Este projecto foi apoiado pela Research Enhancement Capacidade Grant (Bowling Green State University).

1. Preparação do sistema de célula para a experiência única molécula <ol><li> Pelo menos uma semana de antecedência, começar uma cultura fresca de linhagem de células HeLa de um estoque de descongelamento a 37 ° C e colocar em uma garrafa de cultura 25 cm 2, com 5 mL de mídia, Incubar as células a 37 ° C dentro de 5% CO 2 incubadora por 24 horas e dividi-lo pelo menos 3 vezes a fim de proporcionar uma melhor condição para as células. No entanto as células não deve ser dividido mais de 20 vezes devido à tendência de sua taxa de crescimento a abrandar de forma significativa. Células HeLa foram previamente geneticamente modificados para ter GFP (proteína fluorescente verde) fundida ao nuclear proteína de membrana envelope poros POM 121. É necessário para uma localização precisa do envelope nuclear. </li><li> Um dia antes do experimento, células destinados a uma experiência única molécula deve ser espalhado sobre uma lamínula autoclavado colocado em uma placa de Petri estéril. A lamela deve ser suspenso em DMEM (meio modificado Dulbecco Águia, Grand Island, NY) suplementado com 4,5 g / L de glicose, 862 mg / L Glutamax-I, 15 vermelho mg / mL de fenol, a 100 U / mL de penicilina, 100μg/mL estreptomicina e 10% soro de vitelo recém-nascido. O volume de uma cultura deve ser 1mL por lamínula, uniformemente distribuídos em toda a superfície. Estas placas de Petri com o lamínulas, em seguida, são colocados na incubadora de CO 2 e mantido por 24 horas antes do experimento. Para que uma cultura de células para ser adequado para uma experiência única molécula na célula confluência da lamínula não deve ultrapassar 70% para fornecer uma liberdade boa para buffers de lavagem e proteínas de interesse submetidos ao transporte nuclear. </li><li> No dia do experimento, o fluxo de câmaras foram construídas pela adição de uma tampa superior deslizamento juntamente com duas linhas de graxa de silicone como espaçadores. É essencial para se certificar de que as células não sequem durante a preparação. Nós geralmente preferem ter duas câmaras feitas em uma tampa de deslizamento para permitir que duas condições diferentes para o experimento. A tampa superior desliza pequenas lascas de deslizamento tampa de vidro cortado com uma faca de diamante de aproximadamente 6mm2 foram colocados de cabeça para baixo em um Kimwipe. Duas linhas de graxa de silicone foram colocados ao longo finamente ele bordas das lamínulas com uma seringa de plástico de 10 mL que tinha uma ponta de pipeta firmemente unido com Parafilm para controlar o tamanho da massa do grânulo. </li><li> O slide de células HeLa foi então revestido por gotejamento-dried e montado com graxa como a colagem em uma moldura de alumínio usinado em casa - temperamento, que serviu para segurar o slide no porta-amostras do microscópio. </li><li> Os deslizamentos tampa superior com as duas linhas de graxa foram, então, pegou com uma pinça e depois apontou invertida sobre a lâmina de células-revestido, formando uma câmara de fluxo. Um anexo relativamente firme foi feita pressionando delicadamente sobre as bordas da lamínula untada. </li><li> Desde que fez duas câmaras separadas em uma lâmina de células-revestido é essencial para proporcionar uma boa vedação para evitar a contaminação cruzada. Para este efeito, várias linhas de graxa de silicone foram aplicados em entre as câmaras a partir do topo para o fundo do slide para selar o intervalo. Várias linhas de graxa também foram colocados no lado externo das câmaras. </li><li> DMEM mídia foi então adicionada à câmara de fluxo para evitar que as células de secar. Fluxo de solução foi promovido por um pequeno pedaço de papel de filtro para absorver o líquido para fora do lado da saída das câmaras de fluxo. Com mãos firmes, a solução poderia ser acrescentado simultaneamente por micropipeta para o lado do fluxo de câmara com uma mão, e absorvida do outro lado por papel de filtro. </li><li> Após a construção, na parte inferior da lâmina foi lavada com um cotonete molhado com ponta de algodão, duas vezes com água, e depois duas vezes com etanol 100%. </li><li> Uma vez que a lâmina é montada sobre o microscópio, as células lavadas com tampão 2 X 25 mL de importação (20 Hepes mM, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3). As células permeabilizadas, em seguida, por aproximadamente 2 minutos, com 2 X 25 mL 40 digitonina mcg / mL em tampão importação e lavados novamente com 2 X 25 mL tampão importação (20 HEPES mM, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3) suplementado com 1,5% de polivinilpirrolidona (PVP; kDa 360). Pode ser necessário controlar a permeabilização em tempo real, usando o