Yazarlar David Langenau cömertçe akvaryum yer verdiğiniz için teşekkür etmek istiyorum; Eric Stone, John C. Moore ve Qin Tang için Zebra balığı bakım ve reaktifler ve Anne Robertson ve Elliott Hagedorn burada kullanılan Zebra balığı zorlanma tedarik için Leonard Zon'ın Laboratuarı'ndan yardım. Onlar da Octavio Hurtado photolithographic teknikleri tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorum. FE Shriner'ın hastaneden Arkadaş grupları tarafından çocuk ve Amerikan Avustralya Derneği için finanse edildi. Bu eser NIH tarafından finanse edildi GM92804 verin.

Larva mikroenjeksiyon Protokolü 2011N000127 altında Massachusetts genel hastane alt Komisyonu araştırma hayvan bakım tarafından kabul edildi.
1. cihaz imalat
Not: Burada açıklanan fotolitografi maskeleri tasarlamak için kullanılan tüm bilgisayar destekli çizim (CAD) dosyaları (şekil 1) elde edilebilir için download. Malzemeler tablo bağlantıları için bkz.
<ol><li>Bir sınıf 1.000 temiz oda standart photolithographic teknikleri7kullanarak ana kalıp gofret imal. Mikroyapı diziler ve kanallar için üreticinin yönergelerine göre sıralı olarak 3 ayrı maskeleri kullanarak 3 kat epoksi esaslı negatif fotorezist desen: 100 µm sığ özellikleri için orta özellikler için 200 µm ve 400 µm derin özellikleri. Görüntü aygıtı için sığ ve derin özellikleri için 600 µm 400 µm kullanarak desen iki katmanlı.</li>
	<li>Tamamlanan gofret 15 cm Petri kabına (Şekil 2) döküm için tabanına kaydet.</li>
</ol>2. Microstructured yüzey diziler - PDMS hazırlanması
<ol><li>Kullanılabilir aygıtlar açmak için ana gofret bir kalıp olarak kullanarak polydimethylsiloxane (PDMS), atıldı. 50 g PDMS monomer başlatıcı 5 g ile birleştirin ve plastik bir çatalla yemek ağırlığında bir plastik iyice karıştırın.</li>
	<li>Karışımı dikkatle kalıp dökün.</li>
	<li>Degas, 16-25 inHg (54-85 kPa) 1 h için bir vakum desiccator içinde.</li>
	<li>PDMS iyileştirmek için en az 3 h için 65 ° C'de pişirin. PDMS için sert ama esnek sağlam bir tedavi.</li>
	<li>Dikkatle cihazın bir neşter bisturi ucu ve gofret yüzey arasındaki temas korumak emin olmak istedim, kullanarak ana gofret kesti. Forseps kullanarak, gofret ve temiz bir 10 cm Petri dish, (şekil 3) özelliği tarafa aktarmak uzak PDMS yineleme kabuğu.</li>
	<li>Cihazın 35 için bir plazma fırın kullanarak oksijen plazma ile tedavi hydrophobicity azaltmak için s.</li>
	<li>168 mg/L etil 3-aminobenoate methanesulfonate (MS-222, pH 7.5) içeren Zebra balığı embriyo ile orta (E3) kapsar. Herhangi bir kabarcıklar akan tarafından daha derin özelliklerinden bir transfer pipet kullanarak aygıt yüzey üzerinde su kaldır.</li>
</ol>3. Microstructured yüzey diziler - özel hazırlanması
<ol><li>Bir negatif PDMS kalıp yapmak, oksijen plazma PDMS cihazla tedavi.</li>
	<li>
1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) silane buharı8inert bir yüzey oluşturmak için PDMS cihazla tedavi. Kısaca:
	<ol>
<li>Bir duman başlık içinde bir vakum odasında özelliği-yan-up tedavi olmak için PDMS yerleştirin.</li>
		<li>PDMS yanındaki küçük bir açık cam veya alüminyum çanak yerleştirin ve dikkatle PFDTS 200 µL pipet (%98 silane) çanak içine. Dikkat: PFDTS silane son derece kırılgandır, şiddetle su ile reaksiyona girer, yanıcı ve kişinin üzerine şiddetli deri ve göz hasara neden olur. Okuma MSDS ayrıntılı kullanmadan önce.</li>
		<li>Vakum odası kapatır ve vakum 15-30 dakika, ya da PFDTS silane tamamen buharlaşıp kadar uygular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cihazın bir Petri ve 2.1 2.3 adımda anlatıldığı gibi hazırlanan taze PDMS için bir kalıp olarak kullanın.</li>
	<li>En az 3 h için 65 ° C'de pişirin sonra tedavi aygıttan taze PDMS tüm katmanın soyma ve taze kabında yerleştirin. Bu o zaman olumsuz bir kalıp olarak özel oyuncular için kullanılabilir.</li>
	<li>Özel hazırlamak için özel tamamen eriyene kadar düşük jelleşme sıcaklık özel E3 içinde mikrodalga bir de %2 çözümünün kaynatın.</li>
	<li>Sıcak özel PDMS negatif kalıp dökün ve aygıt üzerinde bir aktarma pipet ile özellikleri tarafından akan sıcak özel kapsayan özel herhangi bir kabarcıklar kaldırmak.</li>
	<li>Kabarcıklar kaldırılır sonra 4 ° C özel ayarlamak için buzdolabında bekletin.</li>
	<li>El ile üzerinden PDMS altında bozulmayı tarafından olumsuz PDMS kalıp özel blok kaldırmak için bir yeni Petri kabına ve MS-222 içeren ıslak E3 ile özel blok aktarmak.</li>
</ol>4. görüntü aygıtları PDMS hazırlanması
<ol><li>Kullanılabilir aygıtlar açmak için PDMS ana gofret bir kalıp olarak kullanarak, atıldı. 50 g PDMS monomer başlatıcı (2.1 adımda kullanılan ile aynı) ve karışımı iyice bir plastik plastik Çatalla yemek ağırlığında 5 g ile birleştirir.</li>
	<li>Karışımı dikkatle kalıp dökün.</li>
	<li>Degas, 16-25 inHg (54-85 kPa) 1 h için bir vakum desiccator içinde.</li>
	<li>PDMS iyileştirmek için en az 3 h için 65 ° C'de pişirin. PDMS için sert ama esnek sağlam bir tedavi.</li>
	<li>Aygıtların Master gofret kesme ve 1.5 mm yumruk kullanarak bağlantı noktaları yumruk.</li>
	<li>Tedavi de aygıtlar ve bir 6-şey cam-alt plaka ile oksijen plazma için 35 s, 2.6. adımda açıklandığı gibi.</li>
	<li>Bir aygıt özelliği yan-aşağı her cam coverslip 6-şey plaka için 10 dk 85 ° C ocağın üzerine yerleştirerek bond. Not: başarılı bağ onaylamak için gümrüklü aygıtı forseps kullanarak bir yana firma basınç uygulayın. Cihazın cam coverslip bağlı kalmalıdır.</li>
