Name: experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology
Uploaded: 2010-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
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우리는이 세포 문화를 특성화에 대한 도움 연구소는 회원 제프리 Adijanto, 티나 Banzon, 롱 리, 진 완, Congxiao 장, 징 조, 코니 다우 Awais 지아, 나탈리아 Strunnikova 감사합니다. 징 조, 코니 다우 및 세포 문화 큰 주식을 유지하는 그들의 도움 티나 Banzon 특별 감사드립니다. 이 작품은 건강 교내 연구 프로그램의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 인간 태아 조직 모든 인체 조직 관련 연구가 헬싱키 선언문과 NIH 기관 검토 보드의 신조를 따릅니다. 태아 눈은 얼음 포장 튜브 (ABR에 의해 제공)가 포함된 RPMI - 1640 미디어에 배치 태동의 16~22주에서 무작위 기증자,에서, 독립 획득자, 고급 Bioscience 자원 (ABR, 알라 메다, CA)에 의해 얻어, 그리고 하룻밤 우선 배달 서비스 제공. 조직은 핵의 제거 후 가능한 최대 48 시간 남아 있습니다. 2. 세포 배양 매체 멤 - 알파 변경 중간 (시그마 - 알드리치)는 5 %를 준비하는 기본 매체로 사용하고 RPE 세포의 culturing (RPE 매체, 아래 표 1) 15% 혈청 함유 미디어입니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 시그마 </td><td> Gibco </td><td> 양 </td><td> 저장 </td></tr><tr><td> 멤, 알파 수정 </td><td> M - 4526 </td><td></td><td> 500 ML </td><td> 4는 ° C </td></tr><tr><td> N1 보충 </td><td> N - 6530 </td><td></td><td> 5 ML </td><td> 4는 ° C </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td></td><td> 15140-148 </td><td> 5 ML </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> GlutaMax - I </td><td></td><td> 35,050 </td><td> 5 ML </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> M - 7145 </td><td></td><td> 5 ML </td><td> 4는 ° C </td></tr><tr><td> THT의 * </td><td></td><td></td><td></td><td> -80 ° C이 </td></tr><tr><td> 타우린 </td><td> T - 0625 </td><td></td><td> 125 MG </td><td></td></tr><tr><td> 하이드로코티손 </td><td> H - 0396 10 </td><td></td><td> 10 μg </td><td></td></tr><tr><td> Triiodo - thyronin </td><td> T - 5516 </td><td></td><td> 0.0065 μg </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 ** </td><td></td><td></td><td> 5% 또는 15% </td><td> -80 ° C이 </td></tr></tbody></table> 표 1. 500 ML 매체의 작성에 대한 인간 태아 RPE 매체 구성 요소 * THT는 매체를하기 전에 한 1.5 ML PBS에서 타우린 - 하이드로코티손 - triiodo - thyronin을 용해하여 이루어집니다. 여러 aliquots는 -80에서 만든 저장됩니다 ° C는 문화 매체 culturing 준비를 단순화합니다. ** 태아 소 혈청은 시그마 - 알드리치 또는 Gibco로부터 얻은되지 않습니다. 미디어 준비에 사용되는 태아 소 혈청은 애틀란타 체액 (노르, GA)에서 얻은 것입니다. 혈청의 각 병 사용하기 전에 (56 ° C 1 시간)을 inactivated 열 수 있습니다. 그들은 미디어 준비에 사용되기 전까지는 같은 많은에서 혈청 세포 배양의 일관성 대량을 보장하기 위해 구입 및 -20 ° C에 저장됩니다. 다른 많은의 20 % FBS를 포함한 미디어에 몇 주 동안 잘 접시 - 또는 12 - hfRPE 세포의 특정 배치에서 띄엄띄엄 씨앗 세포를 24에서 재배하고 있습니다. 가장 고전적인 RPE의 형태 (조약돌)로 가장 빠르게 성장하고 melanated 세포는 세포 배양에 사용할 수있는 적절한 혈청을 많이 나타냅니다. 세포 배양 매체도 포함 N1 보완 (시그마 - 알드리치) 1:100 ML / ML, GlutaMax / 페니실린 - 스트렙토 마이신 1:100 ML / ML (Gibco), 그리고 불필요한 아미노산 솔루션 (시그마 - 알드리치) 1:100 ML /을 ML. 