Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (NIH) R01DK115507 ve R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) hibeleri ile desteklenmiştir. Stajyer desteği, NIH hibe F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F.J. Scribano) ve F32DK130288 (PI: K.A. Engevik) tarafından sağlandı. Organoid bakım ortamını sağladığı için Texas Tıp Merkezi Sindirim Hastalıkları Enteroid Çekirdeğine teşekkür ederiz.

Virüsle Enfekte İnsan Bağırsağı Organoid Tek Tabakalarının Kalsiyum Görüntülemesi

<ol>
	<li>Bootman, M. D., Bultynck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+cellular+calcium+signaling:+A+primer.">Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802 (2020).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Danese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+as+a+result+of+calcium+signaling+modulation:+A+cancer-centric+prospective.">Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061 (2021).</li><li>Harr, M. W., Distelhorst, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+autophagy:+Decoding+calcium+signals+that+mediate+life+or+death.">Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579 (2010).</li><li>Barak, P., Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+Ca2++microdomains+from+store-operated+CRAC+channels.">Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097 (2020).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GCaMP,+a+family+of+single-fluorophore+genetically+encoded+calcium+indicators.">GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators.</a> J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).</li><li>Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+indicators+for+organellar+calcium+imaging.">Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging.</a> Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).</li><li>N&#225;szai, M., Cordero, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+stem+cells:+Got+calcium.">Intestinal stem cells: Got calcium.</a> Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).</li><li>Barrett, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+chloride+secretion+in+the+intestinal+epithelium:+Significance+and+regulation.">Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation.</a> Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensing+receptor+regulates+intestinal+dipeptide+absorption+via+Ca2++signaling+and+IKCa+activation.">Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation.</a> Physiol Rep. 8 (1), e14337 (2020).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+CRISPR&#8211;Cas9-mediated+genetic+knockout+human+intestinal+tissue&#8211;derived+enteroid+lines+by+lentivirus+transduction+and+single-cell+cloning.">Generation of CRISPR&#8211;Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue&#8211;derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning.</a> Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).</li><li>Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+to+dissect+gastrointestinal+virus-host+interactions:+What+have+we+learned.">Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned.</a> Viruses. 13 (6), 999 (2021).</li><li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FPbase:+a+community-editable+fluorescent+protein+database.">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).</li><li>Lai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+calcium-triggered+secretion+by+hydrocarbon-stapled+peptides.">Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides.</a> Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).</li><li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+induces+intercellular+calcium+waves+through+ADP+signaling.">Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling.</a> Science. 370 (6519), eabc3621 (2020).</li><li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoctamin+1/TMEM16A+controls+intestinal+Cl&#8722;+secretion+induced+by+carbachol+and+cholera+toxin.">Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl&#8722; secretion induced by carbachol and cholera toxin.</a> Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).</li><li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+TMEM16A+control+luminal+chloride+secretion+in+a+NHERF1+dependent+manner.">Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner.</a> Biochem Biophys Rep. 25, 100912 (2021).</li><li>Mroz, M. S., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+chronically+upregulates+Ca2+-dependent+Cl&#8722;+conductance+and+TMEM16A+expression+in+intestinal+epithelial+cells.">Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl&#8722; conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells.</a> J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).</li><li>Sui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+of+Ca2+-activated+Cl&#8722;+channel+transmembrane+member+16A+in+lipopolysaccharide-induced+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+in+vitro.">Dual role of Ca2+-activated Cl&#8722; channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 404 (2020).