我々は、これらの細胞培養を特徴づけるの助けのためのラボはメンバージェフリーAdijanto、ティナBanzon、容里、秦ワン、Congxiao張静趙、コニー志、Awaisジア、ナタリアStrunnikovaに感謝。細胞培養の大型株を維持する上で彼らの助けのための静趙、コニー志、そしてティナBanzonに感謝。 この作品は、健康学内研究プログラムの国立研究所によってサポートされていました。

1。人間の胎児の組織すべての人間の組織に関連する研究はヘルシンキ宣言およびNIHの機関審査委員会の教義に従っています。胎児の目は氷の上にパックされたチューブを（ABRによって提供される）を含むRPMI - 1640培地に置かれた妊娠16〜22週でのランダムドナー、、から、独立した売春斡旋人、高度なバイオ資源（ABR、アラメダ、カリフォルニア州）によって得られる、とされています一晩優先配信サービスによって配信。組織は摘出後に実行可能な最大48時間のまま。 2。細胞培養培地 MEM -α改変培地（Sigma - Aldrich）を5％及びRPE細胞の培養は15％血清含有培地（下記の表1 RPE培地）を調製するための基本培地として使用されます。 <table border="1"><tbody><tr><td>の名前</td><td>シグマ</td><td>ギブコ</td><td>量は</td><td>ストレージ</td></tr><tr><td> MEM、アルファ修正</td><td> M - 4526 </td><td></td><td> 500 mLの</td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> N1サプリメント</td><td> N - 6530 </td><td></td><td> 5 mLの</td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td></td><td> 15140-148 </td><td> 5 mLの</td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td>グルタミン - I </td><td></td><td> 35050 </td><td> 5 mLの</td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td> M - 7145 </td><td></td><td> 5 mLの</td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> THT * </td><td></td><td></td><td></td><td> -80 ° C </td></tr><tr><td>タウリン</td><td> T - 0625 </td><td></td><td> 125 mgの</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td> H - 0396 10 </td><td></td><td> 10μgの</td><td></td></tr><tr><td>トリヨードthyronin </td><td> T - 5516 </td><td></td><td> 0.0065μgの</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清** </td><td></td><td></td><td> 5パーセントまたは15％ </td><td> -80℃の</td></tr></tbody></table> 表1。 500mLの培地の調製のためのヒト胎児RPEの培地成分 * THTは、培地を作る前に1 1.5 mLのPBSでタウリン-ヒドロコルチゾン - トリヨードthyroninを溶解することによって行われます。複数のアリコートを-80℃で作られ、保存されています° Cで培養液の培養の準備を簡素化する。 **ウシ胎児血清はSigma - Aldrichまたはギブコから入手されていません。 メディアの準備のために使用されるウシ胎児血清は、アトランタバイオ（ノークロス、ジョージア州）から取得されます。血清の各ボトルは、使用する前に（56℃1時間のための）不活化熱です。彼らはメディアの製造のために使用されるまで、同一ロットからの血清の細胞培養の一貫性、大量性を確保するために購入し、-20℃で保存されています。別のロットから20％FBSを含む培地で数週間のためにウェルプレート - または12 - hfRPE細胞の特定のバッチからまばらに播種された細胞を24で栽培されています。最も古典的なRPEの形態（敷石）と最も急速に成長してmelanated細胞は細胞培養に使用できる適切な血清ロットを示している。 細胞培養の培地にも含まれています：N1サプリメント（Sigma - Aldrich）を1:100 mLの/ mLの、グルタミン/ペニシリン - ストレプトマイシン1:100 mLの/ mLの（Gibco社）、および非必須アミノ酸溶液（Sigma - Aldrich）を1:100 mLの/をmLの。加えて、ヒドロコルチゾン（20μg/ Lの）、タウリン（250 mg / L）を、とトリヨード- thyronin（0.013μg/ Lの）（THT）は1:500の最終濃度になるようにPBSでこれらの3つのコンポーネントを溶解することによって先に用意されています（ml / ml）と。 RPE培地に添加するまで、THTのアリコートを80℃で保存されています。 3。細胞の文化 3〜5分（下記の図1）のプラスゲンタマイシン（1 mg / mLの）領収書に、無傷の地球儀は（Invitrogen社;カタログ番号15240から096。。10倍に希釈）抗生物質抗真菌剤溶液で洗浄する。 <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。インキュベーションの抗生物質は、HBSSまたはPBSなどの培地で2回洗い流したされた後。一度に片方の眼の世界は、Sylgard - 184（WPI）でコーティングした10cmペトリ皿に移し、27G針で固定されています。