri içerir. <a href="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" target="_blank">rakamın büyük halini görmek için tıklayınız.</a> &lt;/ P&gt; Bazı araştırmacılar lenfatik malformasyonlar LECS anormal büyüme potansiyeli yok ama onun yerine, normal dolaşıma 19 bağlamak için başarısız olan lenfatik damar gelişimsel bozukluğu temsil ileri sürmüşlerdir. Bununla birlikte, LM LECS hızlı çoğalan ve LECS 15 LM LECS bir defekt olduğunu düşündürmektedir sünnet daha apoptoza karşı daha dirençli olduklarını bulduk. LM LECS fare ksenograft modelinde implante edilir, bunlar lenfatik malformasyon 15 hatırlatan yapılar oluştururlar. Bu lenfatik malformasyonlar, fetal gelişim sırasında LM LECS doğan bir veya daha fazla somatik mutasyonlar neden olabilir bir hipotezini desteklemektedir. Gerçekten, son raporlar fosfoinositid 3-kinaz (PIK3CA) geni 20 p110α katalitik alt birim bu tür bir mutasyon tespit ettik. DNA dizileme teknolojisinin, ilgili mutasyonlar c gelişmeler göz önüne alındığındaOuld daha kolay bu durumların gelecekteki çalışmalara rehberlik, izole LM LECS tanımlanabilir. canlı LECS izolasyonu azalmış besin durumunu veya pro-apoptotik ajanları 15 tepki olarak bu hareketi, çoğalması, tüp oluşturma yeteneği ve hayatta kalma gibi tahlillerde anormal ve normal LECS arasında karşılaştırmalar kolaylaştıracaktır. İzole LECS daha yeni LEC alt popülasyonlarını belirginleştiren, hücreye özgü gen ifadesi ve proteomik çalışmalar yapmak için bize izin ve lenfatik malformasyonlar klinik yönetimi için uygun yeni farmakolojik ajanlar keşfetmek istiyorum. Biz daha önce yenidoğan sünnet derisi ve lenfatik malformasyonlar 15 den LECS manyetik boncuk ayrılması dayalı bir LEC izolasyon yöntemi yayınladık. Bu CD31 pozitif seçime CD34 Neg hücre fraksiyonunun tabi tutarak, ardından CD34 ekspresyonunun bulunmaması, göre, vasküler endotel hücrelerinden normal ve hastalıklı LECS ayrılması için bir strateji bildirilmiştir.Bununla birlikte, bu yöntem artık olmayan endotel hücrelerinin mevcudiyeti ile engellenmiştir. Bu daha sonraki bağ dokusu sindirim öncesinde epidermise kaldırarak bağımsız oldu. Bu kirleticiler genellikle daha hızla çoğaldı ve böylece sonunda LEC izolasyon tekrarlamak sonraki girişimlerine rağmen endotel hücre kültürleri overgrew. Gerçekten de,% 5 ile% 2 kadar düşük olmayan endotel hücrelerinin bir başlangıç ​​kirlenmesi LEC nüfusu 15 bastırmak için yeterli olmuştur. Bu LEC hücre verim ve saflık geliştirmek için bir seçenek olarak floresan aktif hücre sıralama yöntemi keşfetmek için bize istenir. Buna ek olarak, CD34, CD31 Düşük Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Sıra LECS tespit etmek seçim markörleri için VEGFR-3 ve podoplanin ilave LEC popülasyonlarının özgüllüğünü geliştirmek için sıralama çok parametre kullanılmıştır. Bu belirteçler seçme gerekçesi raporlarına dayandığını LECS ve kan vasküler endotelyal ce iseKan, vasküler endotel hücrelerinin 21-23 ile karşılaştırıldığında LLS örneğin CD31 gibi ortak bir çok hücre yüzeyi işaretçileri vardır LECS CD34, podoplanin ve VEGFR-3 hücre yüzeyi marker salgılamasında fenotipik değişim gösterir. CD31 aynı zamanda trombosit endotel hücre adhezyon molekülü 1 (PECAM-1) olarak bilinen bir 130 kDa transmembran glikoproteindir. Bu kan ve lenf damarlarının 21,24,25 her türlü ifade çünkü bir pan-endotelyal hücre belirteci olarak kabul edilir. CD34 en hematopoietik progenitör hücreler üzerinde 110 kDa transmembran glikoprotein mevcut olması ve hücreler, vasküler endotel hücrelerinin ve lenf damarlarına 26 kaynaklanır. VEGFR-3, vasküler endotelyal büyüme için alıcı, C ve D faktörleri fare embriyo gelişen damarları başlangıçta mevcut olmakla birlikte, transkripsiyon düzenlenir lenf tarifnamede aşağıdaki gibidir (SOX) -18, Cı Hicken SRY ilişkili HMG-kutusu faktörleri o valbumin u pstream.p. romoter t ranscription f aktör 2 (COUPTF-II) ve PROX-1, VEGFR-3 venöz sentezleme kaybolur ve embriyonik LECS 25,27 sınırlı hale gelir. Podoplanin, 38 kDa zar mukoprotein, ilk fare embriyonik gelişim 28 yaklaşık embriyonik lenfatik damarların gün 11 (~ E11.0) üzerine kaydetti ve şiddetle mikrovasküler lenf damarları, lenf malformasyonlar makrokistik lenfatik endotele göre podoplanin ifade ile ifade edilir iken 15 daha değişkendir. Deneyler en azından bazı CD34 Yüksek CD31 Pos endotel hücreleri lenfatik işaretleyici podoplanin 29 ekspres öneririz Flow sitometri. İnsan lenfatik malformasyonlar LYVE-1 ve podoplanin boyama sistematik değerlendirme hem LYVE-1 ilk lenfatik güçlü mevcut olduğu bildirilmiştir, normal dokularda, lenfatik malformasyon endotelyumu 30 boyama etkili olduğunu göstermesine rağmenkılcal endotel ancak azaltılmış ve toplama lenfatik endotele 31 bile yok. Amacımız izole etmek olduğundan hem biz seçtiniz başlangıç ​​ve toplama lenfatik endotel hücreleri, bizim hücre seçimi stratejisinin bir parçası olarak LYVE-1 kullanmak için değil. Son olarak, bu belirteçler kullanılması kararı da mikroskopik görüntülemesi için lenf damarlarına etiketlenmesi için, teşhis amacıyla kullanılır antikorların mevcudiyeti, akış sitometrisi ve imünoflöresan çalışmalar arasındaki ilişki olanak sağlayabilecek bir özelliği dayanıyordu. Bu makale sünnet derisi ve lenfatik malformasyon gelen CD34 Düşük CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos LECS başarılı izolasyonu yanı sıra CD34 Yüksek CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos endotel hücreleri için gerekli doku sindirim yöntemi, hücre boyama ve FACS ayarlarını anlatacağız dokusu.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Used to collect tissue samples from the operating theatre.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3202</td>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-C</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2179-VC-025</td>
			<td>Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution (100x)</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td>Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell dissociation reagent</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>StemPro&#174;Accutase&#174; is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue dye</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Used as a viability stain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche Applied Biosciences</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>Used at 0.04%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Worthington Lab</td>
			<td>4176</td>
			<td>Used at 0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche Applied Biosciences</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Used at 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm nylon cell strainers</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>356204</td>
			<td>Used at 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343516</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303116,</td>
			<td>Used at 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80.</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>337006</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400112</td>
			<td>Used at 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400126</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400120</td>
			<td>Used at 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400525</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting

Primer lenfödem, lenf malformasyonlar ve lenfatik tümörler gibi lenfatik sistem bozuklukları önemli morbidite nedeni ama az onların biyoloji hakkında bilinen nadir durumlardır. Hastalıklı ve sağlıklı dokudan son derece saf insan lenfatik endotel hücreleri (LECS) Ayırma, genetik, moleküler ve hücresel düzeyde lenfatik endotel çalışmalarını kolaylaştıracaktır. Bu araştırmalar, bu durumların klinik yönetimi değişebilir yeni tedaviler için hedefler ortaya çıkarabilir tahmin edilmektedir. LECS ve lenfatik malformasyon lenfatik endotel hücreleri (LM LECS) sünnet derisi insan izolasyonunu açıklayan bir protokol sunulmuştur. Elde etmek için tek bir hücre süspansiyonu dokusu kıyılmış ve enzimatik dispase II ve kollajenaz II kullanılarak tedavi edildi. Elde edilen tek bir hücre süspansiyonu daha sonra farklılaşması (CD) belirteçleri CD34, CD31, Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü-3 (VEGFR-3) ve podoplanin kümelenmesinde antikorlar ile işaretlenmiştir. Stained canlı hücreler diğer endotelyal ve non-endotel hücrelerinden CD34 Düşük CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos LM LEC nüfusu ayırmak için bir floresan aktif hücre sıralayıcı (FACS) üzerinde sıralanır. kriteri LM LECS kültüre ve daha deneysel kullanım için fibronektin kaplı şişeler üzerinde genişletti.

Başlangıç ​​Doku sindirimi takiben, bölünmemiş örneklerin kültür 24 saat sonra, ayrı bir endotel hücre kolonileri bir araya fibroblast benzeri hücreler ve yumuşak kas hücreleri (Şekil 2A) gözlenebilir. Izlenerek ayırma ve hücre kültüründe 24 saat sonra CD34 Düşük CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Sıra hücreleri ekleyin ve tipik arnavut morfolojisi (Şekil 2B ve C) göstermektedir. Yukarıda tarif ed...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting at JoVE.com

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Bu protokolün amacı floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS) kullanılarak insan lenfatik malformasyon kiste benzer damarları ve derisini astar lenfatik endotel hücreleri izole etmektir. Daha sonra hücre kültürü ve bu hücrelerin genişlemesi, genetik proteomik, işlevsel ve hücre farklılaşması çalışmaları için deney sofistike yeni bir düzeyde izin verir.

