Bu çalışma Rejeneratif Terapiler, TU Dresden Tıp Fakültesi ve DFG İşbirlikçi Araştırma Merkezi SFB655 (alt proje A20) Merkezi tarafından desteklenmiştir. BA kazılar-BB programı, Dresden bir burs ile desteklenmiştir. Biz Dr teşekkür ederim. Noriko Osumi, Tadashi Nomura, Dieter Chichung Lie ve utero elektroporasyon ve stereotaksik viral enjeksiyon kurulmasını sırasında değerli tavsiye Ravi Jagasia.

Hazırlık notu Cerrahi hayvan refahı için yerel makamların onayı ile tam eğitimli müfettişler tarafından yapılmalıdır. Tüm önlemler derin anestezi, postoperatif analjezi yönetimi ve fazla 10 dk, kornea dehidratasyon ve körlüğü önlemek için göz yağ uygulaması süren operasyonları için dahil hayvana verdirdiler ağrı ve stres en aza indirmek için alınması gerekir. Anestezi fareler 37 sürekli sıcak tutulmalıdır ° C tam kurtarma ve her cerrahi alet ve çözüm steril olmalıdır kadar. Biyolojik bir kaput kullanımı kesinlikle gerekli olmamasına rağmen, operatör bir laboratuvar önlüğü, maske ve eldiven giyerek operasyon sırasında hayvanın enfekte olasılığını en aza indirmek için tüm makul önlemleri almalıdır. Benzer şekilde, virüs üretimi ve kullanımı ile ilgili her adımda izin verilmesi gerekir ve yerel makamların yönetmeliklerine göre S2 alanlarda yapılmalıdır.Son olarak, virüs ile temas olabilirdi tüm alet ve yüzeylerin tam bir dekontaminasyon tesis onaylanmış dezenfeksiyon uygulamaları (HIV için% 70 Et-OH ve / veya otoklav ile silerek) göre yapılmalıdır. Bölüm 1: Embriyonik MGK Genişletme 1. Utero elektroporasyon yılında <ol><li> Klonlamadan sonra PCM&#39;ler-EGFP (Clontech) ya da pDSV-mRFPnls vektörler 16 içinde transgenlerin (yani cdk4/cyclinD1), 3-5 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyon ile steril PBS içinde tekrar süspansiyon ve EndoFree kit kullanılarak plazmid arındırmak. Yakında ameliyat öncesi, ca son oranında PBS içinde% 0.05 FastGreen ile plazmid karıştırın. 4:04:01 ve tüm çökelti kaldırmak için 16,000 x g&#39;de 2 dakika süre ile karışım santrifüjlenir. </li><li> Önceden çekilmiş borosilikat cam kapiller içine DNA karışımı yerleştirin. P-97 pipet çektirmesi kullanarak Çekme parametreler şunlardır: pull: 200; vel: 140; süresi: 140. Isı bir rampa testi tarafından verilen ve spec bağlıdırkılcal IFIC çok kullanılmaktadır. Utero elektroporasyon platformu (Şekil 1A) yakın olduğu PicoPump memesi üzerinde kılcal takın ve bir stereomikroskop altında, ucu ve dönüm noktasında nick kıvırın. </li><li> Bir kuru cam boncuk sterilizatör tüm cerrahi aletleri sterilize edin ve derin bir izofluran buharlaştırıcı kullanılarak gebelik gün 12-15 hamile bir fare uyutmak. 37 ° C&#39;de ayarlanmış bir ısıtma platform üzerinde sırtüstü pozisyonda hayvan koyun ve bir burun konisi içinde sabit izofluran idaresi altında tutmak. </li><li> Karın cilt Tıraş, sonunda% 70 etanol ile arasındaki silerek Betaisodona birden çok kez dezenfekte ve 0.1 mg / rüçhan analjezik olarak kg konsantrasyonda subkutan buprenorfin (PBS içinde seyreltilmesi) enjekte. Ince makas kullanılarak, periton boşluğuna ulaşmak için temel kas duvarın daha sonra 2 cm&#39;lik bir uzunlamasına kesim ve deri, yapmak. Periton ca dağıtın. 2IUE çözeltisi (D-PBS pen / strep 100 U / ml içeren), bir ml önceden ısıtılmış 37 ° C ve bir ısıtma bloğu üzerinde çözelti tutmak. </li><li> Uteruslar çıkarılır hangi bir yarık içeren steril drap ile fare kaplayın. Bir tungsten retraktör kullanarak kesi çekin, rahim belirlemek ve bitişik embriyoları arasında forseps (Şekil 1B; solda) ile tutarak çekin ve nihayet steril drap üzerine uzandı. Bütün operasyon sırasında, organ ve vücut boşluğuna nemlendirmek ve hayvan dehidratasyonu önlemek için İEÜ çözümü ile rahim durulayın. </li><li> Dikkatli başparmak ve işaret arasındaki tutarak rahim tutun ve başını operatöre doğru görünür ve odaklı kadar tek embriyo çevirin. Telencephalic hemisfer belirleyin ve dorsolateral taraftan biri enjekte. Ventrikül FastGreen (; sağ Şekil 1B) tarafından özetlenen kadar PicoPump bir ayak pedalı kullanarak DNA çözeltisi 1-2 ul bırakın. </li><li&gt; Yer enjeksiyon yeri ve diğer taraf (Şekil 1C) üzerindeki katot üzerindeki elektrotların anot ve kare şeklindeki elektrik alanlar üreten bir Elektroporatör kullanarak