campo brilhante. PVP foi incluído em todas as soluções tampão de importação após digitonina para evitar inchaço osmótica dos núcleos. O núcleo intacto, juntamente com um ambiente controlado citoplasmática, fornece um sistema de transporte muito simplificada que nos permite elucidar a etapa de transporte complicado nuclear a passo. Ensemble anterior e única molécula de experimentos que realizou no sistema têm proporcionado grandes conhecimentos no transporte nuclear. </li></ol> 2. Preparação de proteínas essenciais para a experiência de transporte nuclear <ol><li> Por meio de uma transformação convencionais bacteriana das cepas de E.coli especiais (JM109) foram projetados de forma a superexpressão dos genes responsáveis ​​pelaprodução de proteínas acima de interesse e são mantidos em estoque a -80 ° C. (Para NLS-2xGFP usamos pTrcHisB vetor por Invitrogen). A loopful ou ~ 50 mL de estoques congelados de proteína fluorescente ou carga expressando células de E. coli são transferidos para 5 mL dos meios de comunicação LB com adição de 5μL de ampicilina (U 1000) e cresceu aerobicamente com agitação durante a noite a 37 ° C a 225 rpm. </li><li> Após 24 horas 500 mL da cultura saturada é transferido para 500 mL de meios LB e abalado nos 37 ° C incubadora de 5-6 horas após a adição de 250 mL IPTG (isopropil _-D-1-thiogalactopyranoside) e incubadas por mais 5-6 horas. É necessário porque IPTG é um metabólito lactose que desencadeia a transcrição do operon lac, onde o gene lacZ é substituído pelo gene de interesse e IPTG é então usada para induzir a expressão do gene. </li><li> A cultura é, então, girou na centrífuga de alta velocidade de resfriamento a 12000 rpm por 15 minutos eo sobrenadante é descartado. Células são então ressuspendido em 40 mL de CelLytic B (resultados CelLytic B na extração rápida e eficiente de proteínas que são apropriados para purificação de afinidade e análise.) O volume deve basear-se 10 mL por 1 grama de uma pelota. 28 mL de mercaptoetanol é adicionado para quebrar pontes dissulfeto e 400 mL de flúor phenylmethanesulphonyl para desativar proteases de digerir proteínas de interesse após a lise celular. Um &quot;cocktail protease&quot; também é adicionado (400 mL de 0,2 mg / mL pepstatin A. 400 mL de 0,2 mg / mL leupeptin; 400 mL de 2 mg / ml de tripsina inibidor) para garantir que os extratos de proteínas não se degradam antes da análise de metas de interesse. Em seguida acrescentar 400 mL 1M imidazol, é usado para eluir proteínas tag obrigado a íons Ni ligada à superfície dos grânulos na coluna de cromatografia e 1mM de DNase I, usado para degradar DNA único e double-stranded indesejáveis ​​em 5 phosphodinucleotide e oligonucleotídeos fragmentos. </li><li> Agitar a mistura no escuro em gelo por 30 minutos para permitir um tempo adequado para a reação, giram em 10.000 rpm por 60 minutos na centrífuga de resfriamento. Colheita o sobrenadante e em preparação para cromatografia realizar a infusão com Ni-NTA (níquel-nitrilotriacético Superflow ácido por Qiagen) girando em tubos de centrífuga de microcentrífuga em velocidade máxima por 3 minutos e lavagem com tampão de lise, repetindo fiação e lavar até que a mistura é clara de qualquer tonalidade azul. Agitar a mistura resultante lentamente em um recipiente escuro no gelo por 60 minutos. </li><li> Realizar a cromatografia de coluna que flui através de 12 frações como segue. A primeira fracção é um fluxo através de 10 mL sobrenadante misturado com Ni-NTA no passo anterior. A segunda é de 10 mL de tampão de lise (50 mM Na-fosfato, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8,0), de 10 mL de tampão terceiro (10 mM imidazol, 100 mM NaCl, pH 8,0), quarto e os restantes são 0,5 mL de tampão de eluição (250 mM imidazol, 100 mM NaCl, pH 8,0) </li><li> Prepare o gel de poliacrilamida SDS-PAGE e preparar as nossas amostras através da mistura de 4 mL de uma fração e 1 mL de SB de 5X (Tris 300mM 6.8, BME 25%, SDS 10%, glicerol 50%). Para o padrão que usamos 100 kb DNA ladder por Invitrogen. Antes de carregar nós fervida nossas amostras por 5 minutos. Depois de carregar nós corremos o gel à 120V por 60 minutos. Então nós manchado, descorados e, finalmente, secas em um secador de gel especial para 2 horas a 80C. </li><li> Em seguida, visto os resultados no gel e localizado as frações que rendeu o melhor resultado. Dependendo da proteína de nosso interesse, as bandas devem estar localizados, respectivamente, para o tamanho de uma proteína. Esta fração deve ser selecionada para a purificação de proteínas ainda mais com MonoQ e Superdex 200 (Amersham Pharmacia). </li><li> A concentração é realizada girando as frações mais concentradas em Nanosep filtro com poros de 10K em 14 rpm por 5 minutos, lavando-a com tampão de eluição de cada vez. É necessário determinar a concentração de proteína utilizando o ensaio final de BSA para o procedimento ainda mais proteína rotulagem. </li><li> A fluorescência verde intrínseca da NLS-2xGFP não pode ser utilizado para geração de imagens única molécula de transporte nuclear, devido à sua má foto-estabilidade e espectro sobreposto com autofluorescência celular. Assim, nós rotulamos as moléculas de carga com excesso de cisteína reativa corante orgânico (ou Alexa555 Alexa maleimida 647 da Molecular Probes) por 2 horas em temperatura ambiente em 50 mM fosfato de sódio, 150 mM NaCl após a redução com TCEP tris (2 - carboxietil) por 20 minutos. Reações foram apagados, com 2-mercaptoetanol, e as soluções de proteína foram dialisadas para remover o corante livre. </li></ol> 3. Microscopia única molécula <ol><li> Nosso conjunto de microscópio up inclui uma Olympus IX81 equipado com um 1.4 NA objetivo óleo de imersão-100x (UPLSAPO 100XO, Olympus), a 35 mW 633 nm laser He-Ne (Melles Griot), uma lâmpada de mercúrio com GFP filtro de configurar, em um -chip multiplicação ganho da câmera charge-coupled device (Cascade 128 +, Roper Scientific) e the pacote de software Slidebook (Intelligent Innovations Imaging) para aquisição de dados e processamento. Um helicóptero óptico (Newport) foi usado para gerar um modo on-off de excitação laser. GFP e de fluorescência Alexa647 foi animado por uma lâmpada de mercúrio e 633 nm do laser, respectivamente. A emissão de fluorescência verde e vermelho foram coletadas pelo mesmo objetivo, filtrado por um filtro dicróica (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) e um filtro de emissão (NF01-405/488/561/635-25X5. 0, Semrock) e fotografado por uma câmera CCD idênticos. </li><li> Em experimentos única molécula, permitimos que o tempo de fluorescência fotobranqueamento da molécula de carga única a ser mais longos do que o tempo de transporte. Para determinar o tempo fotobranqueamento, 0,1 moléculas de carga nM são semeadas em uma tampa de vidro escorregar e tornar-se imóvel depois de 30 minutos devido à não-específica de absorção. Então, o tempo da fluorescência é medida. Dependendo da proteína de vezes photobleach juros serão diferentes com base no número de cysteins capaz de reagir com Maleimidas, portanto, a intensidade de iluminação e área de iluminação deve ser ajustada de modo a não induzir a uma fotobranqueamento preliminar e garantir que as moléculas de carga rotulada com Alexa mostrar 647 fluorescência por mais tempo do que as cargas interagir com NPCs. </li><li> Para os experimentos em células permeabilizadas importação, o transporte de carga e cofatores essenciais foram adicionadas. Reações típicas de carga importação contidas GTP 1 mM, 0,5 mM importina, 0,5 mM importina-1, 2 e 1 mM mM Ran NTF2 para o transporte facilitado e 0,1 nM de 10KDa Dextran para transporte passivo .. Concentrações de carga fluorescentes foram&gt; 100 nM em experimentos em massa, e ~ 100 pM para ensaios única molécula. A estas concentrações,&gt; 99% da carga era esperado que formam complexos com importina e importina. Taxa de transporte foi monitorada por epifluorescência (se apenas as taxas relativas foram importantes) ou microscopia de fluorescência confocal (se as taxas absolutas foram desejado). </li><li> Primeiro a posição do envelope nuclear foi determinada por microscopia de campo amplo de epifluorescência, envolvendo uma lâmpada de mercúrio HBO com um conjunto de filtros GFP para tirar uma foto do NE. As intensidades de pixels dentro de uma linha ou coluna são aproximadamente perpendicular ao NE estavam aptos com Gaussian. As posições de pico da gaussiana para um determinado conjunto de intensidades de pixel foi considerado a posição NE para essa linha e coluna. As posições de pico de uma série de Gaussianas como foram, então, se encaixam com um polinômio de segundo grau, rendendo o caminho do NE na imagem inteira. </li><li> Uma vez que o NE é localizada, é essencial para se livrar de todos os autofluorescência utilizando um 633 nm laser He-Ne até que esteja completamente Foto-descoloração, geralmente mais de 60 segundos é suficiente. </li><li> Moléculas da amostra deve, então, ser mantidos em uma solução 1,5% do PVP e da mistura adicionada à câmara de fluxo em um volume de 25 L e depois arrastado através da câmara de aplicação de um pavio de papel de filtro. Um cuidado absoluto deve ser tomado com a adição de proteínas de carga de importação para as células permeabilizadas logo após a localização envelope nuclear já que o foco pode ser facilmente rompido por qualquer movimento vigoroso. </li><li> Assim que as moléculas de carga são adicionados, 633 nm laser He-Ne foi utilizada para iluminar as trajetórias de transporte de moléculas de trânsito. Um helicóptero óptico (Newport) devem ser envolvidos em cerca de 5 Hz para evitar a fotodegradação devido a uma alta densidade de potência do laser, bem como para permitir que uma nova porção de não-Foto-descoloração moléculas individuais se aproximar do NE. Uma série de vídeos de translocações única molécula deve ser tirada com uma câmera CCD de alta velocidade que pode ir até aos 2500 Hz. </li></ol> 4. Resultados representativos Realizado corretamente, o nosso protocolo permitiu coletar uma série de vídeos demonstrando a translocação de moléculas de carga única interagindo com o complexo do poro nuclear em permeabilizadas HeLa POM 121 células. (Fig. 1). Nos propusemos a imagem e trilha os passos de transporte de moléculas de dextran transitória através do NPC em células permeabilizadas digitonina-HeLa estável expressando GFP-POM121. Células foram incubadas com baixas concentrações de moléculas de dextran marcado. O plano equatorial do núcleo foi trazida para o foco com uma imagem clara do anel verde da GFP fluorescência animado por uma lâmpada 488-nm mercúrio. A exposição de longa data da GFP-NE nos permite obter um excelente sinal-ruído (SNR) para localizar o avião meio do NE. Anteriormente 10 moléculas de dextrano kDa foram encontrados para difundir através da NE dentro de aproximadamente 2 ms com uma resolução espacial de cerca de 20-40 nm por uma taxa de quadros de detecção de 500 ou 1000 Hz. Tal resolução espaço-temporal permite a captura de apenas 1:59 as etapas de difusão de moléculas de dextran através do NPC que não é suficiente para elucidar informações mais espaço para a difusão passiva. Para capturar as etapas mais fina de moléculas de dextran dentro do NPC com uma melhor spatiResolução otemporal, temos realizado duas melhorias principais: (i) a adaptação de uma taxa mais rápida detecção de quadro de 2500 Hz para capturar passos difusão mais finos, e (ii) a empregar uma maior densidade de iluminação óptica para excitar mais fótons de moléculas individuais para obter uma maior resolução espacial. Estas melhorias nos permitem captar várias etapas de difusão transiente de alexa647 marcado com moléculas de dextran em todo o NE por uma luz laser de 633 nm, em irradiância de 100 kW / cm 2 com uma resolução espaço-temporal de 12 nm e 400 ms. Conforme mostrado na Figura 1, uma série de imagens fixas de eventos de transporte típico de moléculas de dextrano foram registrados. Ao rastrear a trajetória espacial de moléculas individuais que transitam dextran, os passos multa de difusão através da NE foram distinguidos. Descobrimos que existem cerca de 30% dos eventos de interação com o NE reconheceram originários e os compartimentos de destino. Entre eles, as moléculas de dextran movimento do citoplasma para o NE tem dois destinos: fim no núcleo após difundir através da NE ou mover de volta para o citoplasma, após interagir com o NE As situações semelhantes ocorreram em eventos de exportação: as moléculas de dextran a partir do núcleo entram no citoplasma ou difusa de volta para o núcleo após interagir com o NE. Série de imagens como conterá informações sobre a posição espacial das moléculas individuais em relação ao NPC, bem como informação temporal sobre o tempo de permanência das moléculas através do NPC. Ao analisar as trajetórias das moléculas de dextran em torno da área do NE, freqüência o tempo de transporte, eficiência e entrada pode ser determinada. O tempo de transporte em nosso trabalho pode ser identificada como a importação ou o tempo de exportação. Eles foram definidos como o tempo médio de permanência de moléculas de dextran dentro do NPCs que se submetem a importação ou exportação. A importação ou exportação de eficiência foi definida como o percentual de importação completa ou os eventos de exportação sobre a soma dos eventos completo e abortiva. A freqüência de entrada de importação ou exportação refere-se o número de moléculas que interagem com o NE durante um segundo. <img src="/files/ftp_upload/2040/2040fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Quadros de vídeo selecionados de eventos de transporte típico de moléculas de dextrano através da NE. (A) Um evento citoplasma-to-núcleo. Uma molécula de dextran único (mancha vermelha) iniciado a partir do citoplasma, interagiu com o NE (linha de pixel verde), e terminou no núcleo. As trajetórias do evento (linhas azul e pontos abertos) foram determinadas e sobrepostos com o NE (linha preta). As linhas verde e vermelho representam a distância de 100 milhas náuticas a partir do NE no citoplasma e do lado nuclear. C, o citoplasma. N, o núcleo. Barra de escala: 2 mm. (B) Um evento de citoplasma a citoplasma. (C) Um evento de núcleo para núcleo. (D) o evento A-núcleo de citoplasma.

<ol>
	<li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex.">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , (2010).</li><li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability.">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , .</li><li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy.">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li><li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes.">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Cuidados devem ser tomados para assegurar uma co-localização adequada de moléculas NE e único durante o experimento. Também é importante para fornecer um sinal de ruído elevados, especialmente quando o sinal é baixo, devido à rotulagem pobres ou fotodegradação. Precisão de localização é limitada pelo ruído de fundo (decorrentes de fora de foco de fluorescência, CCD ruído de leitura, escuro fatores corrente e outros).

single-molecule imaging of nuclear transport

O utilitário de uma única molécula de abordagens microscopia de fluorescência tem sido provado ser de grande proveito na compreensão reações biológicas ao longo da última década. A investigação das interações moleculares com alta resolução temporal e espacial de profundidade no interior das células se manteve desafiadora devido aos sinais fracos demais decorrentes de moléculas individuais. Trabalhos recentes por Yang et al. demonstrado que a microscopia de campo estreito de epifluorescência, permite a visualização de transporte nucleocytoplasmic ao nível única molécula. Pela abordagem única molécula, cinética importantes, tais como tempo de transporte nuclear e eficiência, para as moléculas de carga de sinal-dependentes e independentes foram obtidos. Aqui nós descrevemos um protocolo para a abordagem metodológica com uma melhor resolução espaço-temporal de 0,4 nm e 12 ms. A resolução melhorada nos permitiu capturar transporte ativo transitória e eventos de difusão passiva através dos complexos poro nuclear (NPC) em semi-intactas as células. Esperamos que este método a ser utilizado na elucidação de outros eventos de ligação e do tráfico de dentro das células.

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Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Microscopia única molécula approch forneceu introspecções romance em transporte nuclear.

Única molécula-Imaging dos Transportes Nuclear

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

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Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Métodos única molécula para acompanhar as alterações nas propriedades elásticas bicamada

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Biologia

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Sistema automatizado para medições única molécula de fluorescência de Superfície-imobilizada Biomoléculas

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Molécula única imagem da regulação gênica<em&gt; Em vivo</em&gt; Uso de ativação Cotranslational por clivagem (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

Estudar DNA Looping por Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

A proteolipossoma-Based Efluxo Ensaio para determinar as propriedades de uma única molécula de Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canais e Transportadores

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

Ensaio cinético de molécula única de alta produtividade paralela para decote de DNA específico do local

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Quantificação baseada em imagens de moléculas únicas de células vivas de interações proteicas

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

Autor em destaque: Avaliação da dinâmica proteína-condensado em células humanas vivas

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

Medição de molécula única da dinâmica de interação de proteínas em condensados biomoleculares

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...