Dr. Jennifer A. Zallen'e Sqh-GFP Drosophila serisini sağladığı ve bu tekniğin ilk gelişimine destek verdiği için ve Dr. Francois Schweisguth'a Notch-GFP Drosophila serisini sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (32270809) H.H.Yu'ya, Yaşam Bilimleri Okulu, SUSTech'ten cömert mali ve personel desteği ve Shenzhen Bilim ve Teknoloji İnovasyon Komisyonu/JCYJ20200109140201722'dan Y. Yan'a sağlanan finansmanla desteklenmiştir.

Deneyler, SUSTech Üniversitesi Yaşam Bilimleri Okulu'nun yönergelerine ve onayına uygun olarak gerçekleştirildi. Kullanılan organizma Drosophila melanogaster'dir ve genotipler, sırasıyla Dr. Francois Schweisguth (Pasteur Enstitüsü) ve Dr. Jennifer Zallen (Sloan Kettering Enstitüsü) laboratuvarları tarafından cömertçe sağlanan Notch-Knockin-GFP (Kromozom X) ve Sqh-sqh-GFP'dir (Kromozom II). Bu protokol esas olarak antikor etiketleme ve canlı görüntüleme yönlerine odaklanırken, Drosophila embriyo toplama ve enjeksiyonu15,16 hakkında daha ayrıntılı açıklamalar için lütfen yayınlanmış raporlara bakın.
1. Antikorların floresan etiketlenmesi
<ol><li>Tercihen, ilgilenilen protein için monoklonal antikorlar veya nanokorlar kullanın. Antikorların stok konsantrasyonunu 1 mg / mL veya daha yüksek bir sıcaklıkta hazırlayın. NOT: Bu çalışmada örnek olarak GFP nanobody (bkz. Malzeme Tablosu) kullanılmıştır. Ticari olarak temin edilebilen GFP nano gövdesi, 1.0 mg / mL'lik bir konsantrasyonda ve 250 μL'lik bir hacimde paketlenir. Ek olarak, Alexa Fluor 594'ü bir süksinimidil ester reaksiyonu11 yoluyla proteinlerin birincil aminlerine konjuge eden, ticari olarak temin edilebilen bir antikor etiketleme kiti (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılır. Daha da önemlisi, bu etiketleme işlemi antikor konsantrasyonunu önemli ölçüde değiştirmez.</li>
	<li>Bileşen B'yi (antikor etiketleme kitinde sağlanır) 1 mL deiyonize su içinde yeniden süspanse ederek 1 M sodyum bikarbonat çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Antikor konsantrasyonunu 1.0 mg / mL'ye ayarlayın, ardından 1 M sodyum bikarbonat çözeltisinin 1/10'uncu hacmini (100 μL GFP nanobody için 10 μL) ekleyin.</li>
	<li>110 μL antikor karışımını (adım 1.3'ten itibaren) doğrudan Alexa Fluor 594 boyası içeren tüpe ekleyin. Karıştırmak için ters çevirin (girdap yapmayın) ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edin.</li>
	<li>Saflaştırma kolonunu konjugasyon kitinden monte edin (Malzeme Tablosuna bakın). 1.5 mL'lik bir reçine yatağı hazırlayın (antikor etiketleme kitinde sağlanır) ve reçineden fazla sıvıyı çıkarmak için kolonu oda sıcaklığında (RT) 3 dakika boyunca 1100 x g'de santrifüjleyin.</li>
	<li>Reaksiyon karışımını (adım 1.4'ten itibaren) reçine kolonunun üstüne damla damla ekleyin ve etiketli antikoru toplamak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1100 x g'de santrifüjleyin. Toplanan antikor pembe renkte görünmeli ve hacim 100 μL'den biraz daha az olmalıdır. Folyoya sarılı veya koyu renkli tüplerde 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. Drosophila embriyolarının hazırlanması
<ol><li>200 yeni yumurtadan çıkmış yetişkin Drosophila'yı erkek-dişi oranı 1: 10 olan plastik silindir şeklindeki bir kafese (çap = 5 cm, yükseklik = 8 cm) yerleştirin. Bir tarafı havalandırma için gözenekli metal ağ ile ve diğer tarafı meyve suyu/maya ezmesi agar plakası ile kapatın.</li>