</ol>5. Zebra balığı kültür
<ol><li>Kültür Zebra balığı embriyolar için 2 dpf standart teknikleri3kullanarak.</li>
	<li>Dechorionate embriyo forseps veya 1 mg/mL proteaz kullanarak (bkz: malzemeler tablo)3 yükleme üzerine cihaz, onları düzeltmek izin vermek için önce en az 30-60 dakika karıştırın.</li>
	<li>E3 (168 mg/1 mL 25 X ekleyerek M) MS-222 (pH 7.5) hisse senedi çözüm kendi kabında kullanarak embriyo uyuşturan.</li>
</ol>6. yönünü Microstructured yüzeyde - Divot diziler Zebra balığı
<ol><li>Öyle ki bu embriyoların daha kolay manipülasyon sağlar E3 ince (1-2 mm) tabakası ile kaplıdır, Petri kabına 2.7 (şekil 3A) adımda PDMS bloğundan hazırlayın.</li>
	<li>Embriyo (genellikle koşul başına 10-20) gerekli sayıda transfer pipet kullanarak PDMS blok yüzey aktarın.</li>
	<li>Embriyolardan aracını kullanarak (saç döngüsü veya benzer), embriyo microstructured efendim (şekil 3A) itin. Efendim kullanımı dorsal ve ventral yönler için özellikle uygundur. Not: Efendim ile sıkı bir için (dorsal ve ventral) uygun, blok paralel olarak divot yüzeyinde embriyo konumlandırma ve sonra onları bir saç döngüsü kullanarak pozisyona haddeleme deneyin. Divot daha derin iterek onları istikrarlı tutmaya yardımcı olacaktır.</li>
</ol>7. yönünü Microstructured yüzeyde - Zebra balığı Microstructured kanalları
<ol><li>E3 E3 düzeyi sokağın kenarına düşüyor ama rezervuar ve kanalları ve PDMS üzerinde ince bir tabaka hala mevcuttur kadar transfer pipet kullanarak microstructured kanalları (şekil 3B) desenli PDMS bloktan çizin.</li>
	<li>10 embriyo 5.3 adımından kenar taşması değil dikkatli olmak bir transfer pipet kullanarak rezervuar aktarın.</li>
	<li>Saç döngüsü kullanarak, uygun kanalının girişinde huni içine her embriyo işlemek ve embriyo başkanı doğru kanal ve kanal girerken embriyonun uygun yönlendirmeyi vardır öyle ki yönlendirmek.</li>
	<li>Her embriyo yerde tutmak için yardımcı kanal duvarlarında hikayedir microfeatures ulaşıncaya kadar bir saç döngüsü kullanarak kanal aşağı kaydırın. Microstructured kanalları kullanılması özellikle yanal yönlendirme için tavsiye edilir. Not: mikroenjeksiyon sırasında kayma embriyo azaltmak için rezervuar E3 çizerek yüzey gerilimi miktarını ayarlamayı deneyin.</li>
</ol>8. mikroenjeksiyon Zebra balığı
<ol><li>
Mikroenjeksiyon iğne hazırlayın.
	<ol>
<li>Micropipette çektirme yukarıda açıklanan4kullanan borosilikat cam microcapillary iğne yapmak. Elde edilen iğneler yaklaşık 10 mm Konik uzunluğu ile bir ucunda bir noktaya konik.</li>
		<li>Bu durumda 100 nM chemoattractant enjekte edilir çözüm hazırlamak (N-Formylmethionine-leucyl-fenilalanin (fMLP) veya Leukotriene B4 (LTB4)) ve 100 70 kDa rodamine dextran izleyici PBS nM.</li>
		<li>Çözüm 5 µL ince konik bir pipet kullanarak iğne yük ipucu (malzeme tabloya bakın).</li>
		<li>İğne manyetik bir stand üzerine monte ve bir picopump microinjector bağlı bir micromanipulator içine monte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>45 ° açıyla iğne ucu konik ucunu Forseps ile pinching tarafından kır.</li>
	<li>Enjeksiyon bolus boyutu 1 ayarlaması nL picopump denetleyicisi enjeksiyon zamanında ayarlayarak.</li>
	<li>Mikroenjeksiyon iğne açısını ayarlayın. Bir iğne 45 °'in Embriyolardan denetleyicisinde genellikle embriyo uzunluğu paralel iğne ile iyi bir başlangıç noktası açısıdır. Bir dik açı embriyo yanal hareketi mikroenjeksiyon sırasında en aza indirmek için kullanılabilir.</li>
	<li>İğneyi yakın Petri kabına sol el ile ve hakkı olan iğne micromanipulator kontrol, mikroenjeksiyon, bu durumda ve vezikül hedef siteye mümkün olduğunca getir. Not: Ve vezikül dikdörtgen organ iki küçük ayrı karanlık dikdörtgen yapı (otoliths) içeren göz posterior olarak tespit edilebilir.</li>
	<li>Embriyolardan denetleyicisi kullanarak, iğne ucu vezikül içinde öyle ki (Bu durumda ve vezikül) hedef doku nüfuz ve picopump ayak pedalı anahtarı kullanarak önceden oluşturulmuş hacim enjekte. Not: doku penetrasyonu direnir, Embriyolardan denetleyicisi topuzu hafifçe dokunarak deneyin.</li>
	<li>Embriyo serbest bırakmak için bir transfer pipet kullanarak yukarıdan aşağıya doğru veya öyle ki embriyo çevreleyen E3 yayımlanan çanak dönen yüzey üzerinde E3 akışı.</li>
	<li>Embriyo transferi pipet kullanarak MS-222 E3 kurtarma yemek için aktarın.</li>
</ol>9. embriyo görüntüleme cihazı PDMS kullanarak tarama
<ol><li>Adım 4.7, akan E3 (+ MS-222) aygıttan bağlantı noktası üzerinden Başbakan. Bu yapılabilir bir 1000 µL pipet ya da dar uçlu transfer pipet kullanarak.</li>
	<li>Cihazın kaplı kadar iyi E3 + MS-222 ile doldurun.</li>
	<li>4 enjekte embriyo transferi pipet de her kullanarak adım 8.7 sunmak. Embriyo (Adım 5.3) yükleme öncesinde 1-2 min için E3 + MS-222 kuluçka tarafından istenirse önceden imzalat olabilir.</li>
	<li>Embriyolardan aracını kullanarak (saç döngüsü veya benzer), embriyoların istenen yönde (kuyruk-ilk veya kafa ilk, kullanılan aygıt bağlı olarak) görüntüleme kanal girişlerinde yönlendirmek ve bunları kısmen cihazın (şekil 4A) içine itin. Bu cihazın içine eşit çizerken yardımcı olacaktır.</li>