Çoklu-parametre floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma İnsan lenfatik endotel hücreleri İzolasyonu

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

isolation-human-lymphatic-endothelial-cells-multi-parameter

Research

JoVE Journal

Medicine

14.2K Görüntüleme.  The Royal Children&#146;s Hospital.  Bu protokolün amacı floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS) kullanılarak insan lenfatik malformasyon kiste benzer damarları ve derisini astar lenfatik endotel hücreleri izole etmektir. Daha sonra hücre kültürü ve bu hücrelerin genişlemesi, genetik proteomik, işlevsel ve hücre farklılaşması çalışmaları için deney sofistike yeni bir düzeyde izin verir. 

Video: Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

This article describes an in vitro technique for monitoring cancer cells invading through a monolayer of endothelial cells. The data is acquired in real-time as a function of changes in impedance on the surface of electrodes at the well bottom.

Kanser Hücreleri Endotel Hücre Tek tabakalı Invasion Tedbir Gerçek zamanlı Elektrik Empedans Tabanlı Tekniği

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Tıp

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

Anormal Mitoz ile İlişkili Hücre Ölümü Canlı Kanser Hücreleri Konfokal Görüntüleme Uyacakları

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

İnsan Fetal Pankreas Hücre Kümeleri İzolasyon, Kültür ve Görüntüleme

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Tümör spesifik Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü Genişleme

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Köpek arter ve venlerin Primer Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. The origin, classification and characterization of EPCs are complex; notwithstanding, two prominent sub-types of EPCs have been established: so-called &#34;early&#34; EPCs (subsequently referred to as early-EPCs) and late-outgrowth EPCs (late-EPCs). They can be classified by biological properties as well as by their appearance during in vitro culture. While &#34;early&#34; EPCs appear in less than a week after culture of peripheral blood-derived mononuclear cells in EC-specific media, late-outgrowth EPCs can be found after 2-3 weeks. Late-outgrowth EPCs have been recognized to be directly involved in neovascularization, mainly through their ability to differentiate into mature endothelial cells, whereas &#34;early&#34; EPCs express various angiogenic factors as endogenous cargo to promote angiogenesis in a paracrine manner. During myocardial ischemia/reperfusion (I/R), various factors control the homing of EPCs to regions of blood vessel formation.
Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a chemokine-like pro-inflammatory and ubiquitously expressed cytokine and was recently described to function as key regulator of EPCs migration at physiological concentrations1. Interestingly, MIF is stored in intracellular pools and can rapidly be released into the blood stream after several stimuli (e.g. myocardial infarction). 
This protocol describes a method for the reliable isolation and culture of early-EPCs from adult human peripheral blood based on CD34-positive selection with subsequent culture in medium containing endothelial growth factors on fibronectin-coated plates for use in in vitro migration assays against serum samples of cardiac surgical patients. Furthermore, the migratory influence of MIF on chemotaxis of EPCs compared to other well-known angiogenesis-stimulating cytokines is demonstrated.

Endothelial progenitor cells (EPCs) are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. This method describes the isolation of human EPCs from peripheral blood, as well as the identification of their migratory potential against serum samples of cardiac surgical patients.

Kalp Damar Cerrahisi sonra serum Örnekleri etkilenerek Sağlıklı Gönüllüler ve Bunların Göçmen Potansiyelden Endotel Ata Hücreleri İzolasyon

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

Hazırlık ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mıknatıslanmış karakterizasyonu Endotel Hücreleri miR-modifiye

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

Endothelial cells (ECs) are crucial for vascular and whole-body function through their dynamic response to environmental cues. Elucidating the transcriptome and epigenome of ECs is paramount to understanding their roles in development, health, and disease, but is limited in the availability of isolated primary cells. Recent technologies have enabled the high-throughput profiling of EC transcriptome and epigenome, leading to the identification of previously unknown EC cell subpopulations and developmental trajectories. While EC cultures are a useful tool in the exploration of EC function and dysfunction, the culture conditions and multiple passages can introduce external variables that alter the properties of native EC, including morphology, epigenetic state, and gene expression program. To overcome this limitation, the present paper demonstrates a method of isolating human primary ECs from donor mesenteric arteries aiming to capture their native state. ECs in the intimal layer are dissociated mechanically and biochemically with the use of particular enzymes. The resultant cells can be directly used for bulk RNA or single-cell RNA-sequencing or plated for culture. In addition, a workflow is described for the preparation of human arterial tissue for spatial transcriptomics, specifically for a commercially available platform, although this method is also suitable for other spatial transcriptome profiling techniques. This methodology can be applied to different vessels collected from a variety of donors in health or disease states to gain insights into EC transcriptional and epigenetic regulation, a pivotal aspect of endothelial cell biology.

The protocol describes the isolation, culture, and profiling of endothelial cells from human mesenteric artery. Additionally, a method is provided to prepare human artery for spatial transcriptomics. Proteomics, transcriptomics, and functional assays can be performed on isolated cells. This protocol can be repurposed for any medium- or large-size artery.