	<li>Embriyo toplamadan önce üç gün boyunca her 12 saatte bir plakayı değiştirin. Bu, Drosophila yumurtlamasının senkronizasyonunu sağlar ve toplama verimliliğini artırır.</li>
	<li>Enjeksiyon gününde, kafesi minimum maya macunu içeren bir meyve suyu tabağına değiştirin ve embriyoları 1 saat boyunca 25 ° C'de toplayın. İlk toplama turu yeterli embriyo (<50 embriyo) vermezse, ilk plakayı atın ve 1 saat içinde 100'den fazla embriyo bırakılana kadar ikinci bir toplama turu için bu adımı tekrarlayın.</li>
	<li>Yumurtlamayı durdurmak için plakayı kafesten çıkarın ve 2-3 saatlik embriyolar elde etmek için 25 ° C'de 2 saat daha inkübe edin. Embriyoların doğru evresi, antikor enjeksiyonunun başarısı için kritik öneme sahiptir.</li>
	<li>Embriyoların yumurta kabuğunu çıkarmak için, meyve suyu tabağına 2 mL% 50 çamaşır suyu ekleyin ve bir boya fırçası kullanarak embriyoları plakadan nazikçe çıkarın (Şekil 2A-4). Genellikle, embriyolar doğrudan maya macununun üzerine serilir. Bu durumda, tüm embriyoları toplamak için maya macununu ağartma çözeltisine fırçalamak kabul edilebilir.</li>
	<li>Yüzen embriyoları %50 ağartıcıda 2 dakika inkübe edin ve yumurta kabuğu çıkarma verimliliğini artırmak için meyve suyu tabağını her 30 saniyede bir döndürün.</li>
	<li>Embriyo/ağartıcı karışımını 70 μm'lik bir naylon hücre süzgecine dökerek aktarın (Şekil 2A-7). Kalan ağartıcı ve maya macununu çıkarmak için embriyoları bir su şişesi kullanarak iyice yıkayın. Hücre süzgecini kağıt havluyla tamamen kurulayın ve embriyoların etrafındaki fazla suyun atıldığından emin olun.</li>
</ol>3. Embriyo hizalaması ve kuruma
<ol><li>5 cm x 5 cm x 0,5 cm (genişlik, uzunluk, yükseklik) %4 agaroz jel hazırlayın (Şekil 2A-9) ve jelin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Temiz bir tıraş bıçağı kullanarak 1 cm x 3 cm x 0,5 cm (genişlik, uzunluk, yükseklik) agaroz bloğu kesin ve bloğu bir cam slayt üzerine yerleştirin (Şekil 2A-2). Kenarların düz kesildiğinden ve yüzeyin düz ve kuru olduğundan emin olmak için diseksiyon kapsamının altındaki jel bloğunu inceleyin.</li>
	<li>Embriyoları süzgeçten bir boya fırçası kullanarak jel bloğuna aktarın. Embriyoları hafifçe fırçalayarak bloğun orta hattı boyunca eşit şekilde yayın. İdeal olarak, embriyo kümeleri birbirine dokunmadan tekli veya çiftli olarak ayrılır.</li>
	<li>Tek bir ince uç oluşturmak için iki bacağı birbirine sıkıca bantlanmış bir cımbız hazırlayın (Şekil 2A-5). Bir diseksiyon kapsamı altında, cımbız kullanarak tek tek embriyoları alın ve jel bloğunun uzun kenarı boyunca yerleştirin. 20-30 embriyoyu hizalayın, ön-arka eksenlerinin kenara paralel olduğundan emin olun (Şekil 2C).</li>
	<li>24 mm x 50 mm'lik bir lamellerin ortasına 10 μL heptan yapıştırıcı (Malzeme Tablosuna bakın) pipetleyin (Şekil 2A-1) ve yapıştırıcıyı bir pipet ucu kullanarak 0,5 cm x 3 cm dikdörtgen bir alana yayın. Kullanmadan önce tutkalın tamamen kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Jel bloklu cam slaytı, embriyolar dışa bakacak şekilde masanın kenarına yerleştirin. Düz uçlu bir cımbız kullanarak lamel yapıştırıcı ile kaldırın (Şekil 2A-6) ve tutkal tarafı yaklaşık 45 derecelik eğimli bir açıyla embriyolara bakacak şekilde embriyoların üzerinde sabit tutun. NOT: Embriyoların yapıştırıcı ile temas etmesi için lamel jel bloğa hafifçe bastırın ve ardından basıncı hızla serbest bırakın ve lamel kaldırın. Uygulanan gerilim miktarı, embriyoların çok sert bastırılmadan ve patlamadan yapıştırıcıya stabil bir şekilde bağlanabilmesi için kritiktir.</li>
