Başlamak için, su içinde mililitre başına bir miligram kollajen IV çözeltisi hazırlayın ve bu çözeltiden 95 mikrolitresini 10 oyuklu bir görüntüleme alt haznesi slaytının her bir oyuğuna ekleyin. Kuyucukları kaplamak için slaydı 37 santigrat derecede 30 dakika ila iki saat arasında inkübe edin. Kültürlenmiş 3D insan bağırsak organoidlerinden, son geçişten beş ila yedi gün sonra WRNE bakım ortamını kuyulardan çıkarın.
Daha sonra oyuk başına 0.5 milimolar EDTA içeren 500 mikrolitre 1xPBS ekleyin. Önceden kodlanmış bir mililitrelik uç kullanarak, BMM'yi plakadan ayırmak için hafifçe pipetleyin. Süspansiyonu önceden kodlanmış 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Her bir kuyuyu ilave 500 mikrolitre PBS EDTA çözeltisi ile durulayın. Süspansiyonu santrifüjleyin ve süpernatan ve artık BMM'yi çıkarın. Ardından, peleti beş milimolar EDTA içeren üç mililitre PBS'de yeniden süspanse etmek için önceden kodlanmış bir uç kullanın.
Tekrar santrifüjleyin ve iki mililitre enzimatik ayrışma tamponunda yeniden süspanse edin. Tüpü 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Ardından,% 10 FBS ile üç mililitre CMGF ekleyin ve hafifçe karıştırın.
Santrifüjleyin ve pelete bir mililitre CMGF ekleyin. Organoidleri tek hücrelere ayırmak için karışımı 80 ila 100 kez kuvvetlice pipetleyin. Peleti bir mililitre WRNE ortamında santrifüjleyin ve yeniden süspanse edin.
Bir hücre sayımı elde edin ve 100 mikrolitrede 10 ila beş hücreye 1.25 kat 10 elde etmek için hücre süspansiyonunu seyreltin. Daha sonra, kollajen çözeltisini önceden hazırlanmış plakadan çıkarın, kuyu dibine dokunmaktan kaçının. Daha sonra oyuk başına 100 mikrolitre hazırlanmış hücre çözeltisi ekleyin.
37 santigrat derecede bir hücre kültürü inkübatöründe 24 saat inkübe edin. Ortamı, birleşmeye kadar her 24 saatte bir kuyucuk başına 100 mililitre farklılaşma ortamı ile değiştirin. Bu noktadan sonra, tek katmanlar sonraki uygulamalar için hazırdır.