	<li>E3 embriyo kanalları (şekil 4B) görüntüleme için doğru yönde içine çizilmiş kadar 1.000 µL pipet veya transfer pipet kullanarak bağlantı noktası aygıtı aracılığıyla çizmek. Not: embriyo yakalama noktası geçmiş değil emmek için dikkatli olun, bu embriyolar zarar ve yönelimleri alter.</li>
	<li>İyi-plaka (şekil 4 c) görüntüleme için mikroskop aktarın.</li>
	<li>
Ters bir floresan mikroskop kullanarak görüntü.
	<ol>
<li>Büyütme uygun lens seçerek ayarlayın. 10 X genellikle Zebra balığı nötrofil geçiş görüntüleme için yararlı bir büyütme'dur.</li>
		<li>NET, ama değil doymuş her sinyal ışık kaynağı yoğunluğu ve pozlama süresi her kanal için ayarlanır.</li>
		<li>Esir alma imge her kanal için. Burada, biz yeşil flüoresan protein kullanılır (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas kırmızı (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) ve kanalları aktarılır. Çok kanallı görüntüler sonrası işleme sırasında kombine edilebilir (şekil 4B-ı).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Novel+Cancer+Therapies+Using+Chemical+Genetics+and+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish.</a> Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon. (2000).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Ellett, F., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructured+Surface+Arrays+for+Injection+of+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).</li>
<li>Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Entrapment+By+Restriction+Array+%28ZEBRA%29+device%3A+a+low-cost%2C+agarose-free+zebrafish+mounting+technique+for+automated+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging.</a> Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).</li>
<li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+Variable+Height+Photolithography+for+Valved+Multilayer+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li>
<li>Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924424712000581">Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique.</a> Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).</li>
<li>Bhuiyan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii+phenylacetic+acid+metabolism+influences+infection+outcome+through+a+direct+effect+on+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).</li>
<li>Henry, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhagoSight%3A+an+open-source+MATLAB%C2%AE+package+for+the+analysis+of+fluorescent+neutrophil+and+macrophage+migration+in+a+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">PhagoSight: an open-source MATLAB® package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model.</a> PloS one. 8 (8), e72636(2013).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dynam%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Hemmilä, S., Cauich-Rodríguez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016943321201094X">Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces.</a> Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).</li>
<li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li>
<li>Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish-on-a-chip%3A+microfluidics+for+zebrafish+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research.</a> Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).</li>
<li>Wielhouwer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryo+development+in+a+microfluidic+flow-through+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system.</a> Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).</li>
<li>Shen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+student+team+in+a+University+of+Michigan+biomedical+engineering+design+course+constructs+a+microfluidic+bioreactor+for+studies+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development.</a> Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+on+a+chip%3A+a+novel+platform+for+real-time+monitoring+of+drug-induced+developmental+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity.</a> PLoS One. 9 (4), e94792(2014).</li>
<li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+embryo+array+for+automated+trapping%2C+immobilization+and+microperfusion+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos.</a> PLoS One. 7 (5), e36630(2012).</li>
<li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400512012154">Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays.</a> Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+brain-wide+activity+in+awake+and+drug-responsive+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates.</a> Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).</li>
<li>Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+in+a+microfluidic+format+using+flexible+and+compliant+channels+and+electroosmotic+dosage+control%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control.</a> Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Burada, nasıl kullanılacağını açıklar biz son zamanlarda 2 dpf Zebra balığı mikroenjeksiyon5kolaylaştırmak ve basit özel ücretsiz montaj aygıt için uygun görüntüleme embriyo tanıtmak için geliştirdiler. Bu araçlar imalat Zebra balığı teknikleri için yararlı aygıt için photolithographic teknikleri yardımcı programı vurgulayın.
MSA aygıtları özellikle yararlı için hücreleri veya parçacıklar enjeksiyon eğilimli toplama mikroenjeks...