皆伐即したナイフ（アルコン社）を使用して切開は毛様体（前面に目の赤道からの距離の1 / 3）以下の強膜を介して行われます。この切開は、前眼部を除去するための円形のカットを開始するために使用されます。このカットは、1つのブレード鋸歯状（FST）とタングステンカーバイドコーティングされた湾曲した虹彩のはさみを使って行われます。眼の前部分の除去に先立って、カットは、rを切り離す避けるために硝子体を介して行われる後極でのRPEからetina。 （。。2 U / mLの、カタログ番号04942086001、ロシュダイアグノスティックス、インディアナポリス、IN）眼の前方部分が除去された後、後極はディスパーゼ- Iの溶液と共にインキュベートされる40〜60分に5％血清を含む培地で37 ° C - 5％CO 2。ディスパーゼ処理後、後部の極は、シリコンのパディングを持つペトリ皿にHBSS（Sylgard 184、ダウコーニング、ミッドランド、MI）に転送され、象限または十分に組織をフラット化してより大きな部分に解剖。その後、網膜は、静かにピンセットで除去する。シングルセルRPE層はシートに剥離し、冷トリプシン- EDTA（ギブコ、＃25200〜056）溶液中に直接採取された。 RPEが収集された後、トリプシン- EDTAで組織を持つチューブは37℃10-15分のために水浴中に密封され、転送され、℃のインキュベーションの10分後、チューブを精力的に小さなクラスターにRPEを分離するために振とうする。分離が完了していない場合、チューブは、別の5分間水浴中に戻って配置されます。トリプシン- EDTAのインキュベーション後、試験管を可能な限り非溶解混合細胞クラスターのために検査されます。どんな観測されたクラスターが細かい先端がガラスパスツールピペットを用いて除去される。 （4分のための臨床遠心1.4回転）スピンダウン後、hfRPE細胞は15％のRPEのメディアに再懸濁しているし、Primariaフラスコ（例入れ：カタログ番号08-772-45、フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルバニア州。。 ）。この培地を、5％血清を含むRPEの培地で1日後に交換され、そしてその後の変更は2〜3日ごとに行われた。 3〜4週間後、細胞がコンフルエントと一様に色素となった。彼らは、15％血清含有RPE細胞培養の培地に再懸濁し、1ウェルあたり150〜200K細胞（トランスウェルで明確な細胞培養インサートに播種、10〜15分間0.25％トリプシン- EDTAでトリプシン処理し、コーニングコースター、 12 mm径のインサートを使用してニューヨーク州コーニング）、、0.4ミクロン孔、ポリエステル膜（例：。。カタログ番号07-200-161、フィッシャーサイエンティフィック）。播種前に、井戸は人間の細胞外マトリックス（。。ウェルあたり150μLHBSS中の10μg、カタログ番号354237、BD Biosciences社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）でコーティングされ、2時間のフードにUV光で硬化。いくつかのケースでは、トリプシン処理の手順は、最初にトリプシン処理した後、デタッチしていない細胞を収集するため、二度目の繰り返された。同じプロトコル（ECMでコーティングを除く）は、細胞のP1の人口を生成するためにフラスコで培養細胞に使用されていました。彼らは≥200Ω•cm 2の総組織の抵抗を持っていて、一様に色素沈着したときに、これらの細胞を実験に使用した。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/2032fig1full.jpg">大きな図1は、ここをクリックしてください</a> 。 4。段階的な手順<ol><li>複数の解決策（それぞれの目に対して必要に応じて4ウェル）を12ウェルプレートを準備します。 <ol class="lalpha"><li> 10倍の抗生物質抗真菌ソリューションを追加 - 1も/目</li><li>すすぎのためにPBS / HBSS溶液を追加 - 2井戸/目を</li><li>ディスパーゼのソリューションを追加 - 1も/目を</li></ol></li><li> 5固定針を開梱し、HBSSで塗りつぶすことにより、ペトリ皿を解剖準備</li><li>アンパック目と3〜5分（ステップ1で調製した）のために抗生物質 - 抗真菌剤溶液中にそれらを置く</li><li> PBS / HBSSで2つの井戸で目を（ステップ1で調製した）洗い流した後、解剖皿に移す。 </li><li>トリム過度の筋肉と目の周りの結合組織</li><li>セキュリティで保護された27G針（シリコンベースに突き止める）角膜が上を向く方法でそれらを整列させる解剖皿に目を使う。 </li><li>即したナイフを使用すると、円形のカットが開始される角膜下に切開を加えること</li><li>使用して虹彩のはさみは、硝子体を切ってと離れて目の前方部分を持ち上げると同じハサミを使って、目の周りに予選通過。 注：ステップ3〜8は眼球への過度の機械的な圧力を避ける。 </li><li>ディスパーゼ溶液中に開いている目を移す（ステップ1で調製） </li><li> 37℃で40〜60分のためにアイカップをインキュベート° Cで5％CO 2 </li><li>新鮮なもので皿を解剖にHBSS溶液を交換してください。 </li><li>ディスパーゼ溶液から解剖皿に目を移す。 </li><li>位置は、ペトリ皿の眼（眼球のコップが上を向く）と2つの27G針で固定します。 </li><li>静かに部分的に分離された網膜を持ち上げ、網膜ハサミを使用すると、視神経から網膜をカット。網膜を捨てる。 </li><li>アイリスのはさみを使用すると、視神経に向かって眼の周囲から一切開を行います。 </li><li> 5つすべての27G注射針を使用すると、きれいに伸ばして目を作るRPE層を平坦化。 </li><li>網膜はさみを使用すると、添付ファイルから視神経にRPE層を分離する視神経の周りに円形のカットを行います。 注：ステップ13から17は、低倍率でまたはステレオ顕微鏡なしで行うことができます。 </li><li> 250倍の倍率の実体顕微鏡を調整します。以上と虹彩ハサミによるカットに沿って視神経に近いRPEシートのエッジを見つける。 </li><li> two鉗子脈絡膜組織層とは別のRPE -ブルッフの膜を使用する。それは、RPEと脈絡膜の接続が最も弱いものであるエッジに沿った領域を見つけるためにいくつかの試みが必要になる場合があります。 </li><li> 15 mLの試験管に冷トリプシン- EDTA溶液にRPEのシートを置きます</li><li> RPEの後に37℃で10 15分のために水浴中にトリプシン- EDTAの組織で、キャップと熱管を集めている℃を</li><li>インキュベーションの10分後、精力的に小さなクラスターにRPEを分離するために15 mLの試験管を振る。分離が完了していない場合、別の5分間水浴に戻しチューブを置きます。 </li><li>可能な非溶解混合細胞クラスターのためのチューブを点検します。どんな観測されたクラスターが細かい先端がガラスパスツールピペットを用いて削除する必要があります。 </li><li> （4分のための臨床遠心1.4回転）hfRPE細胞をスピンダウン、15％RPEメディア（9 mLの合計）で上清を除去し、再サスペンド細胞</li><li> Primariaフラスコに細胞懸濁液3 mLを入れて次の日まで、新鮮な15％のRPEのメディア、インキュベーターに場所のフラスコの2 mLを加える（37℃、5％CO 2） </li></ol> 5。代表的な結果 hfRPE細胞培養の機能検証以前の実験では、細胞膜輸送タンパク質の発現、偏光と機能を決定し、それらが適用されるプロパティセットの検証を提供蓄積されるとRPEの機能を1月11日これらの特性を制御する特定のシグナル伝達経路を同定するためにこれらの一次培養を使用している各セルの世代へ。実験では、上皮流体の輸送と細胞間隙経路の完全性を決定するタンパク質を同定以下にまとめる。 in vitroの実験で 、これらは、網膜再再付着6の動物モデルで検証されています。 <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 hfRPE細胞におけるCFTRの局在 左上部パネル：。CFTRが膜濃縮エキスを使用してhfRPE細胞で検出された。 M、分子量マーカー、 レーン1、センター下部パネルの主要な成熟（バンドC）と未熟な（とBバンド）：CFTRの免疫局在（緑ラベル） 右上のパネル：表示のz平面を介して拡大断面図。。 z軸を介して最大強度投影。 ZO - 1は、（赤のラベル）RP​​E細胞の先端および側底側面の輪郭を描くタイトジャンクショ​​ンのマーカーとして機能します。 DAPI（青）は原子核に近い基底膜にあるラベルを付けます。 ZO - 1は、その赤いラベルと重なるCFTRから緑色蛍光以来、のような黄色/オレンジ色が表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。 hfRPEにおけるIFNγによって誘導される生理的変化：。基底風呂にIFNγを追加するには、プライマリ、培養hfRPE細胞の単層を介して上皮流体の輸送（J V）を増加J vは上のトレースに時間の関数と純流体としてプロットされます。吸収（基底槽に心尖部）が正の値で示されます。経上皮電位（TEP）との合計組織の抵抗は、（R、T）ボトムトレースに時間の関数としてプロットされています。 B：基底槽へCFTRinh - 172（5μM）の添加によりIFNγ刺激によるJ Vの増加を抑制した。 下記のin vitroでの調査結果で hfRPEを確認する動物モデル実験の例です。この実験では、人工的に作成された網膜剥離が著しく（図4、B）外部の眼の表面にIFNgを添加した後に減少した。この効果は、部分的にによってブロックすることができます：cAMPのブロッカー（図4D）の（1）に加え、（2）完全にJAK + cAMPのブロッカーの添加後にブロック。以下の画像は、OCTのスキャナを使用して取得されます。 <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。 生体網膜剥離の実験では。vivo実験で 、これらの手順は、以前に詳細6に記載されている。これらの実験では、網膜剥離は、単独でまたはJAK - STATおよびPKA経路の阻害剤の組み合わせと、網膜下腔（SRS）に変更されたPBS溶液の0.5から3μLの注入によるラットの眼で作成されていました。各実験は、網膜剥離の作成後に40〜70分の初期制御周期を持っていた。この時間の間に、ブレブ体積の変化率は、ブレブ安定性を確保するために測定した。光コヒーレンストモグラフィイメージングは​​（応用物理学研究所、ロシア科学アカデミー、ニージニーノブゴロド、ロシア）SRSの体積変化の時間経過を測定するために使用されていました。 再付着巻の時間的経過UMEの変更は、光コヒーレンストモグラフィ（OCT）により測定した。 40〜70分間前面にIFNγを添加した後剥離の大きさの変化（A、B、およびDの矢印）を示し、4種類の実験（AD左側のパネル）からOCTは、画像。 IFNγは、そのコントロール率（≈2μlの•cm 2で •時間-1）〜14日に合弁会社を増加し、それぞれ12μL•cm 2と •HR - 1、ていることとBのパネルが展示。 JAK - STAT経路とPKA阻害剤（CとD）、IFNγの添加後-誘起吸収率が有意に0.2と7.9に減少したμL•cm 2と •HR - 1、それぞれ。矢印は、破線で囲まれた領域、（開始量）との比較のためにブレブの境界を示している。図の右側に：いくつかの実験から測定されたJV率のトップパネルの要約、（パネル-映画真ん中<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/Bleb%205.wmv">はここをクリック</a> ）、青でBの擬似カラーでまとめた実験の下部パネル- 3Dのセクションでは、t = 0で剥離の空間的な範囲を示し、 INFγの添加後40分。 全ての動物実験は、ビジョンと眼科文の研究のための協会に準拠して実施された。プロトコルは、国立衛生研究所の動物実験委員会によって承認された。

<ol>
	<li>Bharti, K., Miller, S. S., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+paradigm:+Retinal+pigment+epithelium+cells+generated+from+embryonic+stem+cells+or+induced+pluripotent+cells.">The new paradigm: Retinal pigment epithelium cells generated from embryonic stem cells or induced pluripotent cells.</a> Pigment Cell &#38; Melanoma Research. , .</li><li>Strunnikova, N. V., Maminishkis, A., Barb, J. J., Wang, F., Zhi, C., Sergeev, Y., Chen, W., Edwards, A. O., Stambolian, D., Abecasis, G., Swaroop, A., Munson, P. J., Miller, S. S., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+and+molecular+signature+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium.</a> Hum Mol Genet. 19 (12), 2468-2486 (2010).</li><li>Miller, S. S., Maminishkis, A., Li, R., Adijanto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+184:+Phototransduction:+RPE+transport+Retina+Phototransduction:+RPE+transport.">Chapter 184: Phototransduction: RPE transport Retina Phototransduction: RPE transport.</a> Encyclopedia of the Eye. , 2540-2540 (2010).</li><li>Bryant, D. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cells+to+organs:+Building+polarized+tissue.">From cells to organs: Building polarized tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (11), 887-901 (2008).</li><li>Maminishkis, A., Chen, S., Jalickee, S., Banzon, T., Shi, G., Wang, F. E., Ehalt, T., Hammer, J. A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).</li><li>Shi, G., Maminishkis, A., Banzon, T., Jalickee, S., Li, R., Hammer, J., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+chemokine+gradients+by+the+retinal+pigment+epithelium.">Control of chemokine gradients by the retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 4620-4630 (2008).</li><li>Economopoulou, M., Hammer, J., Wang, F. E., Fariss, R., Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+localization,+and+function+of+junctional+adhesion+molecule-C+(JAM-C)+in+human+retinal+pigment+epithelium.">Expression, localization, and function of junctional adhesion molecule-C (JAM-C) in human retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (3), 1454-1463 (2008).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Banzon, T., Wan, Q., Jalickee, S., Chen, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN{gamma}+Regulates+Retinal+Pigment+Epithelial+Fluid+Transport.">IFN{gamma} Regulates Retinal Pigment Epithelial Fluid Transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 297, C1452-C1465 (2009).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Wang, F. E., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-C+and+-D+induced+proliferation/migration+of+human+RPE+is+abolished+by+inflammatory+cytokines.">PDGF-C and -D induced proliferation/migration of human RPE is abolished by inflammatory cytokines.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 5722-5732 (2007).</li><li>Maminishkis, A., Jalickee, S., Blaug, S. A., Rymer, J., Yerxa, B. R., Peterson, W. M., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y(2)+receptor+agonist+INS37217+stimulates+RPE+fluid+transport+in+vitro+and+retinal+reattachment+in+rat.">The P2Y(2) receptor agonist INS37217 stimulates RPE fluid transport in vitro and retinal reattachment in rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3555-3566 (2002).</li><li>Wang, F. E., Zhang, C., Maminishkis, A., Dong, L., Zhi, C., Li, R., Zhao, J., Majerciak, V., Gaur, A. B., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204/211+alters+epithelial+physiology.">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB J. 24, (2010).</li><li>Adijanto, J., Banzon, T., Jalickee, S., Wang, N. S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CO2-induced+ion+and+fluid+transport+in+human+retinal+pigment+epithelium.">CO2-induced ion and fluid transport in human retinal pigment epithelium.</a> J Gen Physiol. 133, 603-622 (2009).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Zahn, G., Vossmeyer, D., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha5beta1+mediates+attachment,+migration,+and+proliferation+in+human+retinal+pigment+epithelium:+relevance+for+proliferative+retinal+disease.">Integrin alpha5beta1 mediates attachment, migration, and proliferation in human retinal pigment epithelium: relevance for proliferative retinal disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5988-5996 (2009).</li><li>Peterson, W. M., Meggyesy, C., Yu, K., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+activates+calcium+signaling,+ion,+and+fluid+transport+in+retinal+pigment+epithelium.">Extracellular ATP activates calcium signaling, ion, and fluid transport in retinal pigment epithelium.</a> J Neurosci. 17, 2324-2337 (1997).</li><li>Voloboueva, L. A., Liu, J., Suh, J. H., Ames, B. N., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R)-alpha-lipoic+acid+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+damage.">R)-alpha-lipoic acid protects retinal pigment epithelial cells from oxidative damage.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 4302-4310 (2005).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

本実験では、我々は目ごとに使用可能な細胞の高い数字と一致してhfRPE初代培養を生産するために必要な複数の手順を合理化するために設計された私たちの以前に発行されたtechniques 3の追加の変更を説明します。元のプロシージャ内の各変更は、厳密に変更がアーチファクトを導入せず、継続的にこれらの細胞を使って多くの他のラボでテストされていることを保証する複数の生理学と分子生物学の実験において試験した。最後に、追加の実験が動物モデルで同様の摂動をin vitroでの結果を比較するために実施した。

解剖のプロトコルに必要な計測器<ol><li>ステレオ顕微鏡 - 解剖に必要な作業倍率X250で利用可能な任意の</li><li>解剖皿 - などキンブル100 × 20ミリメートル＃23062（郭ごとに）任意のソース</li><li> Sylgard 184 - WPI猫。 ＃SYLG184 * *料理がSylgard 184はミキシングの指示に含まれる従っ解剖準備するには、5〜8ミリメートルの層を形成するために、ペトリ皿に混合液エラストマーを注ぐ。エラストマーは、少なくとも24時間のために治すことができます。硬化エラストマーと料理を70％エタノールおよび再利用を複数回（〜100倍）を使用して滅菌することができる</li><li> BD PrecissionGlide 1から27 Gの針¼の長さ（解剖あたり5）任意のソース</li><li> CaおよびMgの塩を含有するHBSS 1Xソリューション - GIBCOカタログ番号14025 500ミリリットル（複数の解剖のための良い）。 </li><li>アイリスはさみ炭化物鋸歯状刃、曲面 - FST猫＃14559から11（一）。 </li><li>網膜はさみ - Katena猫＃K4 - 5300（いずれか）。 </li><li>鉗子 - などデュモンピンセット＃5 WPIの猫から洗練されたヒントと＃500085（2個）。 </li><li>即したナイフ - アルコン、皆伐さ1mm、重ベベル、傾斜カタログ番号8065921540。 </li><li>チューブの15ミリリットルを遠心 - （眼ごとに）任意のソース</li><li>パスツールガラスピペット - （郭ごとに）任意のソース</li><li>ウェルプレート12（郭ごとに）任意のソース</li><li> Primaria 25センチメートル2フラスコ- （眼あたり2-3）任意のソース</li></ol>

experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology

我々は、天然のヒトRPEの形態学的、生理学的および遺伝的特性を持つ主なヒト胎児網膜色素上皮（hfRPE）文化のコンフルエントな単層を大量に作り出すことができる細胞培養の手順を開発しました。これらhfRPE細胞培養は、大量の色素沈着を示し、電子顕微鏡では、豊富な頂端膜の微絨毛を示す。接合部複合体は、様々なタイトジャンクショ​​ンタンパク質の免疫蛍光ラベリングと同定された。これらを簡単に再現可能な初代培養の上皮極性と機能は密接に以前にヒトを含むネイティブRPEの哺乳動物モデルを、研究に似ています。これらの結果は、人間の眼疾患のいくつかの動物モデルにおける治療的介入の開発によって拡張されました。我々は、網膜や網膜下腔の異常な体液の蓄積を除去するための戦略に焦点を当てている。細胞外網膜下腔は、感光体の外側のセグメントとRPEの頂端側細胞膜を分離し、網膜添付ファイルのメンテナンスとRPE /網膜の相互作用の全体をホストするための非常に重要です。

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Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

我々は、形態学、生理学、極性、および成人のネイティブ組織の蛋白質と遺伝子の発現パターンを示すことを人間の胎児の網膜色素上皮細胞（hfRPE）細胞の培養コンフルエントな単層のための再現可能な方法を提供する。この作品は、いくつかの眼疾患の動物モデルに拡張されています。

網膜色素上皮生理学と病態の研究のための実験的モデル

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

experimental-models-for-study-retinal-pigment-epithelial-physiology

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JoVE Journal

Neuroscience

19.2K ビュー.  National Institutes of Health. 我々は、形態学、生理学、極性、および成人のネイティブ組織の蛋白質と遺伝子の発現パターンを示すことを人間の胎児の網膜色素上皮細胞（hfRPE）細胞の培養コンフルエントな単層のための再現可能な方法を提供する。この作品は、いくつかの眼疾患の動物モデルに拡張されています。

ビデオ: Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

網膜色素上皮の全マウントするためのマウスの眼の解剖

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

神経科学

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

神経変性疾患のマウスモデルのための嗅覚アッセイ

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

アン<em&gt;体外</em球様細胞白質萎縮症における細胞病態の研究のための&gt;モデル

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

マウス網膜色素上皮における遺伝子治療用ウイルスベクターの縁アプローチ、網膜下注射

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

低密度初代海馬ニューロンの文化

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

強膜網膜移植ひと網膜色素上皮細胞のラットの目の洗練されたプロトコルの開発

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.

脳虚血に対する酸性ポストコンディショニングの神経保護を研究するための実験モデル

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

免疫組織化学用マウスレチンクライオ切片の調製

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

無条件網膜色素上皮を用いた、オルガマウス網膜の長期無血清栽培

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...