	<li>Yeni bir cam lamın ortasına 10 μL su pipetleyin ve lamel embriyonun tarafı yukarı bakacak şekilde embriyoların üzerine yerleştirilmelidir (Şekil 2B). Lameli cam kızağa yapıştırmak için oje veya başka bir yapışkan yapıştırıcı yerine su kullandığınızdan emin olun, çünkü lamellerin bu tarafı canlı görüntüleme için doğrudan konfokal lensin üzerine yerleştirilecektir.</li>
	<li>Embriyoları bir kurutma odasında (Şekil 2A-3) (Malzeme Tablosuna bakınız) vitellin zarı kırışana kadar 10-15 dakika kurutun (Şekil 2E). Gerekli süre odanın nemine göre değişebilir ve her laboratuvar koşulu için deneysel olarak test edilmelidir.</li>
	<li>Embriyo şeridinin bir ucuna 40 μL halokarbon yağı (hacim olarak 1: 1 oranında tip 27 ve tip 700 karışımı, Malzeme Tablosuna bakınız) pipetleyin. Halokarbon yağı embriyoların tüm yüzeyini kaplayana kadar slaydı eğin.</li>
</ol>4. Antikor Enjeksiyonu ve görüntüleme
<ol><li>Bir mikropipet çektirmesi kullanarak birkaç enjeksiyon cam iğnesi hazırlayın (parametre ayarları için Malzeme Tablosuna bakın) ve her iğneyi 5 μL AlexaFluor etiketli antikor çözeltisi ile yükleyin (adım 1.6'dan itibaren).</li>
	<li>Bir cam kızağın üzerine 25 mm x 25 mm'lik bir lamel yerleştirin. 40 μL halokarbon yağı pipetleyin ve lamel kenarı boyunca yayın.</li>
	<li>Enjeksiyon dürbünü altında, iğnenin ucunu yağ altındaki lamel kenarına hizalayın. Pikopompanın enjeksiyon hava basıncını ayarlayın (Malzeme Tablosuna bakın), böylece bir pompa antikorlarla dolu bir kabarcık oluşturur. Kabarcık çapı 20-50 μm ile sınırlandırılmalıdır (Şekil 2F).</li>
	<li>Boş cam slaytı, yağ altında embriyo içeren bir slaytla değiştirin. Enjeksiyon iğnesinin ucunu embriyoların ön-arka eksenine dik olarak hizalayın (Şekil 2D,G).</li>
	<li>Embriyoların çoğunun hücreselleşmeyi başlattığından ancak henüz gastrulasyona başlamadığından (evre 4 ve evre 5) ve sinsityum olarak kaldığından emin olmak için embriyoların evresini kontrol edin (Şekil 2F,G). NOT: Bu aşamanın ayırt edici özelliği, herhangi bir oluk veya kıvrımın olmaması ve embriyonun merkezinde görülebilen oval şekilli, koyu renkli bir yolk kesesinin varlığıdır. Yağ altındaki embriyo aşamasının morfolojik karakterizasyonu, Volker Hartenstein17'nin "Drosophila Embriyogenezinin Aşamaları" kitap bölümüne dayanmaktadır.</li>
	<li>Uç yumurta sarısının ortasına gelene kadar embriyoları iğneye doğru hareket ettirmek için XY aşaması manipülatörünü kullanın. Antikorları yumurta sarısına enjekte etmek için iki ila üç kez pompalayın. Başarılı enjeksiyon, embriyolar antikor çözeltisinden hacim kazandıkça vitellin membran kırışıklığının hızla kaybolmasıyla gösterilir (Şekil 2G).</li>
	<li>Enjeksiyondan sonra embriyoları iğneden uzaklaştırmak ve bir sonraki embriyoya doğru hareket etmek için XY aşaması manipülatörünü kullanın. Slayttaki tüm embriyolar enjekte edilene kadar 6. adımı tekrarlayın.</li>
	<li>Enjekte edilen embriyoların bulunduğu cam lamı bir nem odasına aktarın (Şekil 2A-8). İstenilen embriyo gelişim aşamasına ulaşılana kadar 25 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>24 mm x 50 mm'lik lamel cam slayttan kaldırın ve doğrudan mikroskobun lamel tutucusuna yerleştirin. Embriyosu olmayan taraf hedeflere dönük olacaktır. Parlak alan aydınlatması altında düşük büyütmeli bir lens kullanarak embriyoları bulun ve yüksek çözünürlüklü floresan canlı görüntüleme için 40x veya 63x lense geçin.</li>
</ol>