Zebra balığı biyolojinin temel gelişimsel büyük ölçekli için genetik çalışmalar birçok alanları için güçlü bir model olarak ortaya çıktı ve1,2kimyasal ekranlarında. Basit, kolay kullanımı, geliştirilmesi için ticari olarak açmıştır tek hücreli zigot içine genetik materyal mikroenjeksiyon gen overexpression, nakavt, CRISPR/Cas9 mutagenesis ve transgenesis gibi rutin genetik manipülasyon itimat Yönlendirme ve yumurta enjeksiyon3için sabitleme için araçlar. Nakli ve enfeksiyon, gibi diğer yaklaşımlar genellikle mikroenjeksiyon sonraki sahne embriyo ve daha büyük ölçüm kapiller iğneler4kullanarak larva gerektirir. Ancak, hedef doku iterek veya embriyo haddeleme olmadan nüfuz daha zor olduğu gibi daha büyük gauge iğne kullanımı önemli teknik sorunlar, sunar. Bu koşullar altında işlem sırasında kurutma kaçınmak zor olsa embriyo stabilize etmek için gereken uygun su gerginlik ve embriyo elde etmek hedef doku içine enjeksiyon için ideal odaklı olabilir.
Mikroenjeksiyon, enjekte embriyo başarıyla enjekte seçin ve başlangıç zaman noktası görüntülerini yakalamak için ekran yararlıdır. Bu sorunları ele almak üzere, çeşitli yönleriyle mikroenjeksiyon5için hem hızlı görüntü tabanlı tarama sonrası enjeksiyon için 2 dpf embriyo dengelemeye yardımcı microstructured cihazları bir dizi geliştirdi.
Bu cihazlar içinde yeterli yapısal kararlılık elde etmek için photolithographic teknikleri kullanılmıştır. Mikroelektronik sanayi ve daha yakın zamanda yaygınlaştırılması mikrosıvısal imalat için yaygın olarak kullanılan, bu yaklaşımlardan 1-1000 µm, Zebra balığı embriyo ve larva manipülasyon için uygun bir ölçek uzanan dikey yapıları elde edebilirsiniz. Tüm aygıtlar kullanarak ucuz, fiziksel olarak sağlam, biyolojik olarak inert ve şeffaf olan polydimethylsiloxane (PDMS), fabrikasyon.
Microstructured yüzey diziler (MSAs) PDMS taşları desenli bir üst yüzeyi olarak biçimlendirilmiş, benzer şekilde özel bloklar halinde basit kanalları daha yaygın olarak kullanılan yumurta mikroenjeksiyon için. Sonrası enjeksiyon tarama için 6 görüntüleme aygıtları bir standart cam popolu 6-şey tabak içinde dizilmiş. Bu cihazlar embriyo kolay yükleme için tasarlanmış, kaldırma yordamı uygun görüntü tabanlı kurtarma kolaylaştırmak belirli embriyo izin verirken bu aygıtları daha daha kullanıcı dostu bir şekilde yaklaşımlar eleme daha önce tarafından geliştirilen Beebe laboratuvar6.

<table><tbody><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhsives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator</td></tr><tr><td>Low gelling temperature agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>For casting agarose devices</td></tr><tr><td>PFDTS silane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td>For casting of negative PDMS molds</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>To anesthetize zebrafish</td></tr><tr><td>Rhodamine Dextran 70,000 Da</td><td>ThermoFisher</td><td>D1818</td><td>To trace microinjections</td></tr><tr><td>Leukotriene B4 (LTB4)</td><td>Cayman Chemicals</td><td>20110</td><td>Neutrophil chemoattractant</td></tr><tr><td>N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3506-50MG</td><td>Neutrophil chemoattractant</td></tr><tr><td>15 cm Petri dish</td><td>Fisher scientific</td><td>08-757-148</td><td>For Casting from the master wafer</td></tr><tr><td>Glass-bottom 6-well plates</td><td>MatTek</td><td>P06G-0-20-F</td><td>For imaging devices</td></tr><tr><td>Borosilicate glass microcapillaries</td><td>World Scientific Instruments</td><td>TW-100-4</td><td>For microinjection needles</td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z350796</td><td>For transferring zebrafish embryos</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Fisher scientific</td><td>E5242956003</td><td>For loading the microinjection needles</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 1.5 mm punch</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15111-15</td><td>To punch ports in PDMS imaging devices</td></tr><tr><td>No. 11 Scalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>For cutting PDMS</td></tr><tr><td>Dumont No. 5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-10</td><td>For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips</td></tr><tr><td>Marzhauser Micromanipulator</td><td>ASI</td><td>MM33-R</td><td>For manipulating microinjection needle</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>MSC</td><td>SPI - 87242624</td><td>For mounting micromanipulator</td></tr><tr><td>MPPI-3 Picopump controller</td><td>ASI</td><td>MPPI-3</td><td>To control microinjection volume and timing</td></tr><tr><td>EVOS inverted fluorescent microscope</td><td>ThermoFisher</td><td>EVOS FL</td><td>To image injected embryos</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>For visualizing microinjecion</td></tr><tr><td>AutoCAD software</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae

Zebra balığı ortaya çıkmıştır geniş çeşitli insan hastalıkları ve deneysel çalışmalar, artan bir dizi için yararlı bir araç güçlü bir model olarak büyük ölçekli kimyasal ve genetik ekranlar aracılığıyla temel gelişim biyolojisi kapsayan. Ancak, birçok deney, özellikle enfeksiyon ve xenograft modelleri, ilgili mikroenjeksiyon ve görüntüleme embriyo ve beceri ve uzmanlık gerektiren zahmetli tekniklerdir larva güveniyor. Hassas ve geçerli mikroenjeksiyon teknikleri-den geçerek artırmak için biz bir dizi yönlendirmek ve 2 gün sonrası döllenme (dpf), Zebra balığı embriyolar dengelemek için microstructured aygıtları önce menfez, dorsal veya yanal yönde geliştirdi yordam. Embriyo görüntülemede yardım için de paralel bir cam kapak notu karşı yanal olarak 4 Zebra balığı şark kanalları ile basit bir aygıt tasarlanmış. Birlikte, burada mevcut araçları Zebra balığı teknikleri optimizasyonu için yararlı aygıt oluşturmak için photolithographic yaklaşımlar etkinliğini göstermektedir.

Burada açıklanan yaklaşım geliştirme (şekil 1) ve photolithographic (Şekil 2) ve yumuşak tekniğinde (şekil 3) teknikleri kullanarak 2 dpf Zebra balığı ile kullanılacak cihazların üretim gösteriyor. Bu yöntem birçok tasarım yineleme ve değişiklikler hızlı test sağlar ve değişiklikler ve Mikroyapı boyutları diğer gelişim aşamasında Zebra balığı ile kullanılacak duru...

Watch this Scientific Journal Video about Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae at JoVE.com

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebra balığı embriyo ve larva mikroenjeksiyon birçok Zebra balığı modellerinde kullanılan çok önemli ama zorlu bir tekniktir. Burada, Zebra balığı mikroenjeksiyon ve görüntüleme için yönünü ve istikrar içinde yardım etmek için microscale araçlar bir dizi mevcut.

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital. Zebra balığı embriyo ve larva mikroenjeksiyon birçok Zebra balığı modellerinde kullanılan çok önemli ama zorlu bir tekniktir. Burada, Zebra balığı mikroenjeksiyon ve görüntüleme için yönünü ve istikrar içinde yardım etmek için microscale araçlar bir dizi mevcut.

Video: Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Biyomühendislik

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Gelişim Biyolojisi

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biyoloji

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Morfolino Oligonükleotidler bir Cerebroventricular Mikroenjeksiyon kullanarak Yetişkin Zebra balığı Beyin Gen İfade Mikromanipülasyon

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Nörobilim

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Zebra balığı larva geliştirilmiş deneysel manipülasyon için uzun vadeli canlı görüntüleme aygıtı

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

Low-cost Polyethylene Terephthalate Lamination Microfluidics Designs for Multiplexed Zebrafish Imaging

Zebrafish embryos are transparent and thus uniquely suited for noninvasive intravital imaging of fundamental processes, such as wound healing and immune cell migration. Microfluidic devices are used for entrapment to support long-term imaging of multicellular organisms, including zebrafish. However, the fabrication of these devices using soft lithography requires specialized facilities and competency in 3D printing, which may not be accessible to every lab. Our adaptation of a previously developed low-cost polyethylene terephthalate lamination method for constructing microfluidic devices increases accessibility by enabling design fabrication and iteration for a fraction of the technical investment of conventional techniques. We use a device made with this method, the Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing (RADISH), to accommodate drug treatment, manual wounding, and long-term imaging of up to four embryos in the same field of view. With this new design, we successfully capture gross morphological characteristics of the calcium&#160;signal around laser ablation and manual transection wounds for multiple embryos in the 2 h immediately following injury, as well as neutrophil recruitment to the wound edge for 24 h.

An innovative method for fabricating microfluidic devices using polyethylene terephthalate (PET) lamination significantly reduces the cost and complexity of entrapping and imaging multiple live zebrafish embryos.

Çoğullanmış Zebra Balığı Görüntüleme için Düşük Maliyetli Polietilen Tereftalat Laminasyon Mikroakışkan Tasarımları

Zebrafish embryos are transparent and thus uniquely suited for noninvasive intravital imaging of fundamental processes, such as wound healing and immune ...