Bu yöntem, belirli bir hücresel granüler bir ilaç teslim nasıl gibi ilaç teslimat alanında anahtar soruya cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, gazın nükleer translokasyonunun ışıkla indüklenebilen olmasıdır. Prosedürü gösteren Rina Mogaki ve Akio Arisaka benim grup yüksek lisans öğrencileri olacaktır.
Başka bir yerde daha ayrıntılı olarak açıklandığı gibi kafesli moleküler tutkal bağlı dibenzocyclooctyne sentezleyerek kuantum nokta bağlantılı kafes moleküler tutkal hazırlamak için. Kuru DMSO'da kafesli moleküler tutkal bağlantılı dibenzocyclooctyne'nin 10 milimolar stok çözeltisini hazırlayın. Sonra ilk aseye fonksiyonel kuantum nokta yaparak kuantum nokta bağlantılı kafesli moleküler tutkal hazırlamak.
Bunu başarmak için DMF'de 125 mikromolar aseye PEG4 NHS esterinden 100 mikrolitre, amin fonksiyonel peg ile kaplanmış 500 nanomolar kuantum noktaiçeren bir DMF çözeltisinin 400 mikrolitresine ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat boyunca karışımı karıştırın. Elde edilen çözeltiyi rejenere selüloz membranına yerleştirin ve 800 ml DMF'ye karşı 24 saat diyalize alın.
Sonraki dmf ile 50 mikromolar için kafesli moleküler tutkal bağlı dibenzocyclooctyne stok çözeltisi seyreltmek ve sonrası diyaliz çözeltisine 200 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında üç saat boyunca karışımı karıştırın. Daha sonra 25000 moleküler ağırlığı kesilmiş bir rejenere selüloz membran kullanarak taze DMF 800 ml karşı 24 saat boyunca ortaya çıkan karışımı diyaliz.
24 saat sonra dmf ile 200 nanomolar elde edilen çözelti seyreltmek. Standart kültür koşullarında %10 FBS içeren Eagle'ın minimal esansiyel ortamda insan hepatosellüler karsinomu HEP3 B-hücrelerini koruyun. Bir gün önce deney tohum 5000 HEP3 B-hücreleri kültür 200 mikrolitre 8 odalı cam slayt her kuyuiçine.
Sonra slayt kapağı ve 24 saat boyunca bir kuvöz içine yerleştirin. Ertesi gün kültür ortamını kaldırın ve hücreleri önceden ısıtılmış 100 mikrolitre pbs ile iki kez durula. 8 odalı slayt her kuyuiçin bir floresan boyalı kafesli moleküler tutkal 10 mikromografi içeren FBS serbest orta 200 mikrolitre ekleyin.
3 saat kuluçkadan sonra kültür ortamını çıkarın ve hücre örneğini 100 mikrolitre PBS ile iki kez durula. Endozomları görselleştirmek için LysoTracker Red gibi ek bir kırmızı floresan boya 100 nanomolar içeren kültür medya 200 mikrolitre ekleyin. Ortaya çıkan hücre örneğini 20 dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra kültür ortamını çıkarın ve hücre örneğini 100 mikrolitre PBS ile iki kez durulayın. Daha sonra hücreleri kültür ortamının 200 mikrolitresine geri döndürün. Floresanboya ile dolmuş kafesli moleküler yapıştırıcının nükleer translokasyona neden olması için hücreleri 365 nanometre bandpass filtreyle donatılmış 100 watt'lık bir kson ışık kaynağının altına yerleştirin.
Hücreleri 2 dakika UV ışığına maruz bırakın. Bu süre boyunca karanlıkta UV maruz kalmadan kontrol hücresi örneğini tutun. Cam yüzeylerin kapağı verimli UV ışınlarına maruz kalmak için çıkarılabilir ancak UV ışığına uzun süre maruz kalma hücre ölümüne neden olabileceğinden dikkatli olun.
Çekirdekleri görselleştirmek için kültür ortamına bir mikrolitre Hoeschst lekesi ekleyin. Ortaya çıkan hücre örneğini 10 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra örneği bir konfokal lazer tarama mikroskobu sahnesine yerleştirin.
Floresan boyalı kafesli moleküler tutkal, LysoTracker Kırmızı ve nükleer leke için mikrograflar kaydedin. Daha önce gösterildiği gibi, tohum 5000 insan hepatosellüler karsinom HEP3 B-hücreleri her kuyu içine 8 kuyu odası slayt ve kültür standart koşullar altında 24 saat. Hücre örneklerini floresan boyalı kafesli moleküler tutkal içeren 200 mikrolitre FBS serbest kültür ortamı ile tedarik edin.
Ortaya çıkan hücre örneğini 3 saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra kültür ortamını çıkarın ve hücre örneğini 100 mikrolitre PBS ile iki kez durulayın. Hücreleri 200 mikrolitre kültür ortamına döndürün.
Daha sonra örnek konfokal lazer tarama mikroskobu tabi ve eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi mikrograflar kaydedin. Daha önce gösterildiği gibi tohum 5000 insan hepatosellüler karsinom HEP3 B-hücreleri her kuyu içine 8 kuyu odası slayt ve kültür standart koşullar altında 24 saat. Hücre örneklerini 200 mikrolitre FBS serbest kültür ortamı içeren kuantum nokta bağlantılı kafesli moleküler tutkal 10 nanomolar ile tedarik edin.
Ortaya çıkan hücre örneğini 3 saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra orta yıkın ve hücre örneğini 100 mikrolitre PBS ile iki kez durulayın. Duruladıktan sonra hücreler 200 mikrolitre kültür ortamına geri dönerler.
Daha sonra plakayı 365 nanometre bandpass filtreile donatılmış 100 watt'lık bir xenon ışık kaynağının altına yerleştirin. Kontrol örneklerini karanlıkta tutarak hücre örneğini 2 dakika UV ışığına maruz bırakın. Çekirdekleri görselleştirmek için kültür ortamına 1 mikrolitre Hoechst lekesi ekleyin.
Ortaya çıkan hücre örneğini 10 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra hücreleri bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak görüntü. Tohum insan hepatosellüler karsinom HEP3 B-hücreleri bir gün önce deney de 5000 hücreleri de bir 96 iyi kültür plaka içine.
Daha sonra 200 mikrolitre kültür ortamı ile hücreleri kaplayın ve sonra 24 saat boyunca bir kuvözde plaka yerleştirin. Ertesi gün kültür ortamını çıkarın ve hücre örneğini 100 mikrolitre PBS ile iki kez durula. Daha sonra 0,1 ila 100 mikromolar arasında değişen konsantrasyonlarda floresan boyalı kafesli moleküler tutkal içeren FBS serbest kültür ortamı 200 mikrolitre ekleyin.
3 saat boyunca plaka kuluçka ve sonra UV ışık kaynağı nın altına bir plaka yerleştirin. Kontrol örneklerini karanlıkta tutarak hücre örneğini 2 dakika UV ışığına maruz bırakın. Hücre Sayma Kiti-8 reaktifinin 10 mikrolitresinde UV maruziyetini takiben kültür ortamına ve ortaya çıkan hücre örneğini 2 saat kuluçkaya yatırın.
Sonra bir mikroplaka okuyucu kullanarak 450 nanometre de örneklerin emilimini okuyun. Fotoğraf radyasyonu HEP3 B-hücreleri floresan boyalı kafesli moleküler tutkal ile kuluçkadan önce iç floresan emisyon punctate lysoTracker Kırmızı gösteren benzer bir mikrograf floresan boyalı kafesli moleküler tutkal endozozos lokalize olduğunu gösterir. Buna göre floresan boyalı kafesli moleküler tutkal atayan floresan emisyon UV radyasyonu öncesinde hücre çekirdeği dışında gözlenmiştir.
UV radyasyonundan sonra floresan boyalı kafesli moleküler yapıştırıcının kafessiz olarak sitoplazmaya ve hücre çekirdeğine geçirilir. Floresan boyalı kafesli moleküler tutkal böyle bir nükleer çeviri kızılötesi ışık yakın 2-foton tarafından seçici site indüklenebilir. Floresan boyalı kafesli moleküler tutkal ışınsız alanlarda endozoslardan kaçmadı ve floresan delinme olarak kaldı.
Dendritik kafesli moleküler tutkal etiketleri de hücre çekirdeğiiçine kuantum nokta gibi makromoleküler misafirler sunabilir. Bu konjugates hücrelere alınabilir ve UV maruziyetinden sonra 2 dakika boyunca kuantum noktalarının floresan salınımı çekirdeğin içinde görülebilir. Bu gelişmeden sonra bu teknik, gen terapisi alanında araştırmacıların düşük yan etki tedavisini keşfetmelerinin önünü açmıştır.
