RPE ile ilişkili bozukluklar, hastalıkların harmanlanmasının önemli bir parçası olmaya devam etmektedir, ancak primer RPE hücrelerinin sanal kültüründe, RPE ile ilişkili bozuklukların fizyolojik ve patolojik çalışmaları için iyi bir model olarak hizmet edecek etkili kalıntılar yoktur. Bu protokolde, daha sonraki RP özelliklerini hızlı bir şekilde geri yükleyebilen ve koruyabilen birincil IPC'leri kültüre takip etmesi kolay bir protokol sağlıyoruz, bu yöntemi kullanarak insanların masistat çalışmalarından ve RPE bozuklukları için yeni tedavinin geliştirilmesini kolaylaştırabilecek koruyucu ilaç taramalarından hızlı bir şekilde RP hücreleri üretebileceklerine inanıyoruz. Adım adım değer gösterimi, bu yöntemin RP hücrelerini incelemek isteyen farklı laboratuvarlarda çoğaltılmasını çok daha kolay hale getirecektir.
Doku sindirim enzimi malaquad'ı eritmeye başlamak ve 1X PBS'yi sterilize etmek. Çözeltiyi 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtre ünitesinden filtreleyerek% 2 penisilin ve% 2 streptomisin ile desteklenir. Kültür plakasının kuyucuklarını ve transwell eklerini 1X PBS ile yıkayın.
PBS'yi kuyucuklardan ve transwelllerden bir pipetle çıkarın ve alt odaya bir mililitre taze 1X PBS ve üst odaya mililitre başına 600 mikrolitre 10 mikrogram Laminin çözeltisi ekleyin. Bu Helisykültür İnkübatöründe plakaları ve transwell eklerini gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Bundan sonra, laminat çözeltisini üst odadan çıkarın ve hücreyi yerleştirmeden önce iki kez bir mililitre soğuk 1X PBS ile yıkayın Laminat akış başlığını% 75 etanol ve UV ışığı ile temizleyin.
Yaklaşık 25 mililitre %75 Etanol içeren üç adet 50 mililitrelik steril santrifüj tüpü, yaklaşık 25 mililitre 1X PBS içeren üç adet 50 mililitre steril santrifüj tüpü ve yaklaşık 15 mililitre 1X PBS içeren üç adet 10 santimetre steril hücre kültürü kabı hazırlayın. Dört domuz gözbebeğini 10 santimetrelik bir Petri kabında yaklaşık 15 mililitre% 75 Etanol içine batırın ve tüm artık bağ dokularını ve kaslarını kesmek için bir çift makas ve forseps kullanın. Göz kürelerini dekontamine etmek için, sırasıyla% 75 etanol ile doldurulmuş üç adet 50 mililitre steril santrifüj tüpünde dört göz küresini ıslatın ve yıkayın.
Daha sonra göz kürelerini sırayla 1X PBS ile doldurulmuş üç adet 50 mililitrelik steril santrifüj tüpünde yıkayın. Göz kürelerini iyice yıkamak için tüpleri her dakika ters çevirin. Dört göz küresini 1X PBS içeren 10 santimetrelik steril bir hücre kültürü kabına taşıyın.
Optik siniri ve küçük kalıntıları çıkarmak için her göz küresinin dış yüzeyini tekrar kesin. Limbus ve skleranın kesiştiği noktada küçük bir kesim yapmak için makas kullanın. Ve sonra kornea, iris, lens, vitreus gövdesi ve nöral retinayı çıkarın.
RPE koroid sklera kompleksini yeni bir 10 santimetre hücre kültürü kabına aktarın ve göz kapağını dört yapraklı yonca şeklinde düzleştirmek için dört kesim yapın. Dört RPE koroid sklera kompleksini yeni bir 10 santimetrelik kaba yerleştirerek ve RPE koroid sklera komplekslerini birleştirmek için 20 mililitre taze tripsin EDTA çözeltisi dökerek EDTA çözeltisi sindiriminde geziler gerçekleştirin. Çanağı hücre kültürü inkübatörüne yaklaşık 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede yerleştirin.
30 dakika sonra, çanağı inkübatörden çıkarın ve,% 10 FBS ile 20 mililitre ön sıcak hücre kültürü ortamı ekleyin. EDTA çözeltisindeki yolculukları nötralize etmek için, RPE hücrelerini birkaç kez hafifçe pipetleyerek ayırmak için beş mililitrelik bir transfer pipeti kullanın. Hücre süspansiyonlarını 15 mililitrelik santrifüj tüplerinde toplayın ve ardından RPE Choroids sklera komplekslerini çanak üzerinde yıkamak için FBS ile 10 mililitre taze kültür ortamını nazikçe pipetleyin.
RPE hücrelerini, tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj ederek toplayın. SuperAgent'ı bir pipet kullanarak aspire edin ve hücreleri yeniden askıya almak için FBS ile beş mililitre kültür ortamı daha ekleyin. Beş dakika daha 300 G'de santrifüj.
SuperAgent'ı boşaltın ve hücreleri 12 mililitre kültür ortamı ile yeniden askıya alın. Sonraki tohum kuyu başına 100.000 ila 200.000 hücreyi 12 Kuyu kültür plakasına veya transwell eklere yerleştirin. Kültür ortamını her iki günde bir değiştirin ve hücreler ekleme başına kuyucukların yüzeyini tamamen kapladığında serum konsantrasyonunu% 1'e düşürün.
Hücreler toplanana kadar kültür ortamını her iki günde bir değiştirin. Primer domuz RPE hücrelerinin ikinci gün, altıncı gün ve 10. gündeki temsili görüntüleri burada gösterilmiştir. Primer domuz RPE hücreleri, primer insan RPE hücreleri, ARPE 19 hücreleri ve domuz RPE koroid dokusundaki imza genlerinin mRNA düzeylerinin QRTPCR analizi bu grafik görüntü ile tespit edilmiştir.
Burada GAP DH, RTPCR için temizlik geni olarak kullanılmıştır. Birincil domuz RPE hücreleri için dört biyolojik replikasyon ve birincil insan RPE hücreleri ve domuz RPE koroid dokusu için üç biyolojik replikasyonun kullanıldığı bir RPE 19 hücresi kullanılmıştır. ARPE 19 hücrelerindeki gen ekspresyon seviyeleri kontrol olarak belirlendi.
ARPE 19 ve domuz RPE hücrelerinde ve primer insan RPE hücrelerinde ve domuz RPE koroid dokularında RPE 65 proteinlerinin Batı kan analizi bu şekilde gösterilmiştir. Vinculin burada yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır. Bu şekil, DMEM Basic ortamında% 1FBS ile iki haftalık bir domuz RPE hücresi kültürünü göstermektedir.
Lamin ile veya Lamin olmadan kültürlenen hücreler RPE 65, sodyum potasyum APTA'lar, Z01 ve Hex ile boyandı. Lamininli veya lamininsiz kültürlenmiş hücre tabakalarındaki TR ölçümleri bu şekilde tasvir edilmiştir. Primer domuz RPE ve ARPE 19 hücrelerinde vasküler endotel büyüme faktörü veya VEGF ve pigment epitel kaynaklı faktör veya PEDF'nin batı kan analizi bu şekilde gösterilmiştir.
Bu görüntülerde kültürlenmiş primer domuz RPE ve ARPE 19 hücrelerinin sektörel fonksiyonları sunulmuştur. Bu protokolün büyük kısmı, RPE chide glial komplekslerinden RP hücrelerini çözmektir. Sekiz RP hücresini çözmek için her seferinde taze geziler ve çözeltiler kullanmanızı ve sindirim süresini uygun şekilde kontrol etmenizi öneririz.