또한, 하이드로코티손 (20 μg / L), 타우린 (250 MG / L) 및 triiodo - thyronin (0.013 μg / L)은 (THT) 1:500의 최종 농도로 PBS에이 세 가지 구성 요소를 해소하여 미리 준비가되어 있습니다 (ML / ML). THT의 Aliquots 80에 저장됩니다 ° C까지 RPE 매체에 추가됩니다. 3. 세포 배양 영수증에, 손상 글로브는 항생제 antimycotic 용액에 씻어서 아르 (10X로 희석,.. 고양이도없는 15240-096, Invitrogen) 플러스 gentamicin (1 MG / ML) 3~5분 위해 (아래 그림 1). <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 배양 항생제는 HBSS 또는 PBS와 같은 매체에서 두 번 씻어서 후. 한 번에 하나의 눈 세계는 Sylgard - 184 (WPI)와 코팅과 10cm 페트리 접시에 전송하고 27G 바늘로 보안이됩니다. ClearCut sideport 나이프 (알콘)를 사용하여 절개는 모양체 (앞쪽에 표면에 눈 적도에서 거리의 1 / 3) 아래의 공막엔를 통해 이루어집니다. 이것은 절개는 앞쪽에 눈 부분의 제거를위한 원형 절단을 시작하는 데 사용됩니다. 이 상처는 한 블레이드 톱니 (FST)와 텅스텐 - 카바이드 코팅 곡선 이리스 가위를 사용하여 이루어집니다. 눈 앞의 부분 제거하기 전에, 상처는 R을 분리 피하기 위해 유리 몸을 통해 이루어집니다뒷부분 극에서 RPE에서 etina. 5 % 40~60분에 대한 혈청이 포함된 매체를하며 눈 앞의 부분이 제거되면 사후 극은 dispase - I 솔루션 (로체 진단, 인디애나 폴리스, IN.. 2 U / ML, 고양이도없는 04,942,086,001)와 incubated입니다 37 ° C - 5 % CO 2. dispase 치료 후 사후 극지는 실리콘 패딩 (Sylgard 184, 다우 코닝, 미들랜드, MI)와 페트리 접시에 HBSS로 전송하고 quadrants 또는 충분한 조직을 버리고 더 큰 조각에 해부 했어요. 그러면 망막은 부드럽게 집게로 제거됩니다. 단일 셀 RPE 레이어가 시트에서 떨어져 벗겨 차가운 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (Gibco # 25200-056) 솔루션에 직접 수집했다. RPE를 수집 후, 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 조직과 튜브는 37 봉인하고 10-15 분에 대한 물 목욕으로 전송됩니다 ° C.는 부화 10 분 후, 튜브가 적극적으로 작은 클러스터로 RPE를 분리 흔들리고 있습니다. 분리가 완료되지 않은 경우 튜브가 다른 5 분 물 욕조에 다시 배치됩니다. 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 부화 후, 튜브가 가능한 해제 용해 혼합 세포 클러스터에 대한 검사입니다. 모든 관찰 클러스터는 잘 밀고 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 제거됩니다. (4 분에 대한 임상 원심 분리기에서 1.4 RPM) 아래로 회전 후, hfRPE 세포는 15 % RPE 미디어에서 다시 중단되고 다음 Primaria flasks (예 투입 : 고양이도없는 08-772-45; 피셔 과학, 피츠버그, PA.. ). 이 매체 5 % 혈청 함유 RPE 매체로 1 일 교체되며, 이후 변경 사항은 2~3일 모든되었다. 3-4주 후, 세포가 합류하고 균일하게 색소되었다. 코닝 코스타, 그들은 다음 15% 혈청 함유 RPE 세포 배양 매체에서 다시 중단하고, 잘 당 150 200K 세포 (트랜 스웰에서 명확한 세포 배양 삽입에 씨앗을 품고, 0.25 % 10 ~ 15 분 정도 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 trypsinized 아르 고양이도없는 07-200-161, 피셔 사이 언티픽) :.. 12 - mm 직경 삽입, 0.4 - 음 모공, 폴리에스터 세포막 (예 : 사용 코닝, NY). 시딩 전에 우물은 인간의 세포외 기질 (.. 당 150 μL 잘 HBSS 10 μg, 고양이 노 354237; BD Biosciences, 프랭클린 레이크스, NJ)로 코팅되었고 2 시간 모자 자외선과 치유. 어떤 경우에는 trypsinization 절차는 첫 번째 trypsinization 후 분리하지 않은 세포를 수집하는 두 번째 시간을 반복했다. 동일한 프로토콜 (ECM과 코팅은 제외) 세포의 P1 인구를 생성하는 flasks에 문화 전지에 사용되었습니다. 그들은 ≥ 200 Ω • cm 2의 총 조직 저항을했고 균일하게 색소 때 이러한 세포 실험에 사용되었다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/2032fig1full.jpg">큰 그림 1 여기를 클릭하십시오</a> . 4. 단계 절차에 의해 단계 <ol><li> 여러 솔루션 (4 우물에 필요한 각각의 눈)와 함께 12 잘 접시를 준비 : <ol class="lalpha"><li> 일 잘 / 눈 - 10X 항생제 antimycotic 솔루션을 추가 </li><li> 린스에 대한 PBS / HBSS 용액을 추가 - 2 우물 / 눈 </li><li> dispase 솔루션을 추가 - 1 잘 / 눈 </li></ol></li><li> 5 고정 바늘을 풀고하고 HBSS로 작성하여 페트리 접시를 해부 준비 </li><li> 풀고 눈과 3-5 분 (1 단계에서 준비)에 대한 항생제 - antimycotic 솔루션으로 그들을 장소 </li><li> PBS / HBSS 두 개의 우물 (1 단계에서 준비)에 눈을 씻어 후, 요리를 해부에게 전송할 수 있습니다. </li><li> 트림 과도한 근육과 눈 주위 결합 조직 </li><li> 각막가 얼굴 방식으로 그들을 정렬 요리를 해부에 보안 27G 바늘 (실리콘베이스로 핀) 눈을 사용합니다. </li><li> 원형 절단이 시작됨 sideport 나이프를 사용하면, 아래의 각막 절개를 </li><li> 사용 이리스 가위 그런 다음 유리를 통해 잘라 거리에 안구의 앞쪽에 부분을 리프트 같은 가위를 사용하여 눈 주위를 잘라합니다. 참고 : 단계 3-8은 안구 어떤 과도한 기계적 압력을 피하십시오. </li><li> (1 단계에서 준비) dispase 솔루션으로 열려 시선을 전송 </li><li> 37 40-60분 눈을 컵을 품어 ° C와 5 % CO 2 </li><li> 신선 한 사람과 요리를 해부의 HBSS 용액을 교체하십시오. </li><li> dispase 솔루션에서 해부 접시에 눈을 전송. </li><li> 위치 페트리 접시에 눈 (안구 컵가 직면하고) 두 27G 바늘로 보안. </li><li> 부드럽게 부분적으로 분리된 망막를 일으키고 망막 가위를 사용하면 시신경 떨어져 망막 잘라. 망막 폐기하십시오. </li><li> 이리스 가위를 사용하면 시신경으로 눈 주변에서 한 절개합니다. </li><li> 모두 다섯 27G 바늘을 사용하면 멋지게 뻗어 안구 만들기 RPE 계층을 평평하게. </li><li> 망막 가위를 사용하면 시신경에 첨부 파일에서 RPE 계층을 분리 시신경 주위에 원형 절개를합니다. 참고 : 단계 13-17은 낮은 배율로 또는 스테레오 현미경없이 할 수 있습니다 </li><li> 250x 배율로 stereomicroscope를 조정이상과 홍채 가위로 잘라 만든 따라 시신경 주변 RPE 시트의 가장자리를 찾으십시오. </li><li> 이 포셉 choroidal 조직 계층에서 별도의 RPE - Bruch의 막이를 사용하여. 그것은 RPE와 맥락막의 연결이 약한있는 가장자리 영역을 찾기 위해 몇 가지 시도를 요구할 수 있습니다. </li><li> 15 ML 튜브에서 추위 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션으로 자리 RPE 시트 </li><li> RPE는 37 10 15mins를위한 물 욕조에 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 조직과 모자 및 전송 튜브를 수집 후 ° C. </li><li> 부화 10 분 후, 적극적으로 작은 클러스터로 RPE 분리 15 ML 튜브를 흔들. 분리가 완료되지 않은 경우, 또 다른 5 분 물 목욕으로 다시 튜브를 놓으십시오. </li><li> 가능한 해제 용해 혼합 셀 클러스터를위한 튜브를 검사합니다. 모든 관찰 클러스터는 잘 밀고 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 삭제해야합니다. </li><li> (4 분에 대한 임상 원심 분리기에서 1.4 RPM) hfRPE 세포를 스핀 다운 15 % RPE 미디어 (9 ML 합계)에 뜨는 제거하고 다시 정지 전지 </li><li> Primaria의 flasks 신선 15% RPE 미디어 2 ML, 다음날 (37 ° C, 5 % CO 2)까지 보육로 자리 플라스크를 추가로 세포 현탁액 3 ML 놔 </li></ol> 5. 대표 결과 hfRPE 세포 배양의 기능 검증 이전 실험에서는 플라즈마 막 수송 단백질의 표현, 편광과 기능을 파악하고 그들이 적용될 수있는 속성의 집합 유효성 검사를 제공 축적되면서 RPE 기능을 할 1-11 이러한 특성을 조절 특정 신호 경로를 확인하기 위해 이러한 기본 문화를 사용해야 각각의 세포 생성합니다. 실험 transepithelial 유체 수송 및 paracellular 경로의 무결성을 결정하는 단백질을 확인 아래에 요약. 체외 실험에서 이러한 망막 재 reattachment 6 동물 모델에서 검증되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. hfRPE 세포에서 CFTR의 현지화 왼쪽 상단 패널 :. CFTR는 멤브레인 - 농축 추출물을 사용하여 hfRPE 세포에서 발견되었다. M, 분자량 마커, 레인 1, 센터 낮은 패널의 주요 성숙 (밴드 C) 및 미숙 (A와 B 밴드) : CFTR의 immunofluorescence 지방화 (녹색 라벨) 오른쪽 상단 패널 : 보여주는 Z 평면을 통해 확대 단면보기.. Z - 축 통해 최고 강도의 투영. 조 - 1 (빨간색으로 표시) RPE의 혀끝의과 basolateral 측면을 delineating 긴밀한 연결 마커 역할을합니다. DAPI (파란색)은 핵 가까이 기저 막에있는 레이블. 조 - 1 CFTR에서 붉은 라벨 중복 녹색 형광 이후로 황색 / 오렌지 나타납니다. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. hfRPE에서 IFNγ 유발 생리적 변화 :. 기저 목욕 IFNγ의 또한 기본, 교양 hfRPE 세포 monolayer 전체 transepithelial 유체 수송 (J V)를 증가 J V는 상단 추적에 시간을 기능과 네트워크 유체로 꾸몄다 있습니다. 흡수 (기초 목욕 꼭대기의)는 긍정적인 가치로 표시되며 transepithelial 가능성 (TEP) 및 전체 조직 저항 (R T) 아래쪽의 흔적을 시간의 함수로 꾸몄다 있습니다. B : 기초 목욕 CFTRinh - 172 (5 μm의)의 추가가 IFNγ 자극 J V 증가를 저해. 다음은 체외의 결과에 hfRPE를 확인 동물 모델 실험의 예입니다. 본 실험에서는 인위적으로 만들어진 망막 분리는 크게 (그림 4 A, B) 외부 안구 표면에 IFNg를 추가 후 감소되었습니다. 이 효과는 부분에 의해 차단된 수 있습니다 캠프 차단기 (그림 4D) (1) 또한, (2) 완전히 JAK + 캠프 차단제를 추가 후 차단했습니다. 아래 이미지는 OCT 스캐너를 사용하여 얻을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 생체내 망막 분리 실험에서. 생체내 실험에서 이러한 수속은 이전에 자세하게 6 설명했습니다. 이 실험에서 망막 detachments은 subretinal 공간 (SRS), 혼자로 또는 JAK - STAT와 PKA 경로 억제제의 조합과 함께 수정된 PBS 솔루션의 0.5-3 μL의 주사로 쥐 안구에 만들어졌습니다. 각 실험은 망막 손상이 생성 후 40-70 분 초기 관리 기간을했다. 이 기간 동안 물집 볼륨의 변화의 속도는 물집 안정성을 확보하기 위해 측정되었다. 광학 일관성 tomography 이미징은 (응용 물리 연구소, 과학 러시아 아카데미 니주니 노브 고 로트, 러시아) SRS의 볼륨 변화의 시간 과정을 측정하는 데 사용되었다. 다시 첨부 권의 시간 코스매화의 변화는 광학 일관성 tomography (-10 월)에 의해 측정되었다. 초연의 크기에 변화 표시 (A, B의 화살표를하고, D) 40-70 분 앞쪽에 표면의 IFNγ 추가에 따라, 4 가지 실험 (AD 왼쪽에있는 패널)에서 OCT 이미지. 패널 A와 IFNγ는 제어 속도에서 JV 증가되는 B 쇼 (≈ 2 μl • cm 2 • 시간 -1) 각각 14, 12 μl • cm 2 • HR - 1. JAK - STAT 경로와 PKA 억제제 (C 및 D), IFNγ의 또한 다음 - 유도 흡수 속도가 크게 0.2과 7.9로 감소했습니다 μl • cm 2 • HR - 1, 각각. 화살표 점선 안에 동봉 영역 (시작 볼륨)과 비교에 대한 물집의 경계를 나타냅니다. 그림의 오른쪽 : 여러 실험에서 측정한 JV 요금의 상단 패널 - 요약, 중간 패널 동영상 ( <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/Bleb%205.wmv">여기를 클릭하세요</a> ), 낮은 패널 3D 파란색 B. Pseudocolor에 요약 실험의 섹션 공간적 t = 0에서 초연의 범위와를 나타냅니다 INFγ를 추가 후 40 분. 모든 동물 실험은 비전 연구 및 안과 문을 협회 준수 실시했다. 프로토콜은 국립 보건원의 동물 의료 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CO2-induced+ion+and+fluid+transport+in+human+retinal+pigment+epithelium.">CO2-induced ion and fluid transport in human retinal pigment epithelium.</a> J Gen Physiol. 133, 603-622 (2009).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Zahn, G., Vossmeyer, D., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha5beta1+mediates+attachment,+migration,+and+proliferation+in+human+retinal+pigment+epithelium:+relevance+for+proliferative+retinal+disease.">Integrin alpha5beta1 mediates attachment, migration, and proliferation in human retinal pigment epithelium: relevance for proliferative retinal disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5988-5996 (2009).</li><li>Peterson, W. M., Meggyesy, C., Yu, K., Miller, S. 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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

현재 실험에서, 우리는 눈을 당 사용 가능한 세포의 높은 숫자와 일치하는 hfRPE 주 문화를 생산하는 데 필요한 여러 단계를 간소화하기위한 우리의 이전에 게시된 기술 3 추가 수정을 설명합니다. 원래 프로 시저에서 각각의 변화는 엄격하게 변화가 유물을 소개하지 않았고 지속적으로 이러한 세포를 사용하는 다른 많은 실험실에서 테스트되고 있는지 확인하기 위해 여러 생리학 및 분자 생물학 실험에서 테스트되었습니다. 마지막으로, 추가 실험 동물 모델에서 유사한 perturbations에 체외 결과를 비교하기 위해 실시되었다.

악기 해부 프로토콜에 필요한 <ol><li> 스테레오 현미경 - 해부에 필요한 작업 배율 x250와 함께 사용 가능한 </li><li> 해부 접시 - 예 : 킴블 100 X 20mm # 23062 (해부 당 하나) 어떤 소스 </li><li> Sylgard 184 - WPI 캣. # SYLG184 * * 요리가 Sylgard 184은 혼합 지침을 포함에 따라 해부 준비하려면, 5-8밀리미터 계층을 형성하기 위해 페트리 접시에 혼합 액체 탄성을 따라줘. 엘라스토머 적어도 24 시간을위한 치료하실 수 있습니다. 완치 탄성체와 함께 요리는 70 %의 에탄올과 재사용 여러 번 (~ 100 번)를 사용하여 살균 수 있습니다 </li><li> BD PrecissionGlide 1 27 G의 바늘 ¼ 길이 (해부 당 5) 어떤 소스 </li><li> 칼슘과 MG의 염분을 포함하는 HBSS 1X 솔루션 - GIBCO 고양이 # 14025 500ml (여러 해부를 위해 좋은). </li><li> 이리스 가위 초경 ​​톱니 칼날, 곡선 - FST 고양이 # 14559-11 (한). </li><li> 망막 가위 - Katena 고양이 # K4 - 5300 (한). </li><li> 집게 - 예 더몬트 족집게 # 5 WPI 캣에서 광택 팁을 # 500085 (2 개). </li><li> Sideport 나이프 - 알콘, ClearCut 1mm, 듀얼 베벨, 직각 고양이 # 8065921540. </li><li> 튜브 15ml를 원심 분리기 (- 눈 당 하나) 어떤 소스 </li><li> 파스퇴르 피펫 유리 - (해부 당 하나) 어떤 소스 </li><li> 플레이트 잘 12 (해부 당 하나) 어떤 소스 </li><li> Primaria 25cm 2 플라스크 - (눈 당 2-3) 어떤 소스 </li></ol>

experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology

우리는 인간의 기본 RPE의 형태학의, 생리 및 유전 특성과 기본 인간 태아의 망막 안료 상피 (hfRPE) 문화의 합류 monolayers의 대량 생산 수있는 세포 배양 절차를 개발했습니다. 이러한 hfRPE 세포 문화는 무거운 착색을 전시하고, 전자 현미경은 광범위한 혀끝의 멤브레인 microvilli을 보여줍니다. junctional 단지는 다양한 꽉 접합 단백질의 immunofluorescence 라벨로 확인되었습니다. 이 쉽게 재현할 주요 문화 상피 극성과 기능은 밀접하게 이전에 인간을 포함하여 기본 RPE의 포유 동물 모델을 공부 유사. 이러한 결과는 인간의 안구 질환의 여러 동물 모델에 치료 개입의 발달에 의해 확장되었다. 우리는 망막이나 subretinal 공간에서 이상 유체 축적을 제거하기위한 전략에 초점을했습니다. 세포외 subretinal 공간 photoreceptor 외부 세그먼트와 RPE의 혀끝의 막을 분리 및 망막 첨부 파일의 유지 보수 및 RPE / 망막 상호 작용의 전체 호스트에 대한 중요합니다.

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Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

우리는 형태, 생리, 극성, 그리고 성인 기본 조직의 단백질과 유전자 발현 패턴을 전시 인간 태아의 망막 색소 상피 세포 (hfRPE) 세포의 culturing 합류 monolayers에 대한 재현성 방법을 제공합니다. 이 작품은 여러 가지 안과 질환의 동물 모델로 확장되었습니다.

망막 안료 상피 생리학과 Pathophysiology 연구를위한 실험 모델

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.2K 조회수.  National Institutes of Health. 우리는 형태, 생리, 극성, 그리고 성인 기본 조직의 단백질과 유전자 발현 패턴을 전시 인간 태아의 망막 색소 상피 세포 (hfRPE) 세포의 culturing 합류 monolayers에 대한 재현성 방법을 제공합니다. 이 작품은 여러 가지 안과 질환의 동물 모델로 확장되었습니다.

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Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms remain elusive mainly due to the lack of a good in vivo model for studying BEST1 and its mutations under physiological conditions. BEST1 encodes an ion channel, namely BESTROPHIN1 (BEST1), which functions in retinal pigment epithelium (RPE); however, the extremely limited accessibility to native human RPE cells represents a major challenge for scientific research. This protocol describes how to generate human RPEs bearing BEST1 disease-causing mutations by induced differentiation from human pluripotent stem cells (hPSCs). As hPSCs are self-renewable, this approach allows researchers to have a steady source of hPSC-RPEs for various experimental analyses, such as immunoblotting, immunofluorescence, and patch clamp, and thus provides a very powerful disease-in-a-dish model for BEST1-associated retinal conditions. Notably, this strategy can be applied to study RPE (patho)physiology and other genes of interest natively expressed in RPE.

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Here we present a protocol to differentiate retinal pigment epithelium (RPE) cells from human pluripotent stem cells bearing patient-derived mutations. The mutant cell lines may be used for functional analyses including immunoblotting, immunofluorescence, and patch clamp. This disease-in-a-dish approach circumvents the difficulty of obtaining native human RPE cells.

차별화, 유지 보수, 및 인간 망막 안료 상피 세포의 분석: BEST1 돌연변이 대 한 접시에 질병 모델

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

연구

유전학

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal pigmented epithelium (RPE) is a key pathobiological event in AMD. To understand the mechanisms that lead to RPE dysfunction, mouse models can be utilized by researchers. It has been established by previous studies that mice can develop RPE pathologies, some of which are observed in the eyes of individuals diagnosed with AMD. Here, we describe a phenotyping protocol to assess RPE pathologies in mice. This protocol includes the preparation and evaluation of retinal cross-sections using light microscopy and transmission electron microscopy, as well as that of RPE flat mounts by confocal microscopy. We detail the common types of murine RPE pathologies observed by these techniques and ways to quantify them through unbiased methods for statistical testing. As proof of concept, we use this RPE phenotyping protocol to quantify the RPE pathologies observed in mice overexpressing transmembrane protein 135 (Tmem135) and aged wild-type C57BL/6J mice. The main goal of this protocol is to present standard RPE phenotyping methods with unbiased quantitative assessments for scientists using mouse models of AMD.

Mouse models can be useful tools for investigating the biology of the retinal pigmented epithelium (RPE). It has been established that mice can develop an array of RPE pathologies. Here, we describe a phenotyping protocol to elucidate and quantify RPE pathologies in mice using light, transmission electron, and confocal microscopy.

연령 관련 황반변성의 마우스 모델에서 망막 색소 상피 병리를 평가하고 정량화하기 위한 프로토콜

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain the overall health and structural integrity of the photoreceptors. The RPE is polarized, exhibiting apically and basally located receptors or channels, and performs vectoral transport of water, ions, metabolites, and secretes several cytokines.
In vivo noninvasive measurements of RPE function can be made using direct-coupled ERGs (DC-ERGs). The methodology behind the DC-ERG was pioneered by Marmorstein, Peachey, and colleagues using a custom-built stimulation recording system and later demonstrated using a commercially available system. The DC-ERG technique uses glass capillaries filled with Hank&#8217;s buffered salt solution (HBSS) to measure the slower electrical responses of the RPE elicited from light-evoked concentration changes in the subretinal space due to photoreceptor activity. The prolonged light stimulus and length of the DC-ERG recording make it vulnerable to drift and noise resulting in a low yield of useable recordings. Here, we present a fast, reliable method for improving the stability of the recordings while reducing noise by using vacuum pressure to reduce/eliminate bubbles that result from outgassing of the HBSS and electrode holder. Additionally, power line artifacts are attenuated using a voltage regulator/power conditioner. We include the necessary light stimulation protocols for a commercially available ERG system as well as scripts for analysis of the DC-ERG components: c-wave, fast oscillation, light peak, and off response. Due to the improved ease of recordings and rapid analysis workflow, this simplified protocol is particularly useful in measuring age-related changes in RPE function, disease progression, and in the assessment of pharmacological intervention.

Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Here, we present a method for recording light-evoked electrical responses of the retinal pigment epithelium (RPE) in mice using a technique known as DC-ERGs first described by Marmorstein, Peachey, and colleagues in the early 2000s.

마우스 망막 안료 상피의 빛 방출 전기 응답 기록을 위한 직접 결합 된 전기 전체노그램 (DC-ERG)

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

화학

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

퇴행성 망막 질병을 위한 비인간 영장류 모형에 있는 망막 안료 상피 이식

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

의학

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular cells. Isolating, culturing, and sustaining retinal neurons in vitro have technical and biological limitations. Culturing retinal explants may overcome these limitations and offer a unique ex vivo model to study the cross-talk between various retinal cells with well-controlled biochemical parameters and independent of the vascular system. Moreover, retinal explants are an effective screening tool for studying novel pharmacological interventions in various retinal vascular and neurodegenerative diseases such as diabetic retinopathy. Here, we describe a detailed protocol for retinal explants' isolation and culture for an extended period. The manuscript also presents some of the technical problems during this procedure that may affect the desired outcomes and reproducibility of the retinal explant culture. The immunostaining of the retinal vessels, glial cells, and neurons demonstrated intact retinal capillaries and neuroglial cells after 2 weeks from the beginning of the retinal explant culture. This establishes retinal explants as a reliable tool for studying changes in the retinal vasculature and neuroglial cells under conditions that mimic retinal diseases such as diabetic retinopathy.

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

This protocol presents and describes steps for the isolation, dissection, culturing, and staining of retinal explants obtained from an adult mouse. This method is beneficial as an ex vivo model for studying different retinal neurovascular diseases such as diabetic retinopathy.

망막 신경혈관 질환 연구를 위한 생체 외 모델로서의 성인 마우스 망막의 망막 외 이식편

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

생물학

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

돼지 망막 색소 상피 세포의 1 차 배양

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and vision. Proteins on the RPE apical surface are tightly associated with proteins on the photoreceptor outer segment surface, making it difficult to consistently separate the RPE from the photoreceptors/retina. We developed a method to efficiently separate the retina from the RPE of human eyes to generate complete RPE/choroid and retina flatmounts for separate cellular analysis of the photoreceptors and RPE cells. An intravitreal injection of a high-osmolarity solution of D-mannitol, a sugar not transported by the RPE, induced the separation of the RPE and retina across the entire posterior chamber without causing damage to the RPE cell junctions. No RPE patches were observed attached to the retina. Phalloidin labeling of actin showed RPE shape preservation and allowed morphometric analysis of the entire epithelium. An artificial intelligence (AI)-based software was developed to accurately recognize and segment the RPE cell borders and quantify 30 different shape metrics. This dissection method is highly reproducible and can be easily extended to other animal models.

We describe a method to efficiently separate retinal pigment epithelium (RPE) from the retina in human eyes and generate whole RPE/choroid flatmounts for histological and morphometric analyses of the RPE.

조직학적 분석을 위해 인간의 눈에서 망막 색소 상피/맥락막 플랫마운트의 효율적이고 일관된 생성

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential application in molecular biology studies, including gene expression analyses. In the context of eye growth regulation and myopia, the RPE likely plays a role as a cellular relay for growth modulatory signals, as it is located between the retina and the two walls of the eye, such as the choroid and sclera. While protocols for isolating the RPE have been developed for both chicks and mice, these protocols have proven not to be directly translatable to the guinea pig, which has become an important and widely used mammalian myopia model. In this study, molecular biology tools were used to examine the expression of specific genes to confirm that the samples were free of contamination from the adjacent tissues. The value of this protocol has already been demonstrated in an RNA-Seq study of RPE from young pigmented guinea pigs exposed to myopia-inducing optical defocus. Beyond eye growth regulation, this protocol has other potential applications in studies of retinal diseases, including myopic maculopathy, one of the leading causes of blindness in myopes, in which the RPE has been implicated. The main advantage of this technique is that it is relatively simple and&#160;once perfected, yields high-quality RPE samples suitable for molecular biology studies, including RNA analysis.

We describe a simple and efficient method for isolating cells of the retinal pigment epithelium (RPE) cells from the eyes of young pigmented guinea pigs. This procedure allows for follow-up molecular biology studies on the isolated RPE, including gene expression analyses.

기니피그 눈에서 망막 색소 상피 세포의 분리

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

망막 변성 모델링 및 분석

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to photoreceptors and choroidal capillaries, performs phagocytosis of photoreceptor outer segments (POS), and secretes cytokines in a polarized manner for maintaining the homeostasis of the outer retina. Dysfunctional RPE, caused by mutations, aging, and environmental factors, results in the degeneration of other retinal layers and causes vision loss. A hallmark phenotypic feature of degenerating RPE is intra and sub-cellular lipid-rich deposits. These deposits are a common phenotype across different retinal degenerative diseases. To reproduce the lipid deposit phenotype of monogenic retinal degenerations in vitro, induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) was generated from patients&#39; fibroblasts. Cell lines generated from patients with Stargardt and Late-onset retinal degeneration (L-ORD) disease were fed with POS for 7 days to replicate RPE physiological function, which caused POS phagocytosis-induced pathology in these diseases. To generate a model for age-related macular degeneration (AMD), a polygenic disease associated with alternate complement activation, iRPE was challenged with alternate complement anaphylatoxins. The intra and sub-cellular lipid deposits were characterized using Nile Red, boron-dipyrromethene (BODIPY), and apolipoprotein E (APOE). To quantify the density of lipid deposits, a machine learning-based software, LipidUNet, was developed. The software was trained on maximum-intensity projection images of iRPE on culture surfaces. In the future, it will be trained to analyze three-dimensional (3D) images and quantify the volume of lipid droplets. The LipidUNet software will be a valuable resource for discovering drugs that decrease lipid accumulation in disease models.

저자 스포트라이트: 연령 관련 황반변성의 발병기전 규명 및 잠재적 치료법 발견 

Degenerative eye diseases that affect the retinal pigment epithelium layer of the eye have monogenic and polygenic origins. Several disease models and a software application, LipidUNet, have been developed to study mechanisms of disease, as well as potential therapeutic interventions.