</li><li>Bellono, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterochromaffin+cells+are+gut+chemosensors+that+couple+to+sensory+neural+pathways.">Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways.</a> Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).</li><li>Paradis, T., B&#232;gue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junctions+as+a+key+for+pathogens+invasion+in+intestinal+epithelial+cells.">Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (5), 2506 (2021).</li><li>Samak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src+signalling+cascade+mediates+disruption+of+intestinal+epithelial+tight+junctions+by+dextran+sulfate+sodium.">Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium.</a> Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).</li><li>Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+by+Ca2++regulates+intestinal+stem+cell+activity.">Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity.</a> Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).</li><li>Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+host+cell+calcium+signaling+during+viral+infections:+Emerging+paradigm+with+high+clinical+relevance.">Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance.</a> Mol Aspects Med. 81, 101004 (2021).</li><li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+calcium+dysregulation+manifests+as+dynamic+calcium+signaling+in+the+cytoplasm+and+endoplasmic+reticulum.">Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum.</a> Sci Rep. 9 (1), 10822 (2019).</li><li>Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+disrupts+calcium+homeostasis+by+NSP4+viroporin+activity.">Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity.</a> mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).</li><li>Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rotavirus+NSP4+viroporin+domain+is+a+calcium-conducting+ion+channel.">The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel.</a> Sci Rep. 7, 43487 (2017).</li><li>Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+hijacked+through+viroporin-activated+calcium/calmodulin-dependent+kinase+kinase-&#946;+signaling+is+required+for+rotavirus+replication.">Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-&#946; signaling is required for rotavirus replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).</li><li>Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPII+vesicle+transport+is+required+for+Rotavirus+NSP4+interaction+with+the+autophagy+protein+LC3+II+and+trafficking+to+viroplasms.">COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms.</a> J Virol. 94 (1), e01341 (2019).</li><li>Pando, V., I&#353;a, P., Arias, C. F., L&#243; Pez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+calcium+on+the+early+steps+of+Rotavirus+infection.">Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection.</a> Virology. 295 (1), 190-200 (2002).</li><li>Hyser, J. M., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+consequences+of+calcium-conducting+viroporins.">Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins.</a> Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).</li><li>Strtak, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovirus+NS1-2+has+viroporin+activity+that+induces+aberrant+cellular+calcium+signaling+to+facilitate+virus+replication.">Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication.</a> mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).</li><li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens,+commensals,+and+host+intestinal+epithelium.">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> J Vis Exp. (146), 59357 (2019).</li><li>Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ord&#243;&#241;ez-Mor&#225;n, P., Imajo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+for+intestinal+organoid+technology+and+personalized+disease+modeling.">Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling.</a> Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).</li><li>Cevallos Porta, D., L&#243;pez, S., Arias, C. F., Isa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+rotavirus+entry+and+release+from+differentiated+small+intestinal+cells.">Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells.</a> Virology. 499, 65-71 (2016).</li><li>Mirabelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Norovirus+efficiently+replicates+in+differentiated+3D-human+intestinal+enteroids.">Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids.</a> J Virol. 96 (22), e0085522 (2022).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> Bioessays. 39 (8), 28749075 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+NEMO+as+calcium+indicators+with+large+dynamics+and+high+sensitivity.">Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity.</a> Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).</li></ol>

