Bu protokolü kullanarak, 405 nanometre lazer ile donatılmış standart konfokal mikroskobu olan herhangi bir laboratuvar saç hücresi atası lazer ablasyonları gerçekleştirebilir ve onların rejenerasyon izleyebilirsiniz. Elektro-ablasyon aksine, bu teknik çevreleyen hücreleri zararsınırlar ve güçlü bir darbeli UV lazer kurulumu daha erişilebilir. Konfokal görüntüleme ablasyondan hemen önce ve sonra da yapılabilir.
Bu teknik, duyusal ataların rejeneratif davranışını daha iyi anlamamızı sağlar, bu da insan işitme kaybı için tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Montaj için, ilk pipet 3-4 anestezi larvaları 35 milimetrelik yemeğin ortasına, 14 milimetrelik 1,5 kapak lı alt tabakaile e3 tricaine çözeltisinin küçük bir damlacığı içine soseize eder. Larvalar onları içerecek kadar büyük küçük bir damlacık kalır, böylece aşırı çözelti kaldırın.
Ve bir dürbün stereo mikroskobun sahnesine çanak yerleştirin. Yakınlaştırma ve odaklamayı, tüm larvaların görüş alanında olması için manipüle edin ve kapak fişine ince bir tarımsal çözüm katmanı eklemek için bir aktarım pipeti kullanın. Sıvı sadece herhangi bir larva aspire değil dikkat, yemeğin altındaki kuyu doldurur kadar fazla agros çıkarın.
Ve hızlı bir şekilde rostral tarafı sola bakan agro-çözüm larvaları yönlendirmek için bir saç bıçağı kullanın. Larvaları cama doğru hafifçe bastırın, öyle ki larvalar profilde uzanır ve sağ tarafları aşağı bakacak şekilde uzanır. Yaklaşık 60 saniye sonra, tarımsal larvalar katılaşmaya başlayacak ve larvalar yeniden yönlendirilemeyecek.
Beş dakika sonra, 1X tricaine ile takviye E3 ile çanak yarım doldurmak için bir transfer pipet kullanın. Olası hedefleri bulmak için, lazer tarama konfokal mikroskopi sistemi gücünü açın ve entegre görüntüleme yazılımı ile lazer i 63X Plan-Apochromat yağ daldırma hedefini seçin ve merceğe daldırma yağı uygulayın.
Sola bakan larvaların rostral yönü ile dairesel bir sahne eklemek çanak güvenli. Parlak alan veya diferansiyel girişim kontrast aydınlatması kullanarak, görüntüleme için monte edilmiş larvalardan birini seçin ve kapağına en yakın balığın yan tarafındaki deriyi odak haline getirmek için odak tonlamasını kullanın. GFP kanalında epifloresan aydınlatmaya geçin ve yatay miyoseptum boyunca GFP ekspresyonu ile arka lateral çizgiyi bulun.
Floresan hücrelerin halkaları nöromast manto hücrelerinin göstergesidir ve hücrelerin uzamış iplikçikleri internöromast hücreleridir. İlk göç eden primordium nöromast ile başlayarak, yatay miyoseptum boyunca caudally görsel olarak tmak için sahne kontrol joystick kullanın. İnternöromast hücrelerinin dizisini takiben üçüncü ve dördüncü göç eden primordium nöromastlar arasındaki bölgeye ulaşılır.
Birkaç larva görüntülenecekse, ilk aşama konumunu ayarlamak için konumu seçin. L3'teki hücre gövdeleri tanımlandıktan sonra, L4 bölgesi nin satın alma moduna geçin ve GFP görüntüleme izini etkinleştirmek için uygun bir lazer kullanın. Etkinleştirilen lazer izine iletilen bir ışık kanalı eklemek için görüntüleme kurulumu açılır menüsündeki T-PMT kutusunu tıklatın.
ET20 larvalarını görüntülemek için 488 nanometre lazerini seçin, lazer gücünü iğne deliği boyutunu %6'ya, bir alan birimi eşdeğerine ve dijital kazancı 750'ye ayarlayın. Hücre organları aksi loş projeksiyonlar ve filopodia yakalamak için doymuş olduğu gibi kazanımlar ayarlayın. Ve kare boyutunu 1, 024'e 1, 024 piksel, ortalama yı ikiye ve dijital yakınlaştırmayı 0,7 piksele ayarlayın.
Z konumu açılır menüsünü getirmek için Z yığını kutusunu işaretleyin. Hızlı tarama sırasında, internöromast hücreleri sadece odak dışında olana kadar dışarı odaklanın ve ilk dilim ayarlayın. Internöromast hücreleri bir kez daha odak dışında ve son dilim ayarlayın kadar örnek aracılığıyla odaklanın.
Ardından, ablasyon öncesi Z yığınını yakalamak için dur'u ve deneyi başlat'ı tıklatın. Sahne konumları eklendiyse, konumseçeneğini yalnızca geçerli konumun görüntülenebilmeleri için etkinleştirin ve yakalandıktan sonra dosyayı kaydedin. Hedeflenen hücre gövdelerinin lazer ablasyonunu anlamak için, edinme arabirimindeki tüm araçları göster'i ve görüntüleme kurulum menüsünde yeni bir parça eklemeyi tıklatın.
Boya'yı tıklatın ve DAPI'yi seçin. Kanallar altında, lazer ayarı için 405'i seçin ve lazer gücünü ablasyon için aday hücre vücutlarını tararken lazeri kapatmak için DAPI kanalına tıklamayı %75'e çıkarın. Canlı tıklayın ve görüş alanında ortalanmış bir internöromast hücre gövdesi ile, 20 ila 22X tarama çerçevesi içine yakınlaştırma.
Hücre gövdesi görüş alanını doldurur doldurmaz canlı taramayı durdurun. Parçayı etkinleştirmek için 405 nanometre lazer deklanşör kutusunu kontrol edin ve 45 saniye boyunca bir zamanlayıcı ayarlayın. Ardından, sürekli taramayı etkinleştirin ve zamanlayıcıyı çalıştırın.
Taramayı hemen 45 saniyede durdurun. Ablasyon sonrası hücre gövdelerinin görüntülenmesi için kanallar menüsü altında, ablasyon lazerini etkinleştirmek ve edinme modu menüsünü açmak için DAPI parkuruna tıklayın. Yakınlaştır'ı tıklatın ve yakınlaştırmayı 0,7'ye düşürün.
Hücre ablasyonunun başarısını değerlendirmek için, görüş alanını hızlı calıstın. Ablasyon öncesi görüntüleme için ayarlarla aynı ayarları kullanarak ablasyon sonrası görüntüyü yakalayın ve kaydedin. Hücresel hasarı daha fazla doğrulamak için iletilen ışık fotoçarpan tüp kanalı görüntüsünü inceleyin.
Hasarlı hücreler tanecikli bir görünüm gösterir ve çekirdekleri sık sık şişecek veya şeklinde düzensiz görünür. Ablasyon sonrası hücre vücut iyileşmesini değerlendirmek için, hızlandırılmış görüntü yakalama için hem sahne konumunu hem de zaman seçeneklerini etkinleştirin ve zaman parametrelerini uygun deneysel zaman noktasına ve 15 dakikalık aralıklara ayarlayın. Ardından, görüntüleri elde etmek için denemeyi başlatın ve tamamlandığında ortaya çıkan dosyayı kaydedin.
Bu temsili deneyde, üçüncü ve dördüncü göç eden primordium nöromastlar arasında yer alan lateral hattın bölgesi tespit edilmiştir ve ablasyon öncesi görüntüler yakalanmıştır. Ablasyon sonrası tarama, ablated bölgede hiçbir hücre gövdesi kalmıştır doğruladı. Komşu internöromast hücrelerinin uzatılmış projeksiyonlar arasında bir boşluk bırakarak.
Ablasyon sonrası iletilen ışık fotoçarpan tüp kanalının analizi, hasarlı ve ölmekte olan hücreleri ortaya çıkarır. Şişmiş ve düzensiz şekilli çekirdekleri ve tanecikli bir görünüm ile işaretlenir. Makrofajlar muhtemel büyük amipoid hücrelerin işe de görülebilir.
Bu deneyde, çift transgenik larva birkaç hücreablasyon internöromast hücreleri dize büyükçe boşluklar oluşturdu, ama lateral line sinir üzerinde çok az veya hiç etkisi yoktu. Lazer ablasyon sonrasında boşluk boyutları ölçülebilir. Sadece birkaç mikron kadar 100 mikron arasında değişen, genişlik bağlı olarak bireysel nöromast hücreleri ve kaç hücre ablasyon için seçilir.
Ablasyon dan sonra, bazı internöromast hücreleri görüntüleme ilk birkaç saat içinde kurtarmak. Boşluk kapatma olasılığı ile negatif boşluk boyutu ile ilişkili. Ancak kurtaramayan internöromast hücrelerinde bile, komşu internöromast hücrelerinden uzun projeksiyonların oluşumu, nöronal büyüme konileri uzanan benzer olabilir görülebilir.
T-PMT kanalını düzensiz şekilli çekirdekler ve taneciklilik gösteren hasarlı hücreler için iyice incelemek ve hücre ölümü bu göstergeler için yeterli zaman sağlamak için önemlidir görünür hale gelmek için. Ortaya çıkan hızlandırılmış mikroskopi verilerinin daha fazla analizi, potansiyel olarak lazer ablasyon tarafından indüklenen yeni hücresel davranışlar ortaya çıkarabilir ve rejenerasyon düzenleyicileri tanımlamak için deneylerin geliştirilmesine rehberlik edebilir. Bu teknik, bu hücrelere seçici olarak zarar vermek için hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem sunarak internöromast hücre yenilenmesinin moleküler düzenleyicilerini incelememizi sağlamıştır.