Antikor Aracılı Canlı Görüntüleme ile Protein Görselleştirmesinin Geliştirilmesi

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginnings+of+immunofluorescence.">The beginnings of immunofluorescence.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).</li><li>Arthur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+the+antibody.">Harnessing the power of the antibody.</a> The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biobanking,+methods+and+protocols.">Biobanking, methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2018).</li><li>Ragkousi, K., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+integrity+and+cell+division:+Concerted+cell+cycle+control.">Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control.</a> Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).</li><li>Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+dividing+cell+and+its+neighbors+regulates+adherens+junction+formation+during+cytokinesis+in+epithelial+tissue.">Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue.</a> Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+properties+of+aequorin,+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan,+aequorea.">Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea.</a> Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Boshart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+very+strong+enhancer+is+located+upstream+of+an+immediate+early+gene+of+human+cytomegalovirus.">A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus.</a> Cell. 41 (2), 521-530 (1985).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Rodriguez, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+and+glowing+toolbox+of+fluorescent+and+photoactive+proteins.">The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).</li><li>Berg, E. A., Fishman, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+antibodies+using+N+-Hydroxysuccinimide+(NHS)-fluorescein.">Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).</li><li>Saerens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+universal+VHH+framework+to+graft+non-canonical+antigen-binding+loops+of+camel+single-domain+antibodies.">Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies.</a> Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).</li><li>Loncar, D., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localisations+of+the+CPTI+collection+of+YFP-tagged+proteins+in+Drosophila+embryos.">Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos.</a> Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).</li><li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos.">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).</li><li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+shape+change+in+living+Drosophila+embryos.">Imaging cell shape change in living Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+development+of+Drosophila+melanogaster.">The embryonic development of Drosophila melanogaster.</a> , 9-102 (1997).</li><li>Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Notch-mediated+proliferation+circuitry.">The Notch-mediated proliferation circuitry.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 17-33 (2016).</li><li>Kopan, R., Ilagan, X. G., Ma, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+Notch+signaling+pathway:+unfolding+the+activation+mechanism.">The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism.</a> Cell. 137 (2), 216-233 (2009).</li><li>Fehon, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta,+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila.">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li><li>Struhl, G., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+is+required+for+activity+and+nuclear+access+of+Notch+in+Drosophila.">Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila.</a> Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).</li><li>Henrique, D., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Notch+signaling:+a+simple+logic+deployed+in+time+and+space.">Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space.</a> Development. 146 (3), dev172148 (2019).</li><li>Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-lineage+fate+decisions+involve+of+notch+receptors+basal+to+the+midbody+in+drosophila+sensory+organ+precursor+cells.">Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells.</a> Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).</li><li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases+and+phosphatases:+The+Yin+and+Yang+of+protein+phosphorylation+and+signaling.">Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling.</a> Cell. 80 (2), 225-236 (1995).</li><li>Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+phosphotyrosine.">Monoclonal antibodies to phosphotyrosine.</a> Journal of Immunological Methods. 109 (2), 277-285 (1988).</li><li>Hunter, T., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induces+rapid+tyrosine+phosphorylation+of+proteins+in+A431+human+tumor+cells.">Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells.</a> Cell. 24 (3), 741-752 (1981).</li><li>Yu, H. H., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abl+and+Canoe/Afadin+mediate+mechanotransduction+at+tricellular+junctions.">Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions.</a> Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).</li><li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+contractions+of+an+actin&#8211;myosin+network+drive+apical+constriction.">Pulsed contractions of an actin&#8211;myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).</li></ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Sunulan bu prosedür, özel antikorlarla özel floresan etiketleme yöntemini ve ardından erken evre Drosophila embriyolarına enjeksiyonu özetlemektedir. Bu teknik, düşük miktarlarda bulunan ve tipik olarak geleneksel GFP/mCherry etiketleme yöntemleriyle gözlemlenmesi zor olan proteinlerin veya translasyon sonrası modifikasyonların gerçek zamanlı görselleştirilmesini kolaylaştırır.
Yabani tip ve mutant embriyolar arasında kantitatif karşılaştırmalar yapmak için ...