Yazarların ifşa etmek için rekabet eden mali çıkarları yoktur.

Sitozolik Ca2+ seviyelerindeki değişiklikler,epitel 10,16,17 içindeki patolojilerin hem nedeni hem de sonucu olabilir. Sitozolik kalsiyumdaki artışlar, kalsiyuma bağımlı klorür kanalının aktivasyonu yoluyla doğrudan sekresyona neden olabilirTMEM16A 18,19. Ca2+'ya yanıt olarak TMEM16A aktivasyonu, apikal klorür akışına izin vererek, ...

Kalsiyum, hücresel fizyolojinin düzenlenmesinde kritik bir rol oynayan, yaygın olarak korunan ikinci bir habercidir1. Güçlü yükü, küçük boyutu ve fizyolojik koşullarda yüksek çözünürlüğü göz önüne alındığında, kalsiyum, protein konformasyonunun ideal bir manipülatörüdür. Bu, kalsiyumu elektrokimyasal sinyalleri enzimatik, transkripsiyonel veya transkripsiyon sonrası değişikliklere dönüştürmek için güçlü bir araç haline getirir. Endoplazmik retikulum (ER) ve plazma membranları boyunca katı kalsiyum konsantrasyonu gradyanları, sitozolik kalsiyum konsantrasyonunda hızlı değişikliklere izin veren yüksek bir itici güç oluşturur. Hem arabelleğe alma hem de aktif aktarım dahil olmak üzere birden çok mekanizma bu gradyanı sıkı bir şekilde korur. Normal hücresel fonksiyonlar için gerekli olsa da, bu bakım enerjik olarak pahalıdır ve bu da onu stres durumlarında özellikle duyarlı hale getirir 2.
Bu nedenle, sitozol içindeki kalsiyumun düzensizliği, birçok hücresel stres türünün neredeyse evrensel bir sinyalidir. Metabolik bozukluklar, toksinler, patojenler, mekanik hasar ve genetik bozulmaların tümü kalsiyum sinyalini bozabilir. Uyarandan bağımsız olarak, tüm hücre düzeyinde, sitozolik kalsiyumdaki sürekli, kontrolsüz artışlar apoptozu ve sonunda nekrozu teşvik edebilir 3,4. Bununla birlikte, daha düşük genlikli veya daha yüksek frekanslı sitozolik kalsiyum seviyelerindeki değişikliklerin değişen etkileri vardır2. Benzer şekilde, kalsiyum dalgalanmalarının sonuçları, meydana geldikleri uzamsal mikro alana bağlı olarak farklılık gösterebilir5. Bu nedenle kalsiyum seviyelerinin izlenmesi, dinamik sinyalleme süreçleri hakkında fikir verebilir, ancak bu, nispeten yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip örnekleme gerektirir.
Genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörleri (GECI'ler), canlı hücre sistemlerinde sürekli örnekleme için güçlü araçlardır6. En yaygın kullanılan GECI'lerden bazıları, GCaMPs7 olarak bilinen GFP bazlı kalsiyuma duyarlı floresan proteinlerdir. Kanonik GCaMP, üç farklı protein alanının bir birleşimidir: dairesel olarak permütasyonlu bir GFP (cpGFP), kalmodulin ve M136. Kalmodulin alanı, kalsiyumun bağlanması üzerine bir konformasyon değişikliğine uğrar ve M13 ile etkileşimine izin verir. Kalmodulin-M13 etkileşimi, cpGFP'de, uyarma üzerine floresan emisyonunu artıran konformasyonel bir değişikliğe neden olur. Bu nedenle, kalsiyum konsantrasyonundaki bir artış, GCaMP floresan yoğunluğundaki bir artışla ilişkilidir. Bu sensörler sitozolik olabilir veya belirli organellerihedefleyebilir 8.
Çoğu dokuya benzer şekilde, kalsiyum gastrointestinal epitel içindeki çeşitli işlevleri düzenler. Bağırsak epiteli, besin ve sıvı emilimi için ayrılmaz bir parçadır, ancak aynı zamanda patojen istilasını veya toksik hakaretleri önlemek için sıkı bir bariyer ve bağışıklık arayüzü oluşturmalıdır. Kalsiyuma bağımlı yollar bu hayati fonksiyonların neredeyse tamamını etkiler 9,10,11. Bununla birlikte, bağırsak epiteli içindeki kalsiyum sinyali, terapötik bir hedef olarak umut verici potansiyele sahip, yeterince keşfedilmemiş bir sınır olmaya devam etmektedir. Bağırsak epitelindeki kalsiyum dinamiklerinin in vivo olarak izlenmesi zorluklar sunmaya devam ederken, insan bağırsak organoidleri (HIO'lar) deney için uyarlanabilir bir ex vivo sistem sunar12. HIO'lar, insan bağırsak kök hücrelerinden türetilen 3 boyutlu (3D) sferoidlerdir ve farklılaşma üzerine, doğal bağırsak epitelinin hücresel çeşitliliğinin çoğunu özetler12.
Bu protokol, GECI'leri eksprese eden HIO'ları tasarlamak ve daha sonra tasarlanmış HIO'ları canlı hücreli kalsiyum görüntüleme için tek katmanlar olarak hazırlamak için kapsamlı yöntemleri açıklar. Kalsiyum sinyalizasyonunu bozan patolojik bir manipülasyon örneği olarak viral enfeksiyonu sunar ve bu değişiklikleri ölçmek için analitik bir yaklaşım sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>5408137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL conical tubes</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>0553859A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge needle</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>1482113D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycocytic&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>FisherScientific&#160;</td>
			<td>BP1600100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>543979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorobrite</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>35050079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>35050079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epidermal growth factor</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>HZ-1326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentivirus</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td>(variable)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosceicen</td>
			<td>356231/CB40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>TR1003G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S70767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP151100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme, no phenol red</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>NC9811754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live calcium imaging of virus-infected human intestinal organoid monolayers using genetically encoded calcium indicators

