This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

1. HSV Suşlar ve Taşıma Not: Rekombinan olmayan yayılan HSV-1 (KOS) gL86 ve HSV-2 (KOS) 333gJ - V. Twiari 36,37 tarafından sağlanan kullanılan beta-galaktosidaz raportör etkinliği ile. <ol><li> 1 -80 ° C de, tek bir parça ve deposundan virüs kullanabilir: Dulbecco&#39;nun değiştirilmiş Eagle ortamı,% 20 fetal sığır serumu (FBS) ile (DMEM) 1 oranında ve kullanılana kadar yağsız süt. Viral çok depolama önce, O-nitrofenil-β-D-galactopyranoside (ONPG) ve 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galactopyranoside (X-Gal) deneyi virüs konsantrasyonunu belirlemek. </li><li> Daha önce (Şekil 1) 14 tarif edildiği gibi, raportör virüs giriş deneyi kullanılarak her bir deney tahlili çalıştırmak için X-Gal boyaması ile virüs canlılığı ve enfeksiyon (MOI) bir çokluğunu belirlemek. </li><li> İstenen İçişleri Bakanlığı virüs (Opt-MEM) seyreltin. tek tabakalar (paraformaldehit; 0.5 ml / oyuk) saptamak lekelenme. Ayrı bir microti virüs canlılığı kontrolleri yerleştirinpolimikrobiyal tahlil plakaları paralel olarak ter plakası. </li></ol> 2. HeLa 299 Hücre İşleme <ol><li> 4.5 g / L glikoz,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), gentamisin (50 ug / ml) ve L-glutamin ile DMEM içinde 37 ° C,% 5 CO2 de büyür. Tripsin çözeltisi ile% 80 izdiham Geçiş hücreleri (% 0.05 tripsin, etilendiamintetraasetik asit, 0.53 M EDTA, 5 ml / şişe). </li></ol> 3. C. albicans Taşıma Not: C Klinik laboratuar bir kaynaktan elde edilen albicans orta 2x yağsız süt REMMEL -80 ° C&#39;de saklanır. <ol><li> Kültür Sabouraud Dekstroz Orta (37 ° C) üzerine stok donmuş. 24 saat altkültür C sonra Fungisel ortamı üzerine albicans (37 ° C, 48 saat) kullanım için. </li><li> Mikrop tüpünü (GT) formları oluşturun (3 ml FBS, temsili koloniler almak 3 saat, 37 ° C, Abs 600, 0.3). inkübasyondan sonra, GT yıkama (HBSS; 2x, 4000 xg). (37 ısıtıldı HBSS ile yıkandı, GT ekleme# 176; C; 0.32 Abs 600). GT formları hemositometre sayımı ile tespit edildiği üzere gözlenen hücre% 99 olmalıdır. </li><li> Temsili Fungisel koloniler seçerek maya formu (YF) stok süspansiyonları olun (HBSS, 3 ml 0.32 Abs 600). YF formlarının sayısını / mikroskopik hemasitometre kullanarak ml. YF formları hemositometre sayımı ile tespit edildiği üzere gözlenen hücre% 99 olmalıdır. </li><li> Mantar stok çalışma yapmak (25 ml HBSS GT veya YF stokunun 250 ul; 37 ° C; 10 5 CFU / ml) </li></ol> 4. S. aureus Taşıma <ol><li> Mağaza S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel süt 2x yağsız). koyun kanlı agara Kültürü (% 5; 37 ° C; 24 saat). temsili koloniler seçin ve hisse senedi için 2 gün içinde orta tuzları mannitol transfer (37 ° C, 18 saat). </li><li> S. olun aureus stok süspansiyonu (3 mi HBSS; 1.32 Abs 600, 10 8 CFU / mL) <ol><li> S. çalışma yapmak aureus stok (100 ul25 ml HBSS stoklar; 10 5 CFU / ml). </li></ol></li></ol> 5. Candida ve S. aureus Süspansiyonlar <ol><li> Karışık C olun albicans ve S. aureus süspansiyon (250 ul YF veya GT stok ve 25 ml HBSS 100 ul S. aureus stok). </li></ol> 6. polimikrobik Biyofilm Deneyi <ol><li> 2 x 10 5 HeLa hücre / ml 200 ul (% 85 birleşen seviyesi) Tohum 96 oyuklu plakalar. Kaya plakaları (30-45 dakika; 37 ° C), inkübasyondan önce (37 ° C,% 5 CO2 kuluçka, 18 saat). Yıkama mono tabakaları (1x; Opt-MEM) daha sonra HSV ile tohum (HSV-1 (KOS) gL86 veya HSV-2 (KOS) 33 GJ - 100 ul Opt-MEM; MOI 50 ve 10). Inkübe edin (37 ° C, 3 saat,% 5 CO2). günde sadece bir virüs suşu kullanın. </li><li> Enfekte tek tabakaları yıkayın (1 x fosfat tamponlu tuzlu su, Mg + 2 ve Ca + 2 ile (PBS); 100 ul). 25 &amp; # bırakarak sıcak HBSS ile PBS değiştirin181; her bir L. <ol><li> YF, GT ve / veya S. ekle (hücre oranı = 5 hedef 100 ul: 1, n = 16), S. aureus çalışma süspansiyonlar. Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi inkübe edin (statik; 30 dakika; 37 ° C,% 5 CO2). </li></ol></li><li> İnkübasyondan sonra, her seferinde aspire bir sütun hemen Mg + 2 ve Ca + 2 ile 300 ul PBS ile yeniden doldurmak. (1:50 seyreltme 200 ul;, filtre sterilize RIPA) radyo-immünopresipitasyon tahlil lizis tamponu eklemek sonra da iki kez bu adımı yineleyin. </li><li> Hızla HeLa hücre lisatı daha sonra manitol tuzları (MS) ve / veya Fungisel (F) ortam (Şekil 2) üzerine 50 ul koyun Karışım. 90 ° açıyla cam çubuk bükülmüş kullanarak lizat yayıldı. (37 ° C&#39;de 18 saat) inkübe edin. El ile plaka başına koloni sayısını saymak. Kontroller S. oluşur aureus ve / veya C HSV-bulaşmamış HeLa hücrelerinde albicans bağlılık. </li></ol> 7. Görüntüleme Çalışmaları &lt;/ P&gt; <ol><li> Her yuvarlak cam lamel yıkayın (12 mm; 50 ml aseton ml beher 100). Kuru ve sterilize lamelleri (Kimwipes, cam petri). Alkol alev sterilize forseps ile steril bir 24 yuvalı plakalara ait kuyucuklar içerisine, kuru steril lamelleri yerleştirin. </li><li> yıkandı, steril yuvarlak cam lamelleri içeren 24 gözlü plakalara, HeLa hücreleri (96 gözlü levhalar için kullanılan 5x hacmi 1 mi) eklenir. Adımda yukarıda belirtilen 6.4 6.2.1&#39;de tarif edildiği gibi inkübe ve işlem, 5X 96 gözlü levhalar için kullanılan ses şablonun (Tablo 2) &#39;e uygun bir virüs, bakteri ya da mantarları ekleyin. </li><li> Son yıkamadan sonra, metanol ile slayt sel ve buharlaşmasına izin vererek mikroskopi için hücreleri düzeltin. boyanma kadar oda sıcaklığında plakaları saklayın. </li><li> Aydınlık alan mikroskobu (1,000x nihai orijinal büyütme) için deiyonize su ile metanol-sabit lamelleri içeren kuyu doldurun. Hemen su aspire. Grams kristal viyole ile her lamel örtün. Yıkama olmayan bağlı leke (deiyonize su) ücretsiz lamelleri. In situ Kuru lamelleri sonra etiketli slayt montaj orta sert seti (Şekil 3) ile yapışır. </li><li> floresan mikroskobu (100x objektif; 1,000x son orijinal büyütme), adım 7.4 açıklandığı gibi yıkama esas metanol ücretsiz lamelleri. kuyularda lamelleri kurulayın. <ol><li> Kuruduktan sonra, kapak fişleri kaldırmak ve etiketli slaytlar üzerine koyun. (- 5 ul 1) Daha sonra floresan izotiyosiyanat (FITC) ile birleştirilmiş bayır Herpes Simplex virüs tip 1:20 seyreltme lamel kapsayacak şekilde 1 + 2 gD antikoru yeterli miktarda ilave edin. </li><li> 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de bir nem odasında slaytlar inkübe edin. İnkübasyondan sonra, PBS 4 değişiklikler lamelleri yıkayın. </li><li> Son yıkamadan sonra, etiketli slayt lamel dönün. 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (, nem odası; 30 dakika için 37 ° C DAPI) ile leke. İnkübasyondan sonra 4 Chan lamelleri yıkamaPBS ges, daha sonra sabit set montaj orta ile etiketlenmiş slayt yapıştırın. </li><li> montaj orta karanlıkta oda sıcaklığında 24 saat boyunca tedavi etmek için izin verin. parlak bir alan mikroskobu veya FITC ve DAPI kesme filtreleri ile floresan mikroskop ya petrol hedefi altında lamelleri inceleyin. Eş-lokalizasyonu (Şekil 4) için en az 50 alanlar (organizma başına en az 100 hücre) fotoğraflarını inceleyin. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Şu anda hiçbir bilgi, prokaryot ökaryot ve viral yani çoklu taksonomik etki, çapraz konak mikrobiyomları yarı daimi üyelerinin kalıcı arasındaki karmaşık etkileşimlerin mevcuttur. Bu nedenle S. biyofilm başlamasını incelemek için in vitro model sisteminde bir roman geliştirdi aureus ve C. HSV-1 veya HSV-2 albicans HeLa 229 (HeLa) hücreler 38 etkilemiştir. HeLa hücre model sistem benzersiz bir avantaj sunuyor. Bu, her iki S i?...

<html> İnsan mikrobiyomları vücudunda coğrafi bölgeleri paylaşan birden taksonomik krallıklardan farklı organizmaların içerir. hücre yüzeylerine yapışma mikrobiyomları kolonizasyon sürecinin bir parçasıdır biyofilm, önemli bir ilk adımdır. mikrobiyomları dahil kronik ve inatçı enfeksiyonlara neden virüsler olabilir. Bu virüslerin kronik hücre enfeksiyon, farazi reseptörü durumunu bir değişikliğe neden olabilir. Ek olarak 1,2, hücre içi patojenler ile hücre girişi da sırayla bakteri ve mantarlar da dahil olmak üzere, diğer mikrobiyomları üyelerinin eki değiştirebilir ana membran akışkanlığını / hidrofobiklik etkileyebilecek . İnsan konağın aynı coğrafi bölgelerde lokalize co bu çoklu patojen arasında oluşabilir etkileşimleri anlamak için, biz mukozal yüzeyinde mevcut taksonomik krallıkların spektrumunu temsil patojenlerin etkileşimini incelemek gerekir. t &quot;&gt; Herpesviridae mikrobiyomu daimi üyeleri olarak insanlarda% 100 mevcut mikropların ailesidir 3,4. Buna ek olarak aynı zamanda sürekli semptomlarının varlığı ve yokluğunda hem döken edilebilir. Spesifik olarak, herpes simplex virüs-1 ve herpes simplex virüs-2 (HSV-1 ve HSV-2 sırasıyla) oronasopharynx ve genital bölgesindeki mikrobiyomu daimi üyeleridir. bağışıklık yetkin kişiler, her iki HSV-1 ve HSV-2 neden gingivostomatit yanısıra genital herpes 5-8. bu bölgelerde, HSV kronik kalıcı nectins, heparan sülfat, lipid sallar ve herpes virüs giriş arabulucu yüzey ifadesinde değişiklikler hücreler sonuçlara HSV 9. entry dökülme viral asemptomatik / tümör nekrozu ile karakterize bir gizli enfeksiyona neden faktör reseptörü (HVEM / TNFR) 10-25. bazı bakteriler ve mantarlar, örneğin, S. aureus ve C. albicans Bu potansiyel olarak ortak temsil alıcıları, fırsatçı patojenler ise,Ayrıca oronasopharynx 26,27 mukozal mikrobiyomları üyeleri olarak bulunabilir. Oronasopharynx S. içinde aureus ve C. albicans kolonizasyon iki ayrı siteler işgal. Doğal diş ana olarak, oral mukoza, HSV-1 ve C tarafından paylaşılır albicans, anterior nazal nares S. tarafından işgal edilirken aureus 28. Ancak, rağmen, in vitro bulgular S. aureus ağız epitel hücrelerine yapışır, 29,30 S. Normal doku 29,30 mevcut olduğunda aureus seyrek Oral örneklerden izole edilir. Küçük klinik bulguların ötesinde genital yol ko-kolonizasyon niş ile ilgili bilinen S. aureus C iken, genital iltihap, akıntı ve disparoni ile karakterize, aerobik vajinit ile ilişkilidir albicans ağız boşluğu 31-35 gözlenene benzer bir mukozal lezyonlar. Böylece, ağız ve genital microbi bu üyelerin her ne kadaronların etkileşimine ilişkin bilinen küçük ome çapraz taksonomik krallıklar konak hücre yüzeyinde 5 bağlılık yoluyla biyofilm oluşumunu başlatmak için bu etkileri kendi yeteneği gibi. Bu protokol etkin bir ko-kolonizasyon / enfeksiyon fonksiyonel sonuçlarını belirlemek amacıyla uygulanmıştır.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;C.albicans&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BBL Sabouraud Dextrose</td><td>BD</td><td>211584</td><td></td></tr><tr><td>Fungisel Agar</td><td>Dot Scientific</td><td>7205A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;S.aureus&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannitol Salt Agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>7143B</td><td></td></tr><tr><td>Sheep blood agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>221239</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Hela cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DMEM (Dubelcco&#039;s Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin 50 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>1397</td><td>50 &amp;micro;g/ml final concentration in the complete DMEM</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>10% final concentration in the complete DMEM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other medium and reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Thermo Scientific</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Pure X gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520-018</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (Hanks&#039; Balanced Salt Solution)</td><td>Corning</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Dot Scientific</td><td>30042-500</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis</td><td>Life Technologies</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>HSV 1&amp;amp;2, specific for gD</td><td>ViroStat</td><td>196</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D8417-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Gram Crystal Violet</td><td>Troy Biologicals</td><td>212527</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 100 x 15</td><td>Dot Scientific</td><td>229693&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 150 x 15</td><td>Kord Valmark</td><td>2902</td><td></td></tr><tr><td>96-Well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8030-01F</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8044-01F</td><td></td></tr><tr><td>Culture tubes 100 x 13</td><td>Thomas Scientific</td><td>9187L61</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip circles, 12 mm</td><td>Deckglaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr></tbody></table>

determination of biofilm initiation on virus-infected cells by bacteria and fungi

mantarlar, bakteriler ve virüs içeren taksonomik krallıklar arasında polimikrobiyal etkileşimlerin incelenmesi önceden mikrobiyomları viral üyeleri bu virüs bulaşmış konak hücreleri ile sonraki mikrop etkileşimleri nasıl etkilediği ile ilgili incelenmiş değildir. bakteri ve mantarlar ile virüs birlikte yaşama ağız boşluğu ve genital mukoza yüzeyleri üzerinde esas olarak mevcuttur. Mukozal hücrelerin, kalıcı kronik veya kalıcı geç viral enfeksiyonları, özellikle de ifade edilen reseptör, önemli sayıda virüs değiştirilerek mikrobiyomu üyeleri üzerindeki etkisini ve türü olabilir. Ev sahibi hücre membranı mimarisinde Modifikasyon biyofilm, yani yapışma ilk adımı başlatmak için normal flora ve fırsatçı patojenlerin daha sonraki üye değiştirilmiş yeteneğine neden olur. Bu çalışma, biofil başlatılmasından HSV etkisinin ölçülmesi ve görsel inceleme için bir yöntem tarif ederS. m formasyonu (yapışma) aureus ve C. albicans.

Bu raporda tarif edilen sistem elde edilebilen veri sağlamlık düzeyi Şekil 2, af 38 &#39;de gösterilmiştir. Bu sistemin kullanılmasıyla viral yönden enfekte hücreleri ve birbirlerinin yapışma üzerindeki etkisi ile stafilokok ve mantar etkileşimin modülasyonuna tarif edilebilir. Polimikrobiyal etkileşimi, aynı hücreler üzerinde oluşup oluşmadığını tespit etmek için, Şekil 3 ve 4 38 &#39;de ...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi at JoVE.com

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Bakteri ve mantar virüsle enfekte olmuş hücreler üzerinde Biyofilm Başlatma Belirlenmesi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

determination-biofilm-initiation-on-virus-infected-cells-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.6K Görüntüleme.  Midwestern University. A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Video: Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtiter Bulaşık Biyofilm Oluşumu Testi

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

8-iyi Odası Slayt in vitro Biyofilm Oluşumu

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

Enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu: kimlik ve miktar teknikleri

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

Biyoloji

Acinetobacter Biyofilm Oluşumunun Değerlendirilmesi ve Biyofilmlerin Karakterizasyonu

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

Yazar Spotlight: Acinetobacter Biyofilm Miktarının Belirlenmesi, Değerlendirilmesi ve Görselleştirilmesi için Kapsamlı Bir Protokol 

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

Acinetobacter Biyofilmleri için Miktar Tayini, Canlılık Değerlendirmesi ve Görselleştirme Stratejileri

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

Bakteri ve mantar virüsle enfekte olmuş hücreler üzerinde Biyofilm Başlatma Belirlenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Microtiter Bulaşık Biyofilm Oluşumu Testi

8-iyi Odası Slayt in vitro Biyofilm Oluşumu

Araştırma yöntemleri

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu: kimlik ve miktar teknikleri

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

Acinetobacter Biyofilmleri için Miktar Tayini, Canlılık Değerlendirmesi ve Görselleştirme Stratejileri

Acinetobacter Biyofilmleri için Miktar Tayini, Canlılık Değerlendirmesi ve Görselleştirme Stratejileri

Acinetobacter Biyofilmleri için Miktar Tayini, Canlılık Değerlendirmesi ve Görselleştirme Stratejileri