Bölüm 1. Cerrahi Alan hazırlayın <ol><li> Biyolojik tehlikeli reaktifler (örneğin retroviral vektörler) ile çalışıyorsanız, ameliyat, bir Biyogüvenlik II kabini (BSC) içinde yapılmalıdır. BSC içinde transdüser ultrason geri yansıma mikroskobu (UBM), BSC yanında oturur, ve özel olarak tasarlanmış bir cerrahi sahnede bir motor kontrollü desteği ile yerinde tutulur. On line video gösterildiği sahne oluşturmak için gerekli bileşenleri listelenmiştir. Bu liste, çeşitli açılarda (istek üzerine) sahne görüntüleri ile birlikte, inşaat izin vermelidir. </li><li> Laparotomi açılış ve kapanış (karın boşluğu, iç organlar erişime izin vermek için açık kesilir cerrahi işlem), genellikle plastik desteğiyle bir emici ped üzerine yapılır. Ameliyat öncesinde tüm gerekli araçları (örneğin, jilet, cerrahi makas, forseps, yüklü AutoCLIP uygulayıcısı, vb) ve malzeme (örneğin PBS, dikiş, anestezi, fare tutucu ve örten plaka, vb.) Sterilize edilmiş ve yerleştirilmiş olmalıdır cerrahi alan. Kesi açıktır süreyi sınırlandırılması cerrahi ile başarı şansı maksimize etmek için önemlidir. Bütün hayvan işleme çözüm MB-10 veya eşdeğeri ile dezenfekte edilmiş eldiven ile yapılmalıdır. Tekrarlanan dezenfeksiyonu, steril eldiven sağlamak için gerektiği gibi yapılmalıdır. </li></ol> Bölüm 2. Fare Anestezi <ol><li> 1 cc şırınga, 1 kısım Nembutal (50 mg / ml pentobarbital) PBS içinde 25 mg / ml magnezyum sülfat sterilize süzülmüş 4 parça içeren anestezik solüsyonu ile doldurun. 10 mg / mg / ml magnezyum sülfat pentobarbital ve 20 ml&#39;lik bir çözüm neden olacaktır. Her fare bireysel ağırlıklı, ve vücut ağırlığı pentobarbital kg 90 mg ile enjekte edilmelidir (örneğin, 28 gram fare, 250 mcL ile enjekte edilir). </li><li> Cilt ve karın kas hem penetran karın hamile bir fare embriyonik gün (E) 9.5 (intraperitoneal, ip) (gerektiği gibi diğer yaşları kullanabilirsiniz) içine enjekte edilir. Fare için 8-12 dakika sigara duyarlı olmaya izin ver. Yeterli anestezi hayvanın rahat bir duruş tarafından onaylandıktan sonra, kuyruk ve ayak tutam yanıt olarak hareket azlığı olmalıdır. Hafifçe parmak tırnakları arasındaki kısma çok hassastır ve herhangi bir yanıt gibi pinching eksikliği, hayvanların yeterli anestezi olduğunu gösterir. Kuyruk ve ayak tutam tamamen tepkisiz olan hayvanlar, hatta bazı zamanlar ilk cerrahi kesi yanıt biraz seğirme unutmayın. Ancak, bu refleksif bir tepki ve yetersiz anestezi anlamına gelmez. Ameliyat sırasında kurumasını önlemek için petrol bazlı oftalmik melisa fare gözler için uygulanmalıdır. </li><li> Fare anestezi olmak için beklerken set-up cerrahi alan ve ultrason makinesi. Retrovirüs veya lentivirüs kullanımını gerektirir BSL2 çevreleme, viral enjeksiyonları yukarıda belirtildiği gibi bir Biyogüvenlik II Kabinesi yapılmalıdır. Buna ek olarak, virüs ile temas gelen tüm çözümler ve tek kullanımlık malzemeler,% 10 çamaşır suyu çözeltisi ile dekontamine edilmelidir. MB-10 (sterilizasyon solüsyonu ile tedavi edilmelidir cerrahi aletler ve ultrason cihazları <a href="http://www.quiplabs.com/mb10.htm">http://www.quiplabs.com/mb10.htm</a> ), ya da söz konusu tesisi tarafından kullanılan bir eşdeğer. </li></ol> Bölüm 3. Embriyolar, Pozlama <ol><li> Mümkünse verilen hayvan tesis ve kullanılabilir alan kısıtlamaları bağlı cerrahi alan ayrı bir yerde cerrahi hazırlık alanı olduğu için tercih edilir. Bu hayvanlar arasında çapraz kontaminasyon olasılığını en aza indirecektir. Ameliyat başlatmak için, hayvanın sırtına steril emici bir yüzeye yerleştirin ve karın bölgesinde% 70 etanol ile iyice yıkayın. Daha kapsamlı cerrahi öncesi tedaviler (örneğin, ardışık Betadine mermi ve% 70 etanol yıkar) istihdam, ancak deneyimlerimiz bu kemirgen sağkalım cerrahi bu tür için gerekli değildir olabilir. Bir çift kenar jilet kullanarak, karın yaklaşık 1 inç genişliğinde ve 1,5 santim uzunluğunda bir alanda saç tıraş. Yaklaşık 45 derecelik bir açıyla, ustura ile kısa hızlı hareketleri kullanın. Cerrahi alanında uygun şekilde tedavi edilmesi önemlidir, ama aşırı ıslatma tabi değil, bu hayvanın gereksiz tüyler ürpertici neden olabilir ve hatta hipotermi. </li><li> Ince cerrahi makas kullanarak hayvan (ikinci bir kesi ile yardımcı olacaktır bağ dokusu ile kesme, kas cilt tutan) karın kas yoluyla ilk olarak deri yoluyla 1 &quot;longitudinal kesi yapmak. Not prosedürü bakım boyunca cerrahi aletler steril kalır ve gerektiği gibi araç ipuçları non-ste ile temas gelirsen dezenfektan ile tedavi (yani yapılan olmalıdır sağlamak için alınacak) malzeme rile. </li><li> Kullanarak forseps rahim boynuzları dikkatle çizmek ve her iki tarafta embriyo sayısı kaydetmek. Hayvan geri uterin boynuz en fazla iki komşu maruz kalan embriyoların (iki her iki tarafta yapılandırma bağlıdır hangi seçim), yerini terk ederken. Annesi onu geri kalırken, bu bağlamda, iki embriyo belli bir süre maruz ve PBS içinde yıkanıyor. </li><li> (Figure1A) ameliyat sırasında nerede olacak pleksiglas sahibinin sırtında hayvan koyun *. Sonra, bir çift yeşil silastik membran (L RTV silikon kauçuk tabanı kullanılarak yapılan ve üzerinden biraz yerleştirilir forseps, anne üzerinde aşağı düşük (kullanmak için önce MB-10 ile dezenfekte edilmelidir) 10cm doku kültürü çanak ** kür ajanı; Dow Corning ürün numaraları sırasıyla 3142761 ve 2156946). Hayvan üzerinde plaka aşağıya düşürmek gibi, rahim dokusu enjekte edilecek iki embriyo arasında kavrama forseps kullanımı, ve nazikçe onları zarından çekin. Aynı zamanda, plaka sahibinin üzerine tamamen aşağı indirdi ve raptiyeler bir yerde tutmak için itilir. Önceden ısıtılmış (37 ° C) PBS embriyolar daha sonra tamamen kapsayacak şekilde çanak eklenir. </li><li> Maruz kalan embriyoların rahim duvarına (Figure1B) üzerinden gerçek zamanlı görüntü oluşturmak için ultrason probu (Figure1A) altındaki hayvan ve maruz kalan embriyoları içeren enjeksiyon aşamasında yerleştirin. Prob daha sonra PBS banyoya (motorlu kontrollerini kullanarak) doğrudan yansıması embriyolar üzerinde düşürülür. Probu yaklaşık 2-3 mm uzaklıkta embriyolardan görüntüler elde edilebilir. Bu görüntüleri toplamak için ileri ve geri dolaşacaktır sondadan embriyoların isabet etmediğini emin olmak için çok önemlidir. </li></ol> * Annesi ameliyat sırasında aittir tutucu bir makine atölyesi tarafından kolayca yapılabilir. Bu, üst üste yapıştırılmış iki pleksiglas iki tarafla da geniş bir pleksiglas tabanı, ve aralarında bir boşluk (fare için yeterince geniş sırtında yatarken sığdırmak için) içermelidir. Taraflar, daha sonra siyah balmumu (diseksiyon tepsiden) ile dolu bir vadi zemini, olmalıdır. O balmumu raptiyeler embriyoların enjeksiyon sırasında yıkanmış olduğunu PBS plaka basılı basıldığında içine malzeme olarak hizmet vermektedir. : ** 10cm bakteriyel yemekler alt merkezi (Heavy Duty Taşınabilir Punch ve inci 13/16 inç dairesel kalıp ile yapılabilir delikli bir delik (çapı yaklaşık 2 cm) olmalıdır <a href="http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm">http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm</a> ). Buna ek olarak, orta deliğin (uzakta yaklaşık 1.5cm) her iki tarafında iki küçük delik bir alev ısıtılmış iğne (ya da tabii bir matkap ile yapılmış olabilir) ile yanmış olmalıdır. Bu delikler daha sonra vakum yağ ile kaplıdır ve plaka sahibinin üzerine tutun raptiyeler aracılığıyla siyah mum içine itmek olacaktır. Vakum gres PBS dışarı sızmasını önlemek için. Bölüm 4. Mikroenjeksiyon İğne içine Virüs Yükleme <ol><li> Bir 1mm (iç çapı) pah Moda mikroenjeksiyon iğne, cam kapiller çekti. Iğne keskinliğini kritik ve yeterince keskin bir iğne ile çalışan amnionic kesesi, rahim duvarı ve penetrasyonu ciddi tehlikeye sokabilir ve deneysel yetmezliğine yol açabilir. Bilenmiş iğne daha sonra boru üzerinden manuel bir infüzyon / çekme pompası (diğer cihazlar iğne yükleme ve boşaltma düzenlemek için kullanılan, ancak bu ne monte edilmiş 25 mcL mikroenjektör bağlı pipet tutucu, içine yerleştirilir video gösterilir). Mikroenjektör, tüp ve iğne en iyi yanıt (bir hava dolu sistemi ile ilgili genişleme ve sıkıştırma önlemek için) için, mineral yağ ile doldurulması gerekir. </li><li> Önce iğne yükleme şırınga sistem hiçbir hava kabarcıkları iğne ucu kadar tüm yol vardır emin olun. Sonra virüs yükü başlamadan önce iğne (1-2 mm uzunluğunda) küçük bir hava kabarcığı geri çekmek. Bu hava cebi virüs ve madeni yağ arasındaki mesafeyi korumaya yardımcı olur. Enjekte edilecek viral stoku son bir 0.08 mg / ml konsantrasyonu (virüs üretimi konusunda daha fazla bilgi için kaynak 1, 2 bakınız) polybrene içermelidir. Titresi 10 kat damlasına kadar konsantre retroviral stokları genelde bulaşıcı malzeme çoğunluğu içeren partikül madde, önemli miktarda içerir ve bu yüzden 5 olmadan filtre olamaz. Ayrıca, hazırlık bağlı olarak, viral stok parçalanmış ambalaj hücrelerin genomik DNA (özellikle doğrudur MLV / VSV pseudotyped virüs üretmek için 293 hücreleri kullanılarak,) viskoz olabilir. Virüs kısım viskoz ise, küçük bir miktarda DNAz ve stok gevşetmek için ilave edilmelidir, ya da yükleme iğne son derece zor olacaktır. A<html> viral stok (8-10 mcL) damlacık iğne yükleme için hazırlık parafilm steril bir parçası üzerinde yer almalıdır. Daha sonra, geri çekilmesi pompa kullanarak, takunya önlemek için dikkatli bir şekilde iğne ödeme dikkat yük. Embriyoların iğne veya ultrason probu kırmak için değil dikkatli olmak yüklenen iğne, enjeksiyon alanında mikromanipülatör konuma yerleştirin. Not iğne enjeksiyon oluşmaya önce bazı nedenlerden dolayı önemli ölçüde yüklü ise enjeksiyon başlamadan önce taburcu edilebilir ucu içine küçük bir miktar hava çekmek için yararlı olabilir. Bu hava boşluğuna iğne ucu (hemen hemen her zaman bu yüklü bir iğne yararsız hale getirecek bir olay) viral stok kuruma karşı koruyabilirsiniz. </li></ol> Bölüm 5. Ultrason Rehberli Viral Enjeksiyon <ol><li> , Ultrason probu ile oluşturulan gerçek zamanlı görüntü, video monitör görüntülenmiştir ve embriyo içine mikroenjeksiyon iğne rehberlik etmek için kullanılabilir. , Bu sistemi virüsü kullanarak E8.5 amniyon kesesi içine enjekte veya E9.5-E11.5 (Figure1B) amniyotik kese veya ventriküler sistemi olabilir. Bu prosedürün en zor parçası olan ve (araştırmacı bağlı olarak 5-20 saat sipariş üzerine) usta eller deneyim önemli bir miktarda gerektirir. Ekranda parlak nokta olarak ultrason görüntüsünü iğne ucu açıktır, y ve z düzlemleri motorlu kontrollerini kullanarak prob pozisyon ayarlamaları (uygun hareket görülebilir ve x manuel kontrol düzlemi). Bu prob salınım yönü iğne uzunluğu paralel olması büyük önem taşımaktadır. Bu hareketleri sırasında embriyo içine enjeksiyon için iğne ucu konumlandırmak için görüntü düzlemi kalmasını sağlayacaktır. </li><li> Embriyo, hedef bölge (Bu durumda, ön beyin ventrikül) kolayca görünür ve öyle ki yerleştirilmiş iğne rahim malzemenin en az enjeksiyon yolu ile ulaşılabilir olmalıdır. Buna ek olarak, plasenta yoluyla enjekte etmek için kritik öneme sahiptir. Hedef beyin bölgesi iğne ilerleme yönü (mikromanipülatör düğmeyi kullanarak) ile kaplı olduğu, iğne rahim duvarına dokunmadan olmalı ve daha sonra kısa bir hızlı aşısı ileri dokuya nüfuz gerekir. Benzer bir yaklaşım amnionic kese ve beyne nüfuz etmek için kullanılır. Bazı durumlarda, özellikle iğne çok keskin ve deneyimli araştırmacı, tek bir hareket ventrikül vurabilir. Mekanik, hareketli prob, iğne ve embriyolar (anne sahnede hareket ettirerek), pratik eğitim master gerektirir. </li><li> İstenilen sayıda embriyo enjekte edildikten sonra, 5.0 ipek sütürler ile karın duvarına yakın. Sütür mekaniği bu tip ameliyatlar özgü değildir. Son olarak, karın kas dikiş üzerinde birlikte cilt zımba veteriner autoclips kullanmak. Fare dikiş çiğnemek, çünkü cilt dikilmesi tavsiye edilmez. Analjezi uyanır gibi fare ile ağrının miktarını azaltmak için kesi bölgesine uygulanmalıdır. % 0.25 bupivakain solüsyonu (0.8 ml / kg veya 2 mg / kg) subkutan kesi boyunca her birkaç milimetre enjekte edilmesi tavsiye edilir. </li><li> Fare kurtarır ederken yavaşça temiz bir kafes içinde bir jel paketi (beslenme ve hidrasyon kolaylaştırmak için) içeren emici kağıt üzerinde hayvan yatıyordu. 37 slayt sıcak setine kafes yerleştirin ° C vücut ısısını korumak için. Uyandığı zaman, temiz bir kafesin içine fare ve jel paketi ve hayvan raf dönün. </li><li> Ertesi gün bütün bunlar kürtaj gösterir herhangi bir vajinal kanama, karın kasılmaları, ve / veya genel bir sıkıntı bakmak için fareyi kontrol edin. Bu durumda, hemen fare euthanize. Bakımlı saç ve genel bir sağlıklı görünümünü cerrahi başarılı kurtarma göstermektedir. Enjekte edilen embriyoların daha fazla analiz için embryonically veya postnatal kurban edilebilir. Virüs gibi insan alkalen fosfataz (PLAP) veya GFP gibi bir muhabir gen, ifade, bir boyama pozitif viral enfeksiyon (Figure1C) alanları ortaya koyacaktır. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Enjekte embriyolar 1-2 gün yetişkinliğe enjeksiyon yolu feda edilebilir. Virüs PLAP veya GFP gibi bir muhabir gen, ifade, o muhabir ifade viral enfekte olmuş hücreleri ve bu hücrelerin klonları tanımlamak için hizmet vermektedir. Örneğin, Şekil 1C gösterilen retroviral vektör ifade PLAP E9.5 in utero bulaşmış olan bir postnatal beyin doku bölümü. Enfekte hücreler sonra mor kümeler histokimyasal boyama olarak görünür. Viral enfekte hücreler tespit ek olarak, muhabir ifadede bir hücre morfolojisi ve pozisyonu yanı sıra, gen ekspresyonu durumunu incelemek için olanak sağlar. nt &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2047/2047fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 E9.5 fare önbeyin ventriküller içine Viral enjeksiyon. A. anestezi hayvan enjeksiyon sahnede yer alır. Iki embriyo (ok) ultrason probu altında maruz kalan ve yerleştirilmiş olacaktır. Virüs dolu mikroenjeksiyon iğne embriyolar yakınında ve ultrason probu ile dizilmiş. B. Ekran E9.5 fare embriyo gerçek zamanlı ultrason görüntüsü yakalama. V, ventrikül;; UW AS, amniyon kesesi, rahim duvarına. C. Embriyolar E10.5 bir PLAP ifade virüs enjekte edildi. PLAP için histokimyasal boyama, viral enfeksiyon olayların yerini ortaya koymaktadır.

<ol>
	<li>Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+high-titer+pseudotyped+retroviral+vectors+with+very+broad+host+range.">Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range.</a> Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).</li><li>Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li></ol>

Amniyotik kese ve ventriküler sistemi E9.5-E11.5 enjekte edilebilir ultrason eşliğinde sadece amniyon kesesi E8.5 enjekte edilebilir E8.5-E11.5, Viral enjeksiyonları yapılabilir. Doğru yapıldığında, ultrason eşliğinde ventriküler sistemi enjekte viral parçacıkların bu nedenle, ön beyin (neokorteks, bazal ganglionlar, diensefalon, göz, vb), orta beyin çeşitli yapılar bulaşabilir, ventriküler sistemi döşeyen hücrelere ve ve arka (Figure1C). Amniyon kesesi içine enjekte Virus embriyonun dış hücrelere erişim vardır. Virüse karşı ek olarak, ultrason rehberliği de gelişmekte olan embriyo hücreleri enjekte etmek için kullanılacak. Bu nedenle, bu teknik bir deney tasarımı (gelişimsel süre, yapı, virüs / hücreleri) seçim için birden fazla seçenek sağlar. Enjekte virüs veya hücreleri enfekte / enjekte edilen hücrelerin kolay tanımlama için bir muhabir ifade kritik öneme sahiptir. Tarihsel olarak, insan plasental alkalen fosfataz (PLAP) veya GFP kullanılmaktadır. Deneyim, biz PLAP histokimyasal ve immünohistokimyasal hem keskin ve belirgin bir tek hücre, hücre morfolojisi ve pozisyon analiz etmek için izin veren leke ve klonal bir analiz yapmak için verimleri nedeniyle PLAP çok yararlı bir muhabir gen olabilir bulduk. Viral GFP ifade soluk olabilir, GFP muhabiri doku boyama için ideal olmayabilir, ama bir tek hücre floresan aktif hücre sıralama (FACS) elde etmek istiyorsa yararlıdır.

&quot;Aşağıdaki ultrason geri yansıma mikroskoplar biri kullanılmasına rağmen video Paradigma-Tıbbi P40, P40, artık ticari olarak kullanılabilir. Bu prosedür için kullanılan olabilir, P60, benzer fiyatlı ve yerini almıştır aynı uygulama için kullanılır. Paradigma-Tıbbi cihaz (lar) ile kullanmak için, sahne yapımı için açıklanan ek malzeme. Vevo 2100 küçük hayvan görüntüleme donanımları ile birlikte gelir. <ol><li> P60 Paradigma Medikal Ultrason BioMicroscope (UBM) ( <a href="http://www.paradigm-medical.com/ubms.html">http://www.paradigm-medical.com/ubms.html</a> ). </li><li> VisualSonics gelen Vevo 2100 ( <a href="http://www.visualsonics.com/">http://www.visualsonics.com/</a> ) </li></ol> Anestezik ve analjezik Bulter Schein Hayvan Sağlığı (pentobarbital 50 mg / ml enjektabl sodyum; Abbott laboratuarları tarafından üretilen) Nembutal bir çözüm elde edilebilir. Not bu bir program II kontrollü madde ve Uyuşturucuyla Mücadele Ajansı (DEA) elde etmek için lisans gerektirir. Bupivakain solüsyonu (% 0,25; diğerleri arasında Hospira, Inc tarafından üretilen), Moore Tıp da dahil olmak üzere, distribütörlerin bir dizi elde edilebilir.

ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at e9.5

Utero sağkalım cerrahisinde farelerde gen ekspresyonu gelişimi sırasında moleküler manipülasyon izin verir. Ancak rahim duvarına erken embriyogenez sırasında opak çünkü, mikroenjeksiyon için embriyonun belirli bölümlerine hedef yeteneğini büyük ölçüde sınırlıdır. Neyse ki, yüksek frekanslı ultrason görüntüleme, görüntüleri gerçek zamanlı olarak kullanılabilir ilgi embriyonik bölgeye mikroenjeksiyon iğne kılavuzu nesil izin verir. Burada embriyonik gün fare önbeyin ventriküler sistemi (E) 9.5 retroviral vektörlerin enjeksiyon rehberlik etmek gibi görüntüleme kullanımını tanımlamak. Bu yöntem rahim boynuzları erişim, görüntülü ve enjekte edilir, tuzlu su içinde banyo yapıyor olmak, ev sahibi embriyolar izin veren bir özel olarak tasarlanmış bir plaka izin vermek için laparotomi kullanır. Başarılı ameliyatlar genellikle çoğu veya enjekte edilen tüm embriyoların ilgi sonraki herhangi bir zaman noktasında (embryonically veya postnatal) hayatta neden olabilir. Burada açıklanan ilkeler E8.5 embriyoların amnionic sıvısı (nöral tüp, henüz kapatılmamış olan anterior posterior ölçüde boyunca böylece enfeksiyon izin) içine enjeksiyon hafif değişiklikler yapmak için kullanılabilir, veya ventriküler sistemi içine E10.5/11.5 az beyin. Ayrıca, nörojenik orta yaşlarda (~ E13.5), ultrason görüntüleme, viral enfeksiyon ya da hücre nakli için özel beyin bölgeleri içine direkt enjeksiyon olabilir. Farelerde utero enjeksiyonları kılavuzu ultrasonografi kullanımı, aksi takdirde son derece zor imkansız olmasa da olurdu yollarını fare embriyoları moleküler ve hücresel bir manipülasyon izin derece güçlü bir tekniktir.

Watch this Scientific Journal Video about Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5 at JoVE.com

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Utero sağkalım cerrahisinde farelerde gen ekspresyonu gelişimi sırasında moleküler manipülasyon izin verir. Burada, yüksek frekanslı ultrason görüntüleme embriyonik gün fare beyin (E) 9.5 retroviral vektörlerin enjeksiyon kılavuzunu kullanımı açıklanmaktadır.

Fare önbeyin içine Ultrason Rehberliğinde Mikroenjeksiyon In Utero E9.5 az

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

ultrasound-guided-microinjection-into-mouse-forebrain-utero-at

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

17.8K Görüntüleme.  Johns Hopkins University School of Medicine. Utero sağkalım cerrahisinde farelerde gen ekspresyonu gelişimi sırasında moleküler manipülasyon izin verir. Burada, yüksek frekanslı ultrason görüntüleme embriyonik gün fare beyin (E) 9.5 retroviral vektörlerin enjeksiyon kılavuzunu kullanımı açıklanmaktadır.

Video: Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Nörobilim

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

Hipokampal İnsülin Mikroenjeksiyon ve<em&gt; In vivo</emMekansal Bellek Test sırasında&gt; mikrodivaliz

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

Larva Zebra balığı olarak önbeyin Elektrofizyolojik Kaydı

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Fare Hippocampus içine Oligomerik Amiloid-beta Stereotaksik İnfüzyon

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Korteks, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- ve Striatum özgü<em&gt; In Utero</em&gt; C57BL / 6 Fare Elektroporasyon

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...