Kalsiyum sinyali, hemen hemen her dokunun ayrılmaz bir düzenleyicisidir. Bağırsak epiteli içinde kalsiyum, salgı aktivitesinin, aktin dinamiklerinin, inflamatuar yanıtların, kök hücre proliferasyonunun ve diğer birçok karakterize edilmemiş hücresel fonksiyonun düzenlenmesinde rol oynar. Bu nedenle, bağırsak epiteli içindeki kalsiyum sinyal dinamiklerinin haritalanması, homeostatik hücresel süreçler hakkında fikir verebilir ve çeşitli uyaranlara benzersiz tepkileri ortaya çıkarabilir. İnsan bağırsak organoidleri (HIO'lar), bağırsak epitelini incelemek için yüksek verimli, insan kaynaklı bir modeldir ve bu nedenle kalsiyum dinamiklerini araştırmak için yararlı bir sistemi temsil eder. Bu makale, HIO'ları genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler) ile kararlı bir şekilde dönüştürmek, canlı floresan mikroskobu gerçekleştirmek ve kalsiyum sinyallerini anlamlı bir şekilde karakterize etmek için görüntüleme verilerini analiz etmek için bir protokolü açıklamaktadır. Temsili bir örnek olarak, 3 boyutlu HIO'lar, yeşil floresan protein bazlı sitozolik bir GECI olan GCaMP6'ları stabil bir şekilde eksprese etmek için lentivirüs ile dönüştürüldü. Tasarlanan HIO'lar daha sonra tek hücreli bir süspansiyona dağıtıldı ve tek katmanlar olarak tohumlandı. Farklılaşmadan sonra, HIO tek tabakaları rotavirüs ile enfekte edildi ve/veya kalsiyum yanıtını uyardığı bilinen ilaçlarla tedavi edildi. Sıcaklık kontrollü, nemlendirilmiş canlı görüntüleme odası ile donatılmış bir epifloresan mikroskobu, enfekte olmuş veya ilaçla tedavi edilmiş tek tabakaların uzun süreli görüntülenmesine izin verdi. Görüntülemenin ardından, elde edilen görüntüler ücretsiz olarak kullanılabilen analiz yazılımı ImageJ kullanılarak analiz edildi. Genel olarak, bu çalışma HIO'larda hücresel sinyallemeyi karakterize etmek için uyarlanabilir bir boru hattı oluşturur.