İmmünofloresan, orijinal olarak Albert Coons tarafından geliştirilen, moleküllerin doğal hücresel bölmelerinde saptanmasını ve hücre altı organellerin veya makinelerin moleküler bileşimlerinin karakterizasyonunu sağlayan modern hücre biyolojisinin temel taşı tekniğidir1. Genetik manipülasyonlarla birleştiğinde, immünofloresan, protein lokalizasyonunun işlevi için gerekli olduğu konusunda artık iyi kabul edilen kavramın oluşturulmasına yardımcı olur2. Spesifik primer antikorlar ve parlak floresan boyaların yanı sıra, bu tekniğin başarısı, hücresel morfolojileri koruyan, antijenleri hareketsiz hale getiren ve antikorların hücre içi bölmelere erişilebilirliğini artıran fiksasyon ve geçirgenleştirme adı verilen bir ön işleme dayanır. Kaçınılmaz olarak, fiksasyon ve geçirgenleştirme süreci hücreleri öldürecek ve tüm biyolojik süreçleri sonlandıracaktır3. Bu nedenle, immünofloresan sadece proteinlerin yaşam yolculuğunun anlık görüntülerini sağlar. Bununla birlikte, hücre göçü ve bölünmeleri gibi birçok biyolojik süreç, doğası gereği dinamiktir ve protein davranışlarının mekansal-zamansal olarak çözülmüş bir şekilde araştırılmasını gerektirir 4,5.
Canlı organizmalardaki protein dinamiklerini incelemek için, yeşil floresan proteini (GFP)6 gibi genetik olarak kodlanmış floresan proteinlere ve yüksek hızlı konfokal mikroskoplara dayalı canlı görüntüleme yöntemleri geliştirilmiştir. Kısaca, ilgilenilen protein, GFP7 ile kaynaştırılmak üzere genetik olarak manipüle edilebilir ve daha sonra sitomegalovirüs (CMV)8 veya yukarı akış aktivasyon dizisi (UAS)9 gibi viral veya maya promotörlerinden ektopik olarak eksprese edilebilir. GFP doğası gereği otofloresan olduğundan, hedef proteinlerin lokalizasyonunu ortaya çıkarmak için florofora bağlı antikorlara gerek yoktur, bu da fiksasyon veya geçirgenleştirme ön işlemlerinin gerekliliğini atlar. Son yirmi yılda, dalga boyunun tüm spektrumunu kapsayan floresan etiketlergeliştirildi 10 ve aynı anda birkaç hedef proteinin çok renkli canlı görüntülenmesini sağladı. Bununla birlikte, AlexaFluor veya ATTO gibi kimyasal olarak tasarlanmış floresan boyalarla karşılaştırıldığında, bu genetik olarak kodlanmış floresan proteinlerin otofloresansı, özellikle daha uzun zaman ölçeklerinde canlı görüntüleme sırasında, endojen promotörlerden eksprese edildiğinde nispeten zayıf ve kararsızdır10. Bu eksiklik, floresan etiketli hedef proteinlerin aşırı eksprese edilmesiyle hafifletilebilirken, kinazlar ve fosfatazlar gibi enzimatik aktivitelere sahip birçoğu, fizyolojik seviyelerde eksprese edilmezse normal biyolojik süreçleri ciddi şekilde bozar.
Bu protokol, canlı bir görüntü kurulumunda fotostabil antikor tabanlı hedef aydınlatmayı mümkün kılan, esasen fiksasyon veya geçirgenleştirme işlemi olmadan immünofloresansa izin veren bir yöntem sunar (Şekil 1). Basit bir NHS bazlı birincil amin reaksiyonu11 yoluyla, AlexaFluor 488 veya 594 gibi floresan boyalar, esasen herhangi bir birincil antikor veya GFP / HA / Myc nanokor12 ile konjuge edilebilir. Tüm Drosophila embriyonik hücrelerinin sinsityum evre13 sırasında ortak bir sitoplazmayı paylaştığı gelişimsel bir özellikten yararlanarak, boya konjuge antikorların enjeksiyonundan sonra tüm embriyolar boyunca antijen bağlanması ve aydınlanması sağlanabilir. Drosophila ve diğer model sistemlerde14 bulunan endojen olarak etiketlenmiş proteinlerin genişleyen kütüphaneleri ile bu yöntem, canlı dokulardaki düşük bollukta floresan etiketli proteinlerin ve diğer floresan etiketli olmayan (HA / Myc etiketli) proteinlerin dinamiklerini ortaya çıkararak bu kütüphanelerin uygulamalarını potansiyel olarak genişletebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>&#160;A620014&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A20185</td>
			<td>Purification column from step 1.6 is included in this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Microscope</td>
			<td>SOPTOP</td>
			<td>EX20</td>
			<td>Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox&#174;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccation chamber&#160;</td>
			<td>LOCK&#38;LOCK</td>
			<td>HSM8200</td>
			<td>320ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Mshot</td>
			<td>MZ62</td>
			<td>Eyepiece lens: WF10X/22mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Super Tweezer</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>ST-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Superfrost&#8482; Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>33A-SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2198-1L</td>
			<td>Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration reagent&#160;</td>
			<td>TOKAI</td>
			<td>1-7315-01</td>
			<td>Fill to 90% volume of the dessication chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. 
			Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV 830</td>
			<td>Eject: 20 psi;&#160; Range: 100ms; Duration: timed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PY20</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dishes</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP nanobody</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gt</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing low-abundance proteins and post-translational modifications in living drosophila embryos via fluorescent antibody injection

