Başlamak için, hidrojel kapsüllü hücrelerin 24 oyuklu plakada kültürlendiği oyuklardan ortamı aspire edin. 500 mikrolitre PBS'yi doğrudan hidrojelleri içeren her bir oyuğa pipetleyerek hidrojelleri durulayın ve ardından PBS'yi nazikçe aspire edin. 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, 24 oyuklu plakadaki sferoidleri sabitlemek için oyuk başına 500 mikrolitre fiksatif çözelti ekleyin.
Fiksatif solüsyonu pipetlemeden ve belirlenmiş bir atık kabına atmadan önce fiksatifin jelleri oda sıcaklığında 30 dakika ıslatmasına izin verin. Daha sonra, hidrojelleri daha önce gösterildiği gibi PBS ile üç kez durulayın. Hemen kullanılmazsa, hidrojelleri bir haftaya kadar dört santigrat derecede oyuk başına 500 mikrolitre PBS'de saklayın.
Hidrojel kapsüllü hücrelerde boyama yapmak için önce nestin ve SOX2 için uygun şekilde seyreltilmiş primer antikorlar hazırlayın. PBS'yi kuyucuklardan aspire ettikten sonra, her bir oyuğa 50 mikrolitre seyreltilmiş antikor ekleyin. Hücreleri tamamen boyamak için 24 saat boyunca antikorlarla inkübe edin.
Ardından 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak boyama solüsyonunu çıkarın ve atıkları uygun şekilde atın. Hidrojelleri üç kez duruladıktan sonra, görüntülemeden veya hemen görüntülemeden önce iki haftaya kadar dört santigrat derecede PBS'de saklayın. Görüntüleme şeffaflığını artırmak için lekeli sferoidi temizlemek için, önce PBS'yi her bir oyuktan aspire edin.
Daha sonra sferoidlere her biri 90 dakika boyunca oyuk başına 500 mikrolitre% 20% 40 ve% 80 formamid ile sırayla muamele edin. Son olarak, görüntülemeden önce hidrojelleri 24 saat boyunca %100 formamid içinde inkübe edin. Sferoidler, değişen z-yığını derinliklerinde görüntülendi ve z-yığını içindeki her yerde hücre canlılığı değerlendirmesine izin verildi.
Küresel yığını kullanan maksimum projeksiyon, her konumdaki en yüksek ışık yoğunluğu noktasını temsil etti ve tek bir görüntüde basitleştirildi. Boyanmış sferoidlerin temsili görüntüleri, kendini yenileyen transkripsiyon faktörü SOX2'nin çekirdekte DAPI ile birlikte lokalize olduğunu ortaya koydu. Aksine, kök hücre işaretleyici nestin hücrelerin tamamında mevcuttu.
Jelsiz serbest yüzen sferoid ile kapsüllenmiş sferoidler arasında, muhtemelen kullanılan PEG jelinin eylemsizliğinden dolayı hiçbir fark yoktu. Optik kesitlerin yaklaşık 90 mikronluk temizlenmiş ve temizlenmemiş sferoidlere temsili görüntüleri, temizleme yapıldığında, sferoid çekirdeğin, temizlenmemiş bir sferoide kıyasla yaklaşık 30 mikron daha derin görüntülenebildiğini ortaya koydu.