Calcium is a widely conserved second messenger that plays a critical role in regulating cellular physiology1. Given its strong charge, small size, and high solubility in physiological conditions, calcium is an ideal manipulator of protein conformation. This makes calcium a powerful means to transduce electrochemical signals into enzymatic, transcriptional, or post-transcriptional alterations. The strict calcium concentration gradients across the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes create a high driving force that allows for rapid changes in cytosolic calcium concentration. Multiple mechanisms, including both buffering and active transport, tightly maintain this gradient. While necessary for normal cellular functions, this maintenance is energetically expensive, making it particularly susceptible in states of stress 2.
As such, dysregulation of calcium within the cytosol is a near-universal signal of many kinds of cellular stress. Metabolic disturbances, toxins, pathogens, mechanical damage, and genetic perturbations can all disrupt calcium signaling. Regardless of the stimulus, on a whole-cell level, sustained, uncontrolled rises in cytosolic calcium can promote apoptosis and&#160;eventually necrosis3,4. Alterations in cytosolic calcium levels of lower amplitude or higher frequency, however, have varying effects2. Likewise, the outcomes of calcium fluctuations may differ based on the spatial microdomain in which they occur5. Monitoring calcium levels can&#160;therefore offer insight into dynamic signaling processes, but this requires sampling with relatively high temporal and spatial resolution.
Genetically encoded calcium indicators (GECIs) are powerful tools for continuous sampling in live-cell systems6. Some of the most widely used GECIs are GFP-based calcium-responsive fluorescent proteins known as GCaMPs7. The canonical GCaMP is a fusion of three distinct protein domains: a circularly permuted GFP (cpGFP), calmodulin, and M136. The calmodulin domain undergoes a conformation change upon binding calcium, allowing its interaction with M13. The calmodulin-M13 interaction induces a conformational change in the cpGFP that increases its fluorescent emission upon excitation. As such, an increase in calcium concentration correlates with an increase in GCaMP fluorescence intensity. These sensors can be cytosolic or targeted to specific organelles8.
Similar to most tissues, calcium regulates a variety of functions within the gastrointestinal epithelium. The intestinal epithelium is integral for nutrient and fluid absorption but also must form a tight barrier and immune interface to avoid pathogen invasion or toxic insults. Calcium-dependent pathways influence nearly all of these vital functions9,10,11. However, calcium signaling within the intestinal epithelium remains an underexplored frontier with promising potential as a therapeutic target. While monitoring calcium dynamics within the intestinal epithelium in vivo continues to present challenges, human intestinal organoids (HIOs) offer an adaptable ex vivo system for experimentation12. HIOs are 3-dimensional (3D) spheroids derived from human intestinal stem cells and, upon differentiation, recapitulate much of the cellular diversity of the native intestinal epithelium12.
This protocol describes comprehensive methods to engineer HIOs that express GECIs and then prepare engineered HIOs as monolayers for live-cell calcium imaging. It offers viral infection as an example of a pathologic manipulation that disrupts calcium signaling and provides an analytic approach to quantify these changes.

Yazar Spotlight: Bağırsak Epitel Sinyalizasyonunun Viral Bozulmasının Araştırılması – Araştırma Öngörüleri ve Gelecekteki Yönergeler 

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi

Şekil 1A , GCaMP6'ları stabil bir şekilde ifade etmek için dönüştürülmüş 3 boyutlu insan bağırsak organoidlerini içeren bir BMM kubbesini göstermektedir. Şekil 1B , tohumlamadan 24, 48 ve 72 saat sonra tek tabaka olarak yeniden kaplanan aynı organoid hattını göstermektedir. GCaMP6'ların işlevini doğrulamak için, tek tabaka 4 dakika boyunca her 2 saniyede bir floresan mikroskobu ile görüntülendi ve ~20 saniye sonra ortama 100 nM ADP ekl...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Viral Disruption of Intestinal Epithelial Signaling â€“ Research Insights and Future Directions at JoVE.com

Bu protokol, virüsle enfekte insan bağırsak organoidlerinde kalsiyum görüntüleme yapmak için bir yaklaşımı açıklar ve analize bir yaklaşım sunar.

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

Çalışmamızla, virüslerin bağırsak epitelinde sinyalleşmeyi nasıl bozduğunu anlamayı amaçlıyoruz. Özellikle, virüsle enfekte olmuş hücrelerin, komşu enfekte olmamış hücrelerin patogeneze katkıda bulunmak için nasıl düzensizleştiğini anlamakla ilgileniyoruz. Yakın zamanda, rotavirüs ile enfekte olmuş hücrelerin, komşu enfekte olmamış hücreleri düzensizleştiren ve viral yayılmayı kolaylaştıran ve hastalığı şiddetlendiren ADP darbeleri salgıladığını keşfettik.Kalsiyum görüntüleme sinirbilim gibi alanlarda çok popüler olsa da, epitel biyolojisi veya virolojiyi incelemek için yaygın olarak kullanılmamıştır. Bu protokol, kalsiyum sinyalizasyonunu ve canlı virüsle enfekte epitel dokusunu incelemek için mevcut teknolojileri ve model sistemleri uyarlamak için bir yaklaşım sunar. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini ifade etmek için organoidleri tasarlayarak, yaklaşımımız, insan bağırsak epitelinin hücresel çeşitliliğini özetleyen bir model sistemde tutarlı, tekrarlanabilir uzun vadeli bir görüntülemeye izin verir.Virüs kaynaklı parakrin purinerjik sinyallemenin hem konakçı hem de virüs için etkilerini anlamayı amaçlıyoruz. Gelecekteki çalışmalarımız, bu tür sinyallerin diğer virüsler arasında geniş çapta korunup korunmadığını ve etkilerin benzer olup olmadığını da belirleyecektir.

live-calcium-imaging-virus-infected-human-intestinal-organoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

851 Görüntüleme.  Baylor College of Medicine. Çalışmamızla, virüslerin bağırsak epitelinde sinyalleşmeyi nasıl bozduğunu anlamayı amaçlıyoruz. Özellikle, virüsle enfekte olmuş hücrelerin, komşu enfekte olmamış hücrelerin patogeneze katkıda bulunmak için nasıl düzensizleştiğini anlamakla ilgileniyoruz. Yakın zamanda, rotavirüs ile enfekte olmuş hücrelerin, komşu enfekte olmamış hücreleri düzensizleştiren ve viral yayılmayı kolaylaştıran ve hastalığı şiddetlendiren ADP darbeleri salgıladığın...

Video: Yazar Spotlight: Bağırsak Epitel Sinyalizasyonunun Viral Bozulmasının Araştırılması – Araştırma Öngörüleri ve Gelecekteki Yönergeler 

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory activity, actin dynamics, inflammatory responses, stem cell proliferation, and many other uncharacterized cellular functions. As such, mapping calcium signaling dynamics within the intestinal epithelium can provide insight into homeostatic cellular processes and unveil unique responses to various stimuli. Human intestinal organoids (HIOs) are a high-throughput, human-derived model to study the intestinal epithelium and thus represent a useful system to investigate calcium dynamics. This paper describes a protocol to stably transduce HIOs with genetically encoded calcium indicators (GECIs), perform live fluorescence microscopy, and analyze imaging data to meaningfully characterize calcium signals. As a representative example, 3-dimensional HIOs were transduced with lentivirus to stably express GCaMP6s, a green fluorescent protein-based cytosolic GECI. The engineered HIOs were then dispersed into a single-cell suspension and seeded as monolayers. After differentiation, the HIO monolayers were infected with rotavirus and/or treated with drugs known to stimulate a calcium response. An epifluorescence microscope fitted with a temperature-controlled, humidified live-imaging chamber allowed for long-term imaging of infected or drug-treated monolayers. Following imaging, acquired images were analyzed using the freely available analysis software, ImageJ. Overall, this work establishes an adaptable pipeline for characterizing cellular signaling in HIOs.

This protocol describes an approach for performing calcium imaging in virus-infected human intestinal organoids and offers an approach to analysis.