GFP (Yeşil Floresan Protein) ve diğer floresan etiketler kullanılarak canlı hücrelerdeki proteinlerin görselleştirilmesi, protein lokalizasyonu, dinamikleri ve işlevinin anlaşılmasını büyük ölçüde geliştirmiştir. İmmünofloresan ile karşılaştırıldığında, canlı görüntüleme, doku fiksasyonundan kaynaklanan potansiyel artefaktlar olmadan protein lokalizasyonunu daha doğru bir şekilde yansıtır. Daha da önemlisi, canlı görüntüleme, hücre hareketi veya bölünmesi gibi dinamik biyolojik süreçleri anlamak için çok önemli olan protein seviyelerinin ve lokalizasyonunun nicel ve zamansal karakterizasyonunu sağlar. Bununla birlikte, floresan etiketleme yaklaşımlarının önemli bir sınırlaması, başarılı görselleştirme elde etmek için yeterince yüksek protein ekspresyon seviyelerine duyulan ihtiyaçtır. Sonuç olarak, nispeten düşük ekspresyon seviyelerine sahip birçok endojen etiketli floresan proteini tespit edilemez. Öte yandan, viral promotörler kullanılarak ektopik ekspresyon bazen fizyolojik bağlamlarda protein yanlış lokalizasyonuna veya fonksiyonel değişikliklere yol açabilir. Bu sınırlamaları ele almak için, canlı embriyolarda oldukça hassas antikor aracılı protein tespitini kullanan, esasen doku fiksasyonuna gerek kalmadan immünofloresan gerçekleştiren bir yaklaşım sunulmaktadır. Prensip kanıtı olarak, canlı embriyolarda zar zor tespit edilebilen endojen GFP etiketli Notch reseptörü, antikor enjeksiyonundan sonra başarılı bir şekilde görselleştirilebilir. Ayrıca, bu yaklaşım, canlı embriyolarda translasyon sonrası modifikasyonları (PTM'ler) görselleştirmek için uyarlandı, erken embriyogenez sırasında tirozin fosforilasyon modellerindeki zamansal değişikliklerin saptanmasına izin verdi ve apikal membranların altında yeni bir fosfotirozin (p-Tyr) alt popülasyonunu ortaya çıkardı. Bu yaklaşım, diğer proteine özgü, etikete özgü veya PTM'ye özgü antikorları barındıracak şekilde değiştirilebilir ve diğer enjeksiyona uygun model organizmalar veya hücre dizileri ile uyumlu olmalıdır. Bu protokol, daha önce geleneksel floresan etiketleme yöntemleri kullanılarak tespit edilmesi zor olan düşük bolluktaki proteinlerin veya PTM'lerin canlı görüntülenmesi için yeni olanaklar sunar.

Immunofluorescence is a cornerstone technique of modern cell biology originally developed by Albert Coons, which enables the detection of molecules at their native cellular compartments and characterization of the molecular compositions of subcellular organelles or machineries1. Coupled with genetic manipulations, immunofluorescence helps establish the now well-accepted concept that protein localization is essential for its function2. Aside from specific primary antibodies and bright fluorescent dyes, the success of this technique relies on a preliminary process named fixation and permeabilization, which preserves cellular morphologies, immobilizes antigens, and increases the accessibility of antibodies into intracellular compartments. Inevitably, the fixation and permeabilization process would kill cells and terminate all biological processes3. Therefore, immunofluorescence only provides snapshots of the life journey of proteins. However, many biological processes such as cell migration and divisions are dynamic in nature, requiring investigation of protein behaviors in a spatial-temporally resolved manner4,5.
To examine protein dynamics in living organisms, live imaging methods based on genetically encoded fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP)6 and high-speed confocal microscopes have been developed. Briefly, the protein of interest can be genetically manipulated to be fused with GFP7, and then ectopically expressed from viral or yeast promoters such as cytomegalovirus (CMV)8 or upstream activation sequence (UAS)9. Because GFP is autofluorescent in nature, no fluorophore-coupled antibodies are required to reveal the localization of target proteins, which bypasses the necessity of preliminary processes of fixation or permeabilization. Over the last two decades, fluorescent tags spanning the whole spectrum of wavelength have been developed10, enabling multi-color live imaging of several target proteins at the same time. However, compared to chemically engineered fluorescent dyes such as AlexaFluor or ATTO, the autofluorescence of these genetically encoded fluorescent proteins is relatively weak and unstable when expressed from endogenous promoters, especially during live imaging over longer time scales10. While this shortfall can be mitigated by over-expressing fluorescently tagged target proteins, many with enzymatic activities such as kinases and phosphatases severely disrupt normal biological processes if not expressed at physiological levels.
This protocol presents a method that enables photostable antibody-based target illumination in a live image setup, essentially allowing immunofluorescence without the process of fixation or permeabilization (Figure 1). Through a simple NHS-based primary amine reaction11, one can conjugate fluorescent dyes such as AlexaFluor 488 or 594 with essentially any primary antibody or GFP/HA/Myc nanobody12. Taking advantage of a developmental feature that all Drosophila embryonic cells share a common cytoplasm during the syncytium stage13, one can achieve antigen binding and illumination across entire embryos after the injection of dye-conjugated antibodies. With expanding libraries of endogenously tagged proteins available in Drosophila and other model systems14, this method can potentially broaden applications of these libraries by revealing dynamics of low-abundance fluorescently tagged proteins and other non-fluorescently tagged (HA/Myc-tagged) proteins in living tissues.

Yazar Gündemi: Hayvan Morfogenez Araştırmalarında Mekanik ve Biyokimyasal Sinyallerin Dinamiklerini Ortaya Çıkarmak 

Floresan Antikor Enjeksiyonu ile Canlı Drosophila Embriyolarında Düşük Bolluktaki Proteinlerin ve Translasyon Sonrası Modifikasyonların Görselleştirilmesi

Antikor enjeksiyon yönteminin floresan etiket tabanlı canlı görüntüleme veya immünofloresan üzerindeki avantajlarını göstermek için, düşük bollukta bir transmembran reseptörünün, Notch'un dinamik lokalizasyonunu ve canlı embriyolarda tirozin fosforilasyonu adı verilen bir tür translasyonel modifikasyonu karakterize eden iki vaka çalışması sağlanmıştır.
Çentik sinyal aktivitesi, embriyogenez ve yetişkin organ homeostazı sırasında hücre kaderinin belirlenmesind...

Watch this Scientific Journal Video about Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research at JoVE.com

Bu protokol, geleneksel GFP/mCherry etiketi yaklaşımları kullanılarak tespit edilmesi zor olan düşük bolluktaki proteinlerin veya translasyon sonrası modifikasyonların canlı görüntülenmesini sağlamak için özelleştirilmiş antikor bazlı floresan etiketlemeyi ve erken Drosophila embriyolarına enjeksiyonu açıklar.

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

Mekanik ve biyokimyasal sinyallerin, hücreler ve moleküller tarafından tespit ve kuvvetlere verilen tepki de dahil olmak üzere hayvan morfogenezini nasıl ilişkilendirdiğini anlamayı amaçlıyoruz. Daha fazla molekülün mekanosensitif olduğu, değişen gerilim seviyelerinde farklı şekilde işlev gördüğü keşfedilmiştir. Bununla birlikte, bu kuvvete duyarlı olayların fizyolojik bağlamı ve işlevi büyük ölçüde bilinmemektedir.Kuvvete duyarlı olayların dinamik doğası nedeniyle, alanımız moleküler ve hücresel davranışları yakalamak için büyük ölçüde yüksek hızlı floresan görüntülemeye ve hızlandırılmış kayda dayanır. Floresan etiketli proteinlerin çoğu görüntülenecek kadar parlak değildir ve önemli bir ağartıcı olmadan uzamsal-zamansal çözünürlük gerektirir. Öte yandan, geleneksel immünofloresan yöntemleri, fiksasyondan sonra yalnızca moleküler ve hücresel fikstürün anlık görüntüsünü yakalayabilir.Bu yöntem, Notch, Wnt ve BMP yolları gibi ana sinyal yollarının birçok düşük bolluktaki protein reseptörünün lokalizasyonunu dinamik olarak izlemenin yolunu açar. Sonunda, geleneksel doğrusal sinyal kaskadlarına ek olarak, sinyal olaylarının hücre altı ölçeklerde nerede meydana geldiğini ve nerede gerçekleştiğini belirleyebiliriz.

visualizing-low-abundance-proteins-post-translational-modifications

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

708 Görüntüleme.  SUSTech University. Mekanik ve biyokimyasal sinyallerin, hücreler ve moleküller tarafından tespit ve kuvvetlere verilen tepki de dahil olmak üzere hayvan morfogenezini nasıl ilişkilendirdiğini anlamayı amaçlıyoruz. Daha fazla molekülün mekanosensitif olduğu, değişen gerilim seviyelerinde farklı şekilde işlev gördüğü keşfedilmiştir. Bununla birlikte, bu kuvvete duyarlı olayların fizyolojik bağlamı ve işlevi büyük ölçüde bilinmemektedir.Kuvvete duyarlı olayların dinamik d...

Video: Yazar Gündemi: Hayvan Morfogenez Araştırmalarında Mekanik ve Biyokimyasal Sinyallerin Dinamiklerini Ortaya Çıkarmak 

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein localization, dynamics, and function. Compared to immunofluorescence, live imaging more accurately reflects protein localization without potential artifacts arising from tissue fixation. Importantly, live imaging enables quantitative and temporal characterization of protein levels and localization, crucial for understanding dynamic biological processes such as cell movement or division. However, a major limitation of fluorescent tagging approaches is the need for sufficiently high protein expression levels to achieve successful visualization. Consequently, many endogenously tagged fluorescent proteins with relatively low expression levels cannot be detected. On the other hand, ectopic expression using viral promoters can sometimes lead to protein mislocalization or functional alterations in physiological contexts. To address these limitations, an approach is presented that utilizes highly sensitive antibody-mediated protein detection in living embryos, essentially performing immunofluorescence without the need for tissue fixation. As proof of principle, endogenously GFP-tagged Notch receptor that is barely detectable&#160;in living embryos can be successfully visualized after antibody injection. Furthermore, this approach was adapted to visualize post-translational modifications (PTMs) in living embryos, allowing the detection of temporal changes in tyrosine phosphorylation patterns during early embryogenesis and revealing a novel subpopulation of phosphotyrosine (p-Tyr) underneath apical membranes. This approach can be modified to accommodate other protein-specific, tag-specific, or PTM-specific antibodies and should be compatible with other injection-amenable model organisms or cell lines. This protocol opens new possibilities for live imaging of low-abundance proteins or PTMs that were previously challenging to detect using traditional fluorescent tagging methods.

This protocol describes the customized antibody-based fluorescence labeling and injection into early Drosophila embryos to enable live imaging of low-abundance proteins or post-translational modifications that are challenging to detect using traditional GFP/mCherry-tag approaches.