her puls arasındaki 950 ms aralığı ile 50 ms için 30 V 6 darbe teslim işletilen Ayak pedalı ile. Bu kanama ve hasar embriyo neden olabilir elektrotlar plasentaya yakın yerleştirmekten kaçının. </li><li> Tüm embriyolar enjekte ve electroporated zaman, karın boşluğuna geri rahim yerleştirin ve her 3-4 mm dikilmesi dikiş dizeyle kas duvarları kapatın. Knot kas rahat ancak doku küçük bir şişlik izin vermeyecek kadar sıkı olmadığını edilmelidir. Son olarak, metal klipler kullanarak örten cilt kapatın. Betaisodona ile cildi dezenfekte, izofluran maskeden fareyi çıkarın ve tamamen uyanık bir konut kafes içinde aktarın. Lokomotor davranışlar normaldir kadar fare kurtarma izleyin. </li></ol> 2. Sam İşlemeple <ol><li> Bir veya daha fazla gün elektroporasyon sonra, fare feda embriyolar toplamak ve doğru bir floresan stereomikroskopta (Şekil 1D) kullanarak electroporated olanlar tespit. Buz gibi soğuk PBS beyinleri teşrih ve% 4 PFA (fosfat tamponu, pH 7.4 &#39;te paraformaldehit) gecede onları düzeltmek. Sonunda, BrdU hücre döngüsü kinetiği ve hücre çoğalması 3 araştırmak için farklı paradigmalara göre kurban öncesi uygulanabilir. </li><li> Beyinleri sonra kesit ve vardır hedefli MGK ve yavrularının üzerine fonksiyonel transgenlerin etkisini değerlendirmek için radyal glia ve çeşitli belirteçler, bazal ataları ve nöronlar (Pax6, Nestin, Tbr2, Tbr1, Tuj1 vb) için immün işlenir co-electroporated raportör geninin ifadesi ile tanımlanır. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1.Utero elektroporasyon yılında. Utero elektroporasyon platformu bir (A) şematik gösterimi. (B) ameliyat sırasında hamile farenin konumlandırma (sağda) ve bir fare embriyo (solda) telencephalic yarımkürede DNA / FastGreen karışımı (mavi) enjeksiyonu gösteren resimler. (C) Şema enjeksiyon bölgesinde (mavi) bitişik anot (+) ile rahim duvarları ile temas halinde elektrot yerleştirme göstermektedir. Oklar anoda doğru DNA göçü göstermektedir. Embriyonik gün 13 yaşında GFP plazmid ile elektroporasyon sonra fare embryo 24 saat (D) resmi. Kesikli çizgi telencephalic yarımkürede demarcates. Bir Calegari ark güncellenmiştir., 2004 17 Programı. Bölüm 2: Yetişkin MGK Genişletme 1. HIV-kaynaklı viral parçacıkların Üretimi <ol><li> 1. Gün: levha 5 x 10 10 cm 6 293T hücreleriD-MEM ısı inaktive fetal sığır serumu% 10 ve pen / strep (kültür ortamı) 100 U / ml içeren 8 ml çanak. 37. az bir viral hazırlama ve bir gece boyunca kültür için 15 bulaşık kullanımı ° C,% 5 CO2. </li><li> 2. Gün: her bir tabak için, i) şifreleyen 3 plasmidlerin her biri düz D-MEM 5, ug, 1 ml VSVG (veziküler stomatit virüsü tip G) zarf proteini, ii) Gag / pol (grup spesifik antijen / polimeraz) seyreltik ve iii) polisistronik önce 9 HIV tabanlı aktarım vektörü (p6NST90) klonlanmış fonksiyonel ve muhabiri transgenlerin (yani cdk4/cyclinD1/GFP) ifade oluşturmak. D-MEM, oda sıcaklığında 15-30 dakika için 1 mg / ml stok çözeltisi ile inkübe de PBS içinde önceden çözülmüş edilmiş polietilenimin 45 ul ihtiva eden 1 ml bu çözelti karıştırılır. Bu arada, hücreleri bulunan ortamı çıkarın ve ısı inaktive fetal sığır serumu% 15 ve 100 U / pen / strep ml içeren taze D-MEM tabak başına 4 ml ekleyin. 2 m ekletransfeksiyon karışımı ve kültür gecede l. </li><li> 3. Gün: 500 mM 120 ul transgenlerin ekspresyonu artırmak için çanak başına Na-bütirat eklemek, kültür ortamı 5 ml transfeksiyon ortamı yerine sonra 6-8 saat boyunca nazikçe ve kültür karıştırın. </li><li> 4. Gün: süpernatan (yaklaşık 70 ml toplam) toplamak, 2 polyallomer santrifüj tüpleri (35 x 89 mm) bir 0.22 mikron filtre ve transfer geçecek. 4. 90 dakika boyunca 110,000 xg&#39;de Ultrasantrifüj ° C bir salıncak rotor kullanarak. Süpernatant atın her bir tüpe PBS 6 ml eklenir ve 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Pelletini tekrar ve bir polyallomer santrifüj tüpüne (14 x 95 mm) olarak aktarabilirsiniz. 4. 90 dakika boyunca 110,000 xg&#39;de Ultrasantrifüj ° C bir salıncak rotor kullanarak. Süpernatant sil, 50 ul PBS içinde tekrar süspansiyon pelet, -80 5 ul alikot ve depo etmek ° C. Viral titresi 10 8 -10 9 cfu / ml aralığında olacaktır. (Not: virüs sıcaklık ve depolama, avo çok duyarlıdırid yeniden dondurma, nakliye sırasında kuru buz üzerinde tutmak ve kullanımdan önce yakında eritin.) </li></ol> 2. Stereotaksik enjeksiyonu <ol><li> Izofluran ile 6-10 hafta eski fare anestezisi ve düzgün kafa düzeltmek için kulak çubukları ve damak desteği kullanarak bir stereotaksik frame (Şekil 2A) yüzüstü pozisyonda hayvan koyun. Hayvan 37 ° C&#39;de ve sürekli izofluran idaresi altında ayarlanmış bir ısıtma yastığı sıcak tutulur. </li><li> Subkutan rüçhan analjezik olarak buprenorfin çalışma solüsyonu 100 ul enjekte, fare kafasına deri bir şerit tıraş, ve 1.4 &#39;te açıklandığı desinfect. Bir neşter kullanılarak, ca yapmak. Sutur düzeyinde kafatası ortaya kafa derisi üzerinde 1,5 cm uzunluğunda longitudinal kesi. Deri çekin ve yavaşça steril bir pamuk ile kemik yüzeyi temizleyin. </li><li> Parafin yağı ile kılcal cam (1.2 spesifikasyonları) Yarım doldurup taktıktan enjektör pompası üzerine monteikinci halka (Şekil 2B) kadar kapiler. Kılcal uç bregma, sagital ve yan dikişler (Şekil 2C) (stereomikroskop yardımı ile tespit edilir) arasında kesişme noktasıdır, üzerinde konumlandırılmış kadar, x, y ve z ekseninde kılcal tutucu taşı, ve re-set x, y ve z değerlerini 0. </li><li> Ön-arka eksen (y) olarak ± medio-lateral ekseninde 1.6 mm (x) ve -1.9 mm kapiler hareket ettirin ve bir cerrahi işaretleyici kalem kullanarak kemik işaretleyebilirsiniz. Ca bir delik açın. Beynin zarar vermemeye dikkat elektrikli delici kullanarak kafatası üzerinde 0,5 mm çap. </li><li> Kulak çubukları yerleştirilir parafilm bir parça viral süspansiyonu 5 ul damla (1 tablet) koyun ve damlacık içinde kılcal ucu immerge. Ca Suck. Bir nanolitre enjektör kullanarak viral süspansiyonunun 3.5 ul 55 nl / sn olarak belirlenmiştir. Damlacık buharlaşması gibi hızla bu adımı uygulayın. </li><li> Site o kadar kılcal taşıyınf enjeksiyon ve ucu pial yüzeyine temas edene kadar aşağı hareket ettirin. 0 dorso-ventral eksen değeri (z) sıfırlayın. Bu noktada, -1.9 mm kılcal ile dokuya nüfuz eden ve 4 nl / sn bir hızda viral süspansiyon 1.5 ul bırakın. Viral süspansiyon yalak kılcal parça geri akışının en aza indirmek ve daha sonra kılcal geri çekilmesi için 2-3 dakika bekleyin. Ikinci bir enjeksiyon controlateral hemisferde gerçekleştirilebilir. </li><li> , Cilt dikişleri dezenfekte etmek ve rahim elektroporasyon (1,8) &#39;de daha önce tarif edildiği gibi hayvan anestezi kurtarmak için izin verir. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. Stereotaksik Viral enjeksiyondan. Stereotaksik enjeksiyon (A) ve ca ekleme gösteren bir sökülüp kılcal tutucu gerçekleştirmek için gerekli bileşenler (A ve B) şematik gösterimiİkinci halkayı (B) kadar pillary. (C) cilt ile kulak çubukları ve damak desteği ile immobilize fare kafası resmi kafatası (solda) maruz kesti. Noktalı kutu büyütme (sağda), lateral ve sagittal sütür, bregma ve enjeksiyon (daire) site gösterir. 3. Örnek İşleme <ol><li> Bir-üç hafta sonrası enfeksiyon, ca fare serpmek. % 4 PFA 100 ml, beyin teşrih ve% 4 PFA gecede sonradan düzeltmek. Sonunda, BrdU ve / veya tamoksifen, sırasıyla 9, hücre döngüsü kinetiği araştırmak için ve loxP siteleri ile çevrili viral transgenlerin ifade durdurmak için farklı paradigmalar göre fedakarlık etmeden önce tatbik edilebilir. </li><li> Beyin sapı ve ataları hücreleri ve nöronlar (örneğin Sox2, GFAP, Nestin, Tbr2, doublekortin, vb) birkaç işaretleyiciler kullanılarak immünboyama için işlenebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+units+of+development,+units+of+regeneration,+and+units+in+evolution.">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li><li>Lindvall, O., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+for+the+treatment+of+neurological+disorders.">Stem cells for the treatment of neurological disorders.</a> Nature. 441, 1094-1096 (2006).</li><li>Salomoni, P., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+of+mammalian+neural+stem+cells:+putting+a+speed+limit+on+G1.">Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1.</a> Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).</li><li>Lange, C., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdks+and+cyclins+link+G(1)+length+and+differentiation+of+embryonic,+neural+and+hematopoietic+stem+cells.">Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells.</a> Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Inoue, T., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+impulse+to+the+brain--using+in+vivo+electroporation.">An impulse to the brain--using in vivo electroporation.</a> Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 10, 865-872 (2001).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb. Cortex. , 120-125 (2009).</li><li>Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+cdk4+and+cyclinD1+triggers+greater+expansion+of+neural+stem+cells+in+the+adult+mouse.">Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse.</a> J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).</li><li>Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+Utero+Electroporation.">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E15+Mouse+Embryos.">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+Utero+Electroporation:+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection.">Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+Injection+of+Adeno-associated+Viral+Vectors.">Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors.</a> J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).</li><li>Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Viral+Transduction+of+Adult-born+Olfactory+Neurons+for+Chronic+in+vivo+Optogenetic+Stimulation.">Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation.</a> J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).</li><li>Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk4/cyclinD1+overexpression+in+neural+stem+cells+shortens+G1,+delays+neurogenesis,+and+promotes+the+generation+and+expansion+of+basal+progenitors.">Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors.</a> Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).</li><li>De Pietri Tonelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+detection+of+microRNAs+in+developing+vertebrate+embryos+after+acute+administration+of+a+dual-fluorescence+reporter/sensor+plasmid.">Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid.</a> Biotechniques. 41, 727-732 (2006).</li><li>Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+RNA+interference+in+post-implantation+mouse+embryos+using+directional+electroporation+and+whole+embryo+culture.">Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture.</a> Differentiation. 72, 92-102 (2004).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-Guided+Microinjection+into+the+Mouse+Forebrain+In+Utero+at+E9.5.">Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li></ol>

BA ve FC cdk4/cyclinD1 virüsler (EP 10.160.288,6) tarafından erişkin somatik kök hücrelerin koşullu genişleme açıklayan bir patent başvurusu gönderdiniz.

Utero elektroporasyon in için hayati bir adım elektrik alanların teslimi sırasında yönlü göç şarjı bağlıdır yana DNA kalite ve saflık olduğunu. Gibi endotoksinler gibi ek yüklü moleküllerin çıkarılması dahil değildir DNA arıtma için Protocols Düşük uygulama giden doğal DNA negatif yük maskeleme yol açabilir. Açıktır ki, mümkün olduğunca yakın hedef alınacak bölgeye elektrotlar ile uterin duvarlara dokunmadan elektroporasyon verimliliğini artıracaktır. Aynı derecede önemli olan bu optimum elektrik alanların teslimat için esastır beri kullanılan elektrotlar kalitesidir. Göz ve / veya benzeri serum izleri, lipidler, ve benzeri gibi organik artıklar, tarafından bile görünmez mikro-çizikleri, kaçınılmaz olarak kendi özelliklerini kaybetmeden elektrotlar giden zaman içinde birikir. Eski ve / veya kirli electropes elektroporasyon verimlilik ani bir düşüş en olası nedeni vardır ve böylece r olmalıdıren kısa sürede bu fark olarak eplaced. Nispeten daha basit olmakla birlikte, uterus elektroporasyon tipik olarak tatmin edici bir şekilde ve yeniden üretilebilir sonuçların elde edilmesi için çalışma içinde bir kaç hafta gerekmektedir. Bu gelişen embriyonun her organ ve doku için, hemen uygulanabilir, çünkü bu tekniği çok yönlüdür. Kuşkusuz, beyin gibi bir kaviteye içeren organlar ve hedef DNA, görece geniş bir hacim enjekte etme kolaylığı nedeniyle, transfekte edilmiş hücreleri bir oranını sağlamak için özellikle kolaydır. Stereotaksik viral enjeksiyon kurulmasında karşılaşılan yaygın bir sorun kaç enfekte hücreleri ve / veya istenmeyen alanlarda hedeflemektir. İlk sorun çoğunlukla düşük titrede virüs enjeksiyonu ile ilişkilidir. Kültür pasajların düşük sayı ile 293T hücreleri daha hızlı büyür ve daha yüksek viral titreleri yol. Ca daha eski hücreleri kullanarak. 20 pasajlar önerilen ve en az% 80 verimlilik ile aktarılmasının anlamına değil iyi bir garanti vermezviral üretimi. Viral pelet yeniden süspanse edilmesi de önemlidir, viral süspansiyon kılcal kaçınılması gerekir tıkamak homojen olabilir ve viral kümeleri görünmesini sahiptir. Virüsler sıcaklığı düşer ve uzun süreli depolama için çok duyarlıdır. Bu nedenlerden ötürü, aynı hacimde kalıcı olarak -80 ° C&#39;de saklanabilir ve refrozen olamaz gerekir. Hatta bu koşullar altında, enfektivite bir azalma depolama 6-12 ay sonra tespit edilebilir. Öğrenme aşamaları, her bir viral hazırlama viral titresi test etmek ve uzun süreli depolamadan sonra tekrar yapmak öneririz. Beynin istenmeyen bölgelerde enfekte hücrelerin varlığı biraz pratik gerektirir stereotaksik çerçeve üzerinde fare kafası suboptimal konumlandırma bağlı olabilir. Buna ek olarak, aksi takdirde kesin olmayan enjeksiyon ile sonuçlanan, pial yüzey üzerinde doğru bir şekilde 0 sıfırlamak için mümkün olmayacaktır çünkü kafatası üzerinde delik açma sırasında beyin yüzeyine zarar vermemek için kritik önem taşır. KoordinatlarıBu protokolde sağladığı C57/BL6 6-10 hafta eski kadın adlandırılır ve biz farklı suşu / yaş / cinsiyet için onları optimize etmenizi öneririz. Bu tekniğin kazanılması virüsler hazırlamak ve örnekleri analiz etmek için gerekli uzun evreleri nedeniyle utero elektroporasyon daha fazla zaman gerektirebilir. Önemle fare cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon güvenilir ve tekrarlanabilir hale geldikten sonra virüs sadece kullanılır öneririz. Bunu başarmak için ilk adım ötenazi fareler gibi Hoechst 33342 gibi hücre geçirgenler DNA&#39;nın boyalar, enjekte ve hemen beyinleri analiz etmektir. Utero elektroporasyon ve stereotaksik viral enjeksiyon olarak iki güçlü akut sistemleri ve doku-spesifik memeli gelişimi ve yetişkinlik döneminde sinir sistemindeki gen ekspresyonu işlemek vardır. Hücrelerin sadece bir alt hedefleme kendi sınırlamaya rağmen bu sistemler, benzeri görülmemiş bir hız sağlamak ve daha geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında kolaylığı, itransgenik farelerin n özellikle zahmetli ve zaman alıcı nesil. Ancak bu benzerliklere rağmen, çeşitli farklılıklar bahsedilmeye değer iki teknik arasında var. Bu DNA enjekte edilir karıncık sınırlayan tek hücreler, çünkü İlk olarak, rahim elektroporasyon, farklı hücre tiplerinin hedefleme ile ilgili olarak başlangıçta uygun kök hücreler (glia hücreleri aynı zamanda radyal olarak da adlandırılır) ve transfeksiyon yol açar. Hücre bölünmesinin bir sonucu olarak, plazmid daha sonra bunların öncül ve / ya da zamanın bir fonksiyonu olarak korteks boyunca, transfekte edilmiş hücreleri dağıtılması yol açan sinirsel yavru hücrelere hedeflenen, ana kök hücreleri, miras edilecektir. Buna karşılık, yetişkin beyin HIV lentiviruses kullanımı kök hücreleri, öncü hücrelerden, nöronlar gibi olgun glial hücreler de dahil olmak üzere herhangi bir hücre tipi eşzamanlı enfeksiyona yol açar. Not, daha yaygın olarak kullanılan retrovirüsler karşıt olarak, HIV lentiviruses kullanılarak ilgili olmasıdırO lentiviral entegrasyonu dolayısıyla yetişkin, sessiz kök hücrelerinin de hedefleme sağlayan bağımsız hücrelerin mitotik devletten oluşacak. İkincisi, elektroporasyon ve viral enfeksiyonu arasındaki bir başka önemli fark, ikinci elde enfekte hücrelerin genomundaki DNA geri dönülmez bütünleşme aksine bir geçiş, episomal ifadesi eski elde olmasıdır. Birbirini takip eden hücre bölünmesi, electroporated plazmid seyreltme, ve ektopik SiklinD1 protein yıkımı bir sonucu olarak, her bir hücre döngüsünde izleyecek. Bu etki birkaç ay (yayınlanmamış sonuçlar) sürer bulunmuştur yetişkin beyin içinde iken Böylece, embriyonik gelişimi sırasında MGK genişleme sadece son yaklaşık iki gün için 15 ile gösterilmiştir. I) cdk4/cyclinD1 gelişimi sırasında) işlenen nöral öncüllerinden daha uzun G1 ve ii olan hücreleri üzerinde güçlü bir etkisi vardır beri Üçüncüsü, uzun bir hücre döngüsü vardırtersi yetişkinlik döneminde de geçerlidir ederken dışındakilerden kök hücre, bizim iki manipülasyonlar yetişkinlik döneminde kalkınma ve kök hücre sırasında nöral progenitörlerinin genişlemesi, öncelikle, tetiklemek için bulunmuştur. Her iki durumda da nöronlar bir artış her iki yöntem ile elde edilmiştir. Dördüncü olarak, viral enjeksiyon kolayca sadece stereotaksik koordinatlar değiştirerek, yetişkin beyin pek çok farklı bölgeler içinde, güvenilir ve tekrarlanabilir, gerçekleştirilebilir. Buna karşılık, uterus içinde elektroporasyon yoluyla bu gibi beyin sapı, hipokampal oluşumunun ya da spinal kord gibi merkezi sinir sisteminin belirli bölgelerinde, kesin hedefleme çoğaltılabilir şekilde elde etmek için daha fazla zor olabilir. Stereotaksik enjeksiyon herhangi bir yaştaki fareler üzerinde yapılabilir iken Ayrıca, uterus içinde elektroporasyon optimum performans için E16 E11 yaklaşık sınırlıdır. Öncesinde E11 Adımlarını bir ultrason backscatter mikroskop 18,19 kullanımı ya da bir bütün embriyo kült ya gerektirecektirure sistemi 17,20. Kendi çalışma ve manipülasyon yeni hücre tabanlı rejeneratif tedaviler geliştirmeye yönelik temel olduğu düşünülmektedir, çünkü son, somatik kök hücrelerin temel hücre biyolojisi artan bir ilgi teşvik edilmiştir. Cdk4/cyclinD1 ekspresyonu için, özellikle bizim protokol transitorily erişkin beyninde üretilen nöron sayısını artırmak amacıyla in vivo MGK genişleme (Şekil 3B ve C ve 4B ve C) artırmak için bir araç sağlar. Biz bu manipülasyon iyi beyin gelişimi, evrim ve homeostasis yanı sıra bilişsel işlev veya sinir dejenerasyonu ya da yaralanma kurtarma katkıları içinde MGK&#39;nın rolünü anlamak için farklı bağlamlarda bir dizi önemli olabilir inanıyoruz.

<table border="1"><tbody><tr><td> Malzeme / ekipman </td><td> Satıcı </td><td> # Katalog </td><td></td></tr><tr><td> Endofree maxi plazmid kiti </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> FastGreen </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> P-97 Flaming / Brown pipet çektirmesi </td><td> Sutter Aletleri </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Filament ile borosilikat </td><td> Sutter Aletleri </td><td> BF120-69-10 </td><td></td></tr><tr><td> Masa üstü laboratuar hayvanları anestezi sistemi </td><td> VetEquip </td><td> 901806 </td><td></td></tr><tr><td> Izofluran </td><td> Baxter </td><td> Galvanizli9623 </td><td></td></tr><tr><td> Germinator 500 cam boncuk sterilizatör </td><td> Southpointe Cerrahi </td><td> GRM5-1460 </td><td></td></tr><tr><td> Iris forseps </td><td> TEFE </td><td> 15917 </td><td></td></tr><tr><td> Betaisodona çözümü </td><td> Mundipharma </td><td> 1931491 </td><td></td></tr><tr><td> Pico Pompası </td><td> TEFE </td><td> PV820 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 kare dalga Elektroporatör </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 450052 </td><td></td></tr><tr><td> Yuvarlak cımbız elektrotlar </td><td> NEPAGENE </td><td> CUY650P1 </td><td></td></tr><tr><td> Sütür materyali </td><td> Ethicon </td><td> V493H </td><td></td></tr><tr><td> Refleksyara kapanması için uygulayıcı klibi </td><td> TEFE </td><td> 500345 </td><td></td></tr><tr><td> Temgesic enjeksiyon çözelti </td><td> Essex Pharma AG </td></tr><tr><td> DMEM w / Glutamax I </td><td> Invitrogen </td><td> 31966021 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovin Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 1027016 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomicin </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> Doku kültürü çanak </td><td> Şahin </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Polietilenimin 250 ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 40872-7 </td><td></td></tr><tr><td> -n-Butirik asit, sodyum tuzu </td><td> Sigma </td><td> B 5887 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Tüp, thinwall, polyallomer </td><td> Beckman </td><td> 326823/331374 </td><td></td></tr><tr><td> Model 900 küçük hayvan stereotaksik alet </td><td> Kopf Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OPMI pico mikroskop </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYS-Micro4 denetleyicisi ve Nanoliter2000 enjektör </td><td> TEFE </td><td> B203MC4 </td><td></td></tr><tr><td> Cam yerine 3,5 nanolitre </td><td> TEFE </td><td> 4878 </td><td></td></tr><tr><td> SR matkap genel uygulama </td><td> Foredam </td><td> K2272 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td><strong&gt; Antikor </td><td> Satıcı </td><td> # Katalog </td><td> Seyreltme </td></tr><tr><td> Doublekortin </td><td> Santacruz </td><td> SC8066 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Chemicon </td><td> MAB3404 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> BD Biosciences </td><td> 556309 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> S100β </td><td> Abcam </td><td> Ab868 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> Sox2 </td><td> Millipore </td><td> AB-5603 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Tbr2 </td><td> Abcam </td><td> Ab23345 </td><td> 1:400 </td></tr><tr><td colspan="4"> Antikorların Tablo. </td></tr></tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

expansion of embryonic and adult neural stem cells by in utero electroporation or viral stereotaxic injection

Somatik kök hücreler erişkin 1 sırasında embriyonik gelişim ve doku homeostazını sırasında doku oluşumu için esastır ek kök hücreler (genişletme) veya daha fazla farklılaşmış hücre tipleri (farklılaşma) oluşturmak için bölebilirsiniz. Şu anda, büyük çabalar bu rejeneratif tıp 1,2 için yeni stratejiler geliştirebilmek için oldukça önemli olduğuna inanılmaktadır çünkü farklılaşma genişleme somatik kök hücre anahtarını kontrol doğru yatırım vardır. Bununla birlikte, kök somatik hücre çalışma ve kullanımı önemli bir zorluk, genişleme kontrol etmek çok zor olduğu kanıtlanmıştır olmasıdır. Burada cdk4/cyclinD1 kompleks ifadesi, G1 faz önemli bir düzenleyici işleyerek fare embriyonik korteks veya yetişkin hipokampus sinir kök / projenitör hücre kontrolü (tamamen NSC olarak anılacaktır) genişleme sağlayan bir sistem açıklanmaktadır hücre döngüsü ve somatik kök hücre differentiation 3,4. Özellikle, iki farklı yaklaşım cdk4/cyclinD1 kompleks in vivo olarak NSC aşırı eksprese edildiği de anlatılmıştır. Ilk yaklaşım olarak, hücre siklus düzenleyicileri ekspresyonu fare telencephalon lümeninde cdk4/cyclinD1 şifreleyen plazmit arasında episomal ifadesi tetikler, böylece lateral korteks MGK onları teslim utero elektroporasyon içinde izledi enjekte edilerek elde edilir transgenlerin 5-8. İkinci yaklaşım olarak, yüksek derecede konsantre HIV-türetilmiş virüs steriotaksik 9 enfekte hücrelerin genomuna entegre viral yapının sonra hücre döngüsü düzenleyicileri oluşumsal ekspresyonu tetikleme, böylece, erişkin fare hipokampusun dentat girus enjekte edilir. Olan temel ilkeleri zaten diğer video protokolleri 10-14 tarafından tarif edilmiştir Her iki yaklaşım da, burada i optimize edildi), ii doku hasarını azaltmak) çok özel bir beyin regio hedefi geniş bölümlerins, iii) her bir bölge dahilinde işletilen hücrelerin yüksek sayıda elde etmek, ve iv) her bir hücre içinde transgenlerin yüksek ifade seviyeleri tetikler. Iki yaklaşım kullanılarak transgenlerin geçici aşırı nedeniyle Cre-ifade sırasıyla, MGK loxP siteleri tarafından çevrili cdk4/cyclinD1 taşıyan virüsleri ile enfekte 9,15 hücre bölünmesi veya tamoksifen kullanımı için electroporated plazmidler doğal seyreltme ile yani farklı yollarla elde edilir . Bu yöntemler akut ve doku-özellikle fare beyin herhangi bir gen ekspresyonu işlemek için çok güçlü bir platform sağlar. Özellikle, cdk4/cyclinD1 kompleksi ifade işleyerek, bizim sistem sonuçta memeli beynindeki nöronlar üretilen sayısının arttırılması, böylece, temporal NSC genleşme kontrolü ve farklılaşması için kendi geçiş sağlar. Bizim yaklaşımımız temel araştırmalar için çok önemli olduğu ve tedavi için somatik kök hücreleri kullanarak olabilirMemeli merkezi sinir sisteminin i daha iyi bir anlayış) sunarken somatik kök kullanarak) yetişkinlik, iii sırasında) gelişimi, ii sırasında daha bilişsel işlevlerde yetişkin nöron rolü, ve belki, iv) doku homeostazında doku oluşumu için hücre katkısı kök nörodejeneratif hastalıkların modellerinde hücreler.

<ol><li> Genel olarak, rahim içinde elektroporasyon yanal korteks (Şekil 3A), geniş bir alan içinde raportör gen ekspresyonu görüntüleme, güçlü electroporated embriyoların yaklaşık% 60-80 kadarı elde edilir. Floresan proteinler kolayca bir haftadan daha uzun süren sinyal ile ameliyattan sonra en kısa sürede 3-6 saat gibi tüm montaj embriyolar tespit edilebilir. Hedeflenen bölgede, hücreler yaklaşık% 30-50, genellikle hücre oranları genelde% 90&#39;ın üzerinde olmak üzere iki (veya daha fazla) co-electroporated transgenlerin (Şekil 3B, sol) 6,8 birlikte ifade ile transgen (ler) i ifade , 15. Apoptoz (yaklaşık% 2.0-2.5), minimal bir düzeyde elektroporasyon yaklaşık 2 saat sonra gözlenebilir iken, bu değer yaklaşık 6 saat sonra fizyolojik düzeyde (yaklaşık% 0.5-1.0) (FC, yayınlanmamış veri) dönecektir. Ameliyat nedeniyle ölmekte olan embriyoları veya gebe farelerin oranı (&lt;% 5) genellikle ihmal edilebilir düzeydedir. Bu koşullar altında cdk4/cyclinD1 Co-elektroporasyon 4 takibenGelişme 8 saat% 30 sinir progenitör genişleme (sağ Şekil 3B, ve C) 15 bir artış tetikler. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3,. Cdk4/cyclinD1 fazla ifadesi tarafından sinir progenitor hücrelerin büyütülmesi. 24 saat embriyonik gün 13&#39;te, GFP ve TTT plazmidler ile elektroporasyon sonra bir fare embriyo korteks aracılığıyla bir yanal kesit bölgesinin (A), floresans resim. (B) temel projenitör işaretleyici Tbr2 için cdk4/GFP ve cyclinD1/RFP plasmidler ve immün ile birlikte elektroporasyon sonra bir 48 saat içinde olduğu gibi floresan resimler. DAPI counterstainig (solda) ve Tbr2 ile Floresan gazetecilere (sağ) gösterilir. Ve subventricular bölge sınırları (SVZ; sarı kesikli çizgiler); Hatları ventriküler zonun apikal yüzeyi (beyaz çizgi VZ) gösterir. Artan thi notartan üretim ve cdk4/cyclinD1 ekspresyonu sonra bazal progenitor hücrelerin genişlemesi nedeniyle korteks electroporated kısım (beyaz ok başları) içinde SVZ arasında ckness. P &lt;0.05, n = 3 (C) etki miktarının B. Çubuklar = SD de gösterilmiştir. C çubuk grafik Lange, et al., 15, 2009 alınır. <ol start="2"><li> Sonra viral stereotaksik enjeksiyon, ca. Çalışan farelerin% 80&#39;i bütün dentat girus boyunca transgenlerin güçlü ifadesini görüntüler. GFP oluşumsal ekspresyonu kolayca ameliyat sonrası hemen 4 gün olarak 40 um kesitler üzerinde tespit edilebilir. Dentat girus rostral-to-kuyruk eksen boyunca, hücrelerin yaklaşık% 10-30 (ca toplam. 10,000-30,000 hücreler denk) genellikle transgen (lar) (Şekil 4A) 9 ifade eder. Nedeniyle cerrahi için ölüyor farelerin oranı (&lt;% 5) ihmal edilebilir düzeydedir. Bu koşullar altında cdk4/cyclinD1 üç hafta boyunca aşırı ekspresyonu ile NSC bir artış tetikler ikikıvrımlar (Şekil 4B) 9% 70 (Şekil 4C) tarafından nöron azaltırken. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig4.jpg" alt="Şekil 4," /> Şekil 4. Viral enfeksiyon Etkileri. Hipokampüsün rostral-to-kaudal ekseni boyunca 40 mikron kalınlığında seri koronal kesitler (1 her 6 toplanması) alınan 7 floresans resimleri (A) 3D rekonstrüksiyon. GFP + enfekte hücreleri (yeşil) ve dentat girus DAPI nükleer boyanma (mavi) (üst) gösterilir. A (orta) ve (; Allen Brain Atlas modifiye yeşil yalancı vurgulanan hipokampus ile tüm serebral hemisferin 3D gösterimi (alt) gösterilenlere karşılık koronal kesitlerin Aydınlık alan resimlerin <a href="http://www.brain-map.org" target="_blank">www.brain-map.org</a> ) . Beyaz oklar enjeksiyon yerinde işaret. Yanal (L), rostral (R) ve dorsal (D) ekseni (x, y ve z, stereotaksik koordinatlar) (sağ) gösterilmiştir. Nestin NSC + (B) ve DCX + GFP nüfus içinde yeni doğmuş nöron (C) + 3 hafta stereotaksik GFP (beyaz) ya da cdk4/cyclinD1/GFP enjeksiyonu (siyah) virüs sonra enfekte olmuş hücreleri (B ve C) oranı. Barlar = SD, p &lt;0.005, n = 3. B ve C olarak grafikler Artegiani ve ark., 2011 alınmıştır.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection at JoVE.com

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatik kök hücre genişleme kontrolü kendi çalışma ve tedavide kullanımı engelleyen önemli bir faktördür. Burada geçici olarak fare beyin üretilen nöron sayısını artırmak için kullanılabilir geliştirme ve yetişkinlik döneminde nöral kök hücrelerinin genişlemesi, kontrol etmek için bir sistemi tanımlamak.

Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon veya Viral Stereotaksik Enjeksiyon

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

expansion-embryonic-adult-neural-stem-cells-utero-electroporation-or

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

16.6K Görüntüleme.  DFG - Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies Dresden, Germany. Somatik kök hücre genişleme kontrolü kendi çalışma ve tedavide kullanımı engelleyen önemli bