Bu proje, Araştırma Kapasite Geliştirme Hibe (Bowling Green Eyalet Üniversitesi) tarafından desteklenmiştir.

1. Hücre sistemi tek bir molekül deney için hazırlanması <ol><li> 37 ° C çözülme ve 5 ml medya ile 25 cm 2 kültür şişesi koyarak en az bir hafta önceden, bir stok taze bir HeLa hücre hattı kültürü başlatmak, 37 hücreleri inkübe ° C,% 5 CO 2 24 saat kuvöz ve hücreler için optimum bir koşulu sağlamak için en az 3 kez bölünmüş. Ancak hücreler, onların büyüme hızı, eğilimine önemli ölçüde yavaşlaması nedeniyle 20 kat daha fazla bölünmüş olmamalıdır. HeLa hücrelerinde daha önce genetik, nükleer zarf gözenek membran proteini POM 121 erimiş GFP (yeşil floresan protein) için tasarlanmış. Çekirdek zarı kesin lokalizasyonu için gereklidir. </li><li> Bir gün önce deney, tek bir molekülün deney için tasarlanmıştır hücreler steril bir Petri kabındaki yerleştirilen bir otoklavlanmış kapak astar üzerine yayılmış olmalıdır. Lamel DMEM (Dulbecco&#39;nun modifiye Eagle orta, Grand Island, NY) 4.5 g / L glikoz, 862 mg / L GlutaMAX-I, 15 mg / ml fenol kırmızısı, 100 U / ml penisilin, 100μg/mL ile desteklenmiş askıya alınmalı streptomisin ve% 10 yeni doğan buzağı serumu. Bir kültürün tüm yüzey üzerinde eşit dağıtılmış kapak kayma başına 1 ml, hacmi olmalıdır. Bu kapak fişleri ile Petri kutularına sonra CO 2 kuvöz içine yerleştirilir ve deney öncesinde 24 saat bekletilir. Tek bir molekülün deneyi için uygun bir hücre kültürü için kapak kayma confluency hücre nükleer taşıma uygulanan faiz yıkama tamponları ve protein için iyi bir özgürlük sağlamak için% 70 geçmemelidir. </li><li> Deney günü, silikon yağ ayırıcılar olarak iki satırlık bir üst kapağı ile birlikte kayma ekleyerek, akış odaları inşa edildi. Bu hücrelerin hazırlanması sırasında kuru değil emin olmak için şarttır. Biz genellikle, bir kapak yapılmış iki odadan deney için iki farklı koşullar izin kaymayı tercih. Üst kapağı yaklaşık 6mm2 Kimwipe ters yerleştirildi elmas bıçakla kesilmiş cam kapak kayma küçük dilimler sığar. İki satır silikon gres ince sıkıca yağ boncuk boyutunu kontrol Parafilm ile bağlı bir pipet 10 ml plastik şırınga ile kapak fişleri kenarları boyunca yerleştirilir. </li><li> Sonra HeLa hücre kaplı slayt damla kurutulmuş ve yapıştırıcı olarak gres yağı ile bir ev işlenmiş alüminyum çerçeve monte - öfke, mikroskop numune tutucu slayt tutmak için hizmet. </li><li> Gres iki çizgi ile üst kapağı fişleri sonra bir akış odasının oluşturan hücre kaplı slayt üzerinde ters sivri uçlu bir cımbız ve sonra tutuklandılar. Yağlanmış kenarları lamel üzerine hafifçe bastırılarak nispeten sağlam bir eklenti yapıldı. </li><li> Bir hücre kaplı slayt üzerinde yapılan iki ayrı odaları, çapraz bulaşmayı önlemek için iyi bir sızdırmazlık sağlamak için esastır. Bu amaç için silikon gres birkaç satır dışında mühür slayt alt üst odaları arasında uygulandı. Gres birkaç satır odalarının dış tarafta da konuldu. </li><li> DMEM medya sonra hücrelerin kurumasını önlemek için akış odasına eklendi. Çözüm akış akış odaları çıkış tarafında sıvı dışarı emmek için küçük bir parça filtre kağıdı ile terfi etti. Kararlı ellerle, çözüm mikropipet tarafından tek elle akış odasının bir tarafında aynı anda eklenen olabilir ve filtre kağıdı ile diğer tarafında emilir. </li><li> İnşaattan sonra, slayt alt iki kez su ile ıslatılmış bir pamuk uçlu çubukla ile yıkanır ve sonra iki kez% 100 etanol ile. </li><li> Slayt mikroskop üzerine monte edildikten sonra, hücreleri, 2 X 25 mcL ithalat tamponu (20 mM Hepes, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA pH 7.3) ile yıkanır. Bu hücreler daha sonra, ithalat tampon 2 X 25 mcL 40 mcg / mL digitonin ~ 2 dakika için permeabilize ve 2 X 25 mcL ithalat tamponu (20 mM Hepes, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM ile tekrar yıkanır 360 kDa); EGTA, pH 7.3),% 1.5 Polyvinylpyrrolidone (PVP ile desteklenmiş. Parlak alanını kullanarak gerçek zamanlı permeabilization izlemek için gerekli olabilir. Çekirdeklerin osmotik şişme önlemek için digitonin sonra PVP tüm ithalat tampon çözeltiler dahil edildi. Kontrollü bir sitoplazmik ortam ile birlikte sağlam bir çekirdeği, bize karmaşık nükleer taşıma adım adım aydınlatmak için büyük ölçüde basitleştirilmiş bir taşıma sistemi sağlar. Sisteme yapılan Önceki topluluğu ve tek-molekül deneyler büyük nükleer taşıma anlayışlar sağladı. </li></ol> 2. Nükleer taşıma deney için gerekli proteinlerin hazırlanması <ol><li> Geleneksel bir bakteriyel dönüşüm sayesinde E.coli (JM109) özel suşları sorumlu genlerin eksprese amacıyla tasarlanmıştır.yukarıda belirtilen faiz proteinlerin üretimi ve -80 ° C&#39;de stokta tutulur (NLS-2xGFP için Invitrogen pTrcHisB vektör). Ampisilin 5μL eklenmesi ile, E. Coli hücrelerin ifade floresan veya kargo protein dondurulmuş stokları loopful veya ~ 50 mcL LB medya 5ml için transfer (U 1000) ve 37 gece sallayarak ° C 225 rpm&#39;de aerobik büyüdü . </li><li> 24 saat sonra doymuş kültürünün 500 mcL 500 ml LB medya içine transfer edilir ve 37 ° C inkübatör sarsılmış 5-6 saat için ek 250 mcL IPTG (İzopropil _-D-1-thiogalactopyranoside) ve başka bir inkübe 5-6 saat. IPTG lacZ gen ilgi ve IPTG gen ile değiştirilir lac operonunun, transkripsiyon gen ekspresyonu sonra ikna etmek için kullanılır tetikler bir laktoz metaboliti çünkü gereklidir. </li><li> Kültürü, daha sonra 12000 rpm&#39;de 15 dakika boyunca yüksek hızda santrifüj soğutma bükülmüş ve süpernatantı atılır. Hücreler daha sonra 40 ml hacmi 1 gram başına bir pelet 10 ml dayalı olmalıdır CelLytic B (afinite saflaştırma ve analiz için uygun olan proteinlerin hızlı ve etkili ekstraksiyon CelLytic B sonuçları.) Yeniden süspanse. Merkaptoetanol, 28 ul hücre parçalama sonra ilgi proteinleri sindiren proteazlar devre dışı bırakmak için, disülfit bağları ve phenylmethanesulphonyl florür 400 ul kırmak için eklenir. Protein özleri hedefler için analizden önce aşağılamak olmadığını sağlamak için; &quot;proteaz kokteyl&quot; de (2 mg / ml tripsin inhibitörü 400 mcL 0.2 mg / ml, 0.2 mg / ml leupeptin pepstatin A. 400 mcL 400 mcL) eklenir çıkar. Daha sonra 400 mcL 1M imidazol ekleyin, 5 phosphodinucleotide ve oligonükleotid istenmeyen tek ve çift iplikli DNA aşağılamak için kullanılan DNaz I kromatografi sütun ve 1mm boncuk yüzeye bağlı Ni iyonları, bağlı etiketli proteinlerin Zehir için kullanılır parçaları. </li><li> Soğutma santrifüj 10000 rpm&#39;de 60 dakika, 30 dakika boyunca buz üzerinde reaksiyon için yeterli bir süre, spin izin karanlıkta karışımı karıştırın. Süpernatant Hasat ve kromatografi için hazırlık olarak 3 dakika boyunca maksimum hızda mikrofuge&#39;de santrifüj tüplerine iplik ve lizis tamponu ile yıkama, karışımın kadar eğirme ve yıkama tekrar Ni-NTA (Qiagen nikel nitrilotriacetic asit Superflow) infüzyon gerçekleştirmek Herhangi bir mavi tonu açık. Yavaş yavaş ortaya çıkan karışım, 60 dakika boyunca buz üzerinde karanlık bir kapta karıştırın. </li><li> Kolon kromatografisi 12 kesirler aşağıdaki gibi akan gerçekleştirin. İlk bölümü önceki adımda Ni-NTA ile karıştırılarak 10 ml süpernatant ile bir akış. Ikinci Lizis tampon 10 ml (50 mM Na-fosfat, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8.0), üçüncü 10 tampon mL (10 mM imidazol, 100 mM NaCl, pH 8.0), dördüncü ve geri kalanı elüsyon tamponu 0.5 ml (250 mM imidazol, 100 mM NaCl, pH 8.0) </li><li> SDS-PAGE poliakrilamid jel hazırlayın ve bir kısmını 4 mcL ve 5X SB (300mm Tris 6.8,% 25 Bme,% 10 SDS,% 50 gliserol) 1 mcL karıştırma numunesinin. Standart Invitrogen tarafından 100 kb DNA merdiveni kullandı. Yüklemeden önce 5 dakika boyunca örnekleri kaynatılır. Yükledikten sonra, 60 dakika için 120V jel koştu. Sonra, lekeli destained ve nihayet 80C az 2 saat için özel bir jel kurutma makinesi kurutulur. </li><li> Daha sonra jel sonuçları incelendi ve en iyi sonucu vermiştir kesirler yer. Bizim ilgi protein bağlı olarak, bantların bir proteinin büyüklüğü sırasıyla yer olmalıdır. Bu bölümü MonoQ Superdex 200 (Amersham Pharmacia) ile daha fazla protein saflaştırılması için seçilmiş olmalıdır. </li><li> Konsantrasyon, her zaman, 5 dakika boyunca 14 rpm&#39;de gözenek boyutu 10K Nanosep filtre en yoğun kesirler iplik elüsyon tamponu ile yıkama yapılır. BSA tahlil daha fazla protein etiketleme prosedürü için kullanan son protein konsantrasyonu belirlemek için gerekli. </li><li> NLS-2xGFP içsel yeşil floresan fotoğraf istikrar yoksul ve hücre otofloresans ile çakışan spektrumu nedeniyle nükleer ulaşım tek molekül görüntüleme için kullanılan olamaz. Bu nedenle, biz TCEP tris (2 düşüldükten sonra 50 mM sodyum fosfat, 150 mM NaCl 2 saat boyunca oda sıcaklığında bir sistein-reaktif organik boya (Molecular Probes Alexa555 veya Alexa 647 maleimide) aşırı yük molekülleri etiket 20 dakika boyunca carboxyethyl). 2-merkaptoetanol Reaksiyonlar söndürülür ve protein çözümleri, ücretsiz boya kaldırmak için diyalize. </li></ol> 3. Tek molekül mikroskopi <ol><li> Bizim mikroskop kurmak 1.4 NA 100x yağ immersiyon objektif (UPLSAPO 100XO, Olympus) ile donatılmış bir Olympus IX81, 35 mW 633 nm GFP filtre ile cıva lambası He-Ne lazeri (Melles Griot), bir çip çarpma kazanç şarj çiftli aygıt kamera (Cascade 128 +, Roper Bilimsel) ve thveri toplama ve işleme için e Slidebook yazılım paketi (Akıllı Görüntü Yenilikler). Optik bir kıyıcı (Newport) lazer uyarma bir on-off modu oluşturmak için kullanılır oldu. GFP ve Alexa647 floresan sırasıyla cıva lambası ve 633 nm lazer heyecanlıydı. Dikroik filtre (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) ve emisyon filtresi (NF01-405/488/561/635-25X5 filtre aynı amacı, yeşil ve kırmızı floresan emisyon toplanmıştır. 0, Semrock) ve benzer bir CCD kamera tarafından görüntülendi. </li><li> Tek molekül deneylerde, taşıma süresi daha uzun olması için tek bir kargo molekülün floresan photobleaching zaman olanak tanır. Photobleaching zamanı belirlemek için, 0.1 nM kargo molekülleri, non-spesifik emilim nedeniyle 30 dakika sonra kayma ve hareketsiz hale bir cam kapak kaplanmıştır. Sonra, floresan zaman ders ölçülür. Faiz photobleach kez protein bağlı olarak, bu nedenle, aydınlatma şiddeti ve aydınlatma alanında maleimides ile reaksiyona yetenekli cysteins sayısına göre farklı olacaktır, bir ön photobleaching neden ayarlanabilir olmalı ve Alexa 647 ekran etiketli yükün molekülleri sigorta kargoların NPC&#39;ler ile etkileşime daha uzun floresan. </li><li> Permeabilize hücreleri ithalat deneyler için, kargo ve temel taşıma kofaktör birlikte ilave edilmiştir. Tipik ithal kargo reaksiyonları 1 mM GTP, 0.5 mcM içerdiği Importin, 0.5 mcM Importin-1, 2 mcM Ran ve pasif taşıma için 10KDa Dextran&#39;ın kolaylaştırılmış taşıma ve 0.1 nM 1 mcM NTF2 .. Floresan kargo konsantrasyonları toplu deneylerde&gt; 100 nM, ve tek bir molekül deneyleri için 100 pM ~. Bu konsantrasyonlarda, kargo% 99 Importin ve Importin komplekslerini oluşturmak için bekleniyor. Ulaştırma oranı Epifloresans (sadece nispi oranları önemli olsaydı) veya konfokal floresan mikroskobu (mutlak oranları istenilen olsaydı) tarafından takip edildi. </li><li> İlk nükleer zarfın konumunu GFP filtreler NE bir resim çekmek için bir dizi ile ilgi çekici bir HBO cıva lambası, geniş alan Epifloresans mikroskobu ile tespit edilmiştir. Bir satır veya sütun içinde piksel yoğunlukları yaklaşık dik NE Gauss ile uygun. Piksel yoğunlukları belirli bir kümesi için Gauss tepe pozisyonlarda o satır ve sütun için KD konumunu kabul edildi. Gibi Gauss bir dizi tepe pozisyonlarda daha sonra tüm görüntü içinde KD yolunda verimli bir ikinci derece polinom uygun. </li><li> KD lokalize sonra tamamen photobleached kadar, 633 nm He-Ne lazer kullanan tüm otofloresans kurtulmak için çok önemlidir, genellikle üzerinde 60 saniye yeterli olacaktır. </li><li> Örnek molekülleri sonra PVP% 1.5 çözümü tutulacak ve karışımın hacmi 25 L akış odasına eklenen ve daha sonra filtre kağıdı bir fitil uygulayarak haznesinden sürükledi. Odak herhangi bir kuvvetli hareket tarafından kolaylıkla bozulacak çünkü mutlak bir bakım, doğru çekirdek zarı localisation sonra permeabilize hücrelere ithalat kargo proteinlerin yanı sıra üzerine alınmalıdır. </li><li> En kısa sürede kargo moleküller, He-Ne lazer moleküllerin transit taşımacılık yörüngeleri aydınlatmak için kullanılan 633 nm eklenir. Optik bir kıyıcı (Newport), yüksek güç yoğunluğu, lazer gibi olmayan photobleached tek moleküllerin bir bölümü NE yaklaşmasına izin photobleaching nedeniyle önlemek için yaklaşık 5 Hz&#39;de meşgul olmalıdır. 2500 Hz kadar gidebilir yüksek hızlı CCD kamera ile çekilen videoların tek bir molekül translokasyonlar bir dizi olmalıdır. </li></ol> 4. Temsilcisi sonuçları Doğru şekilde gerçekleştirilmemesi, protokol bize bir dizi permeabilize HeLa POM 121 hücrelerde nükleer gözenek kompleksi ile etkileşim tek kargo moleküllerin translokasyon gösteren videolar toplamak için izin verdi. (Şekil 1). Biz görüntü için yola çıkan ve stably GFP-POM121 ifade digitonin permeabilize HeLa hücreleri NPC ile dekstran moleküllerin geçici taşıma adımları izlemek. Hücreler etiketli dekstran moleküllerin düşük konsantrasyonlarda ile inkübe edildi. Çekirdeğin ekvator düzleminde bir 488-nm cıva lambası ışığı tarafından heyecan GFP floresan yeşil halka açık bir görüntü ile odak noktası haline getirilmiştir. GFP-KD uzun süre maruz kalma NE orta düzlemine yerelleştirmek mükemmel bir sinyal-gürültü (SNR) oranı elde etmemizi sağlar. Daha önce 10 kDa dekstran molekülleri, 500 ya da 1000 Hz&#39;lik bir algılama kare hızı yaklaşık 20-40 mil mekansal çözünürlükte yaklaşık 2 ms içinde KD ile diffüz bulundu. Böyle bir uzaysal çözünürlük, pasif difüzyon için daha uzamsal bilgiyi açıklamak için yeterli değildir NPC aracılığıyla sadece dekstran moleküllerin 01:59 difüzyon adımları yakalamak sağlar. NPC içinde dekstran moleküllerin daha ince adımları yakalamak için daha iyi bir spati2500 Hz daha hızlı bir algılama kare hızı daha ince difüzyon adımları yakalamak için uyarlamak için; (i) ve (ii) daha yüksek bir aydınlatma optik yoğunluk elde etmek için tek moleküllerin daha fazla fotonlar heyecanlandırmak için istihdam için: otemporal çözünürlük, biz iki önemli iyileştirmeler yaptık yüksek uzaysal çözünürlük. Bu gelişmeler bize bir uzaysal çözünürlüğe sahip 12 nm ve 400 ms, 100 kW / cm 2 radyasyonunun az 633 nm lazer ışığı NE genelinde alexa647 etiketli dekstran molekülleri geçici difüzyon birden fazla adımları yakalamak için olanak sağlar . Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, dekstran moleküllerin tipik ulaşım olayların bir dizi hareketsiz görüntü kaydedildi. Bireysel transit dekstran moleküllerin uzaysal yörüngeleri takip ederek, KD aracılığıyla difüzyon ince adımları ayırt edildi. Biz yaklaşık% 30 KD ile etkileşim olaylar kaynaklanan ve hedef bölmeleri kabul etmiş olduğu bulundu. Sitoplazmaya KD hareket dekstran moleküller, aralarında iki hedef var: NE aracılığıyla difüzyon sonra çekirdeğinde sonu veya ihracat olaylar için benzer durumlar meydana KD ile etkileşim sonra sitoplazmaya geri dönmek: çekirdeğin başlayarak dekstran molekülleri sitoplazma girmek veya KD ile etkileşim sonra çekirdeğine geri diffüz. Böyle bir görüntü serisi NPC ile ilgili olarak, NPC aracılığıyla moleküllerin bekleme süresi gibi zamansal bilgileri ile tek moleküllerin uzaysal konumu hakkında bilgi içerir. NE alanı çevresinde dekstran moleküllerin yörüngeleri analiz ederek, taşıma süresi, verimlilik ve giriş frekansı tespit edilebilir. Işimizde taşıma süresini ithalat veya ihracat süresi olarak tespit edilebilir. Bunlar ortalama ithalat veya ihracat geçiren NPC&#39;ler içinde dekstran moleküllerin bekleme süresi olarak tanımlandı. Ithalat veya ihracat verimliliği tam bir ithalat veya ihracat olayları tam ve prematüre olayların toplamı üzerinden yüzde olarak tanımlanmıştır. Ithalat veya ihracat giriş frekansı, bir saniye boyunca KD ile etkileşen moleküllerin sayısını ifade eder. <img src="/files/ftp_upload/2040/2040fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 KD aracılığıyla dekstran moleküllerin tipik ulaşım olayların seçilen video kareleri. (A) sitoplazma-to-çekirdek olay. Tek bir dekstran molekülü (kırmızı nokta), KD (yeşil piksel hattı) ile etkileşim, sitoplazma başladı ve çekirdeğinde sona erdi. Olay (mavi çizgiler ve açık noktalar) yörüngeleri belirlenir ve KD (siyah çizgi) ile üst üste. Yeşil ve kırmızı çizgiler, sitoplazma ve nükleer yan KD 100 nm-mesafe temsil eder. C, sitoplazma. N, çekirdeği. Ölçek çubuğu: 2 mm. (B) sitoplazma-sitoplazma olay. (C) çekirdeği-to-çekirdek bir olay. (D) çekirdeği-sitoplazma olay.

<ol>
	<li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex.">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , (2010).</li><li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability.">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , .</li><li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy.">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li><li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes.">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li></ol>

Bakım Deney sırasında, KD ve tek moleküllerin uygun bir ko sigorta alınmalıdır. Sinyal düşük kötü etiketleme veya photobleaching nedeniyle, özellikle yüksek sinyal gürültü oranı sağlamak için de önemlidir. Yerelleştirme hassas arka plan gürültüsü (out-of-focus floresan, CCD okuma gürültü, karanlık ve diğer faktörlerden kaynaklanan) ile sınırlıdır.

single-molecule imaging of nuclear transport

Tek bir molekülün floresan mikroskopi yaklaşımlar programı, son on yıl içinde biyolojik reaksiyonlar anlamak içinde büyük bir boşuna kanıtlanmıştır. , Hücre içinde derin yüksek zamansal ve mekansal kararları moleküler etkileşimler soruşturma nedeniyle tek tek moleküllerin kaynaklanan doğal olarak zayıf sinyaller zorlu kalmıştır. Yang ve ark tarafından yapılan son çalışmalar. dar alan Epifloresans mikroskopi tek molekül düzeyinde Nükleositoplazmik taşıma görselleştirme izin verdiğini göstermiştir. Sinyal bağımlı ve bağımsız kargo moleküller için tek bir molekülün yaklaşım, önemli kinetik, nükleer taşıma süresi ve verimlilik gibi, olarak elde edilmiştir. Burada, geliştirilmiş bir uzaysal çözünürlüğe sahip 0.4 ms ve 12 nm metodolojik yaklaşım için bir protokol. Geliştirilmiş çözünürlük, bizi yarı sağlam hücreler nükleer gözenek kompleksleri (NPC) ile geçici aktif transport ve pasif difüzyon olayları yakalamak için olanak sağladı. Bu yöntem, hücrelerin içindeki diğer bağlayıcı ve ticareti olayların nedenlerine açıklık kullanılmak üzere bekliyoruz.

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport at JoVE.com

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Tek molekül mikroskopi, nükleer taşıma yeni bakış açıları sağlanan Yaklaşım.

Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

single-molecule-imaging-of-nuclear-transport

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Görüntüleme.  Bowling Green State University. Tek molekül mikroskopi, nükleer taşıma yeni bakış açıları sağlanan Yaklaşım.

Video: Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Çift katlı Elastik Özellikleri İzleme Değişiklikler için Tek Molekül Yöntemleri

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Biyoloji

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Gen Yönetmelik Tek molekül Görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt; Dilinim tarafından Cotranslational Aktivasyon (CoTrAC) kullanma

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Bir Proteoliposome Tabanlı effluks Deney Cl Tek-molekül Properties belirleme<sup&gt; -</sup&gt; Kanallar ve Nakliyeciler

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

Siteye Özgü DNA Bölünmesi için Paralel Yüksek İş Kinetik Test

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Protein Etkileşimlerinin Canlı Hücre Tek Moleküllü Görüntüleme Tabanlı Miktar Tayini

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

Yazar Spotlight: Canlı İnsan Hücrelerinde Protein-Kondensat Dinamiklerinin Değerlendirilmesi

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

Methods Article

Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma