Başlamak için, transgenik larvaları cam tabanlı bir mikro kuyu kabına düşük erime noktalı agaroza gömün. Çanağı ters çevrilmiş mikroskopta mikroskobik sahneye yerleştirin. Ablasyon için istenen bölgeyi görüş alanının ortasına yerleştirin ve odaklayın.
Operkülün tüm genişliğini görüntülemek için Z yığını ayarlarını seçin. Ablasyondan önce ilgilenilen ameliyat alanını görüntüleyin. Ardından, seçilen bir 2B düzlemde 25 mikrometre çapında dairesel bir bölge çizin.
İlgilenilen bölgeyi veya ROI aracını kullanarak operatöre odaklanın. Ablasyonu gerçekleştirmek için, objektif olmadan ölçülen ablasyon gücünü 10 saniyelik bir süre boyunca 450 miliwatt'a uygulayın. Seçilen alanı iki fotonlu lazere maruz bırakın.
Ablasyondan sonra, ablasyondan önce kullanılanla aynı Z-yığınını aynı ayarlarla görüntüleyerek ablasyonu yapısal olarak onaylayın. Forseps veya diseksiyon iğnesi kullanarak, larvaları düşük erime noktalı agarozdan dikkatlice çıkarın. İlk olarak, larvaları kaplayan bir agaroz tabakasını çıkarın.
İkinci olarak, agarozu larvalarla doğrudan temas halinde çıkarın. Larvaları saf E3 ortamı içeren bir tabağa geri koyun. Lezyondan dört veya altı saat sonra, aynı mikroskopta aynı ayarlarda agaroza gömülü larvaları kullanarak operkül alanını yeniden görüntüleyin.
Görüntüleri Fiji'de işledikten sonra, hücrelerin üst üste binmesi durumunda Nükleer etiketli hücreleri veya alanı ölçerek ölçün. Alanı ölçmek için makrofajları kapsayan bir maske oluşturun. Görüntü, Ayarlama, Eşik Aracını kullanın, bir yatırım getirisi oluşturun ve parçacıkları analiz edin.
Ardından alanı ölçün. Uygun yazılımı kullanarak ölçüm sonuçlarını çizen grafikler oluşturun. Döllenmeden altı gün sonraki larvalarda ablasyondan altı saat sonra ablasyonlu operkül bölgesinde önemli bir makrofaj birikimi tespit edildi.
Döllenmeden dört gün sonra larvalarda, lezyondan dört saat sonra makrofaj sayısı artmıştır. Makrofaj sayısı ve alanı, lezyondan dört saat sonra, ablasyonsuz duruma göre artmıştır.
