Başlamak için, her iğneyi beş mikrolitre Alexa Fluor etiketli GFP nanobody solüsyonu ile doldurun. Bir cam slayt yüzeyine 25 x 25 milimetrelik bir lamel yerleştirin. Lam üzerine 40 mikrolitre Halokarbon yağı pipetleyin ve lamel çevresi boyunca yayın.
Enjeksiyon mikroskobu altında, iğnenin ucunu lamelin yağa batırılmış kenarına yerleştirin. PicoPump'ın enjeksiyon havası basıncını buna göre ayarlayın. Boş cam slaytı hazırlanan Drosophila embriyo slaytı ile değiştirin.
Enjeksiyon iğnesi ucunu embriyonun ön-arka eksenine dik olarak ayarlayın. Uç yumurta sarısının merkezine ulaşana kadar embriyoları iğneye doğru yönlendirmek için XY aşaması manipülatörünü kullanın ve antikorları yumurta sarısına aşılamak için iki ila üç kez pompalayın. XY evre manipülatörü ile enjeksiyon sonrası embriyoları iğneden uzaklaştırın ve bir sonraki embriyoya geçin.
İstenilen gelişim aşamasına ulaşana kadar embriyoların 25 santigrat derecede inkübe etmesine izin verin. İnkübasyondan sonra, embriyoları parlak alan aydınlatmalı düşük güçlü bir lens altında tanımlayın ve yüksek çözünürlüklü floresan canlı görüntüleme için 40X veya 63X lense geçin. Enjeksiyon sonrası, çentik reseptörünün sinyal-gürültü oranı, immünofloresanın sinyal kalitesiyle karşılaştırılabilir şekilde önemli ölçüde iyileşir.
Ayrıca, antikor enjeksiyonu, beş dakikalık bir görüntüleme penceresi boyunca belirgin bir sinyal yoğunluğu kaybı olmaksızın 45 saniyelik aralıklarla çentik lokalizasyonunun zamansal karakterizasyonuna izin verdi. Embriyonik fosfotirozinin canlı görüntülenmesi, tirozin fosforilasyonunun üç hücreli kavşaklarda oldukça zenginleştirilmiş olduğunu gösterdi. Ek olarak, apikal membranın merkezinin altında yeni bir ikinci fosfotirozin sinyali popülasyonu gözlendi.
Çift renkli görüntüleme, bu fosfotirozin sinyal popülasyonunun medial miyozine yakın olduğunu ortaya koydu. Ek olarak, fosfotirozinin medial popülasyonu, medial miyozin için gösterildiği gibi benzer pulsatil birleşme ve dağılma paternleri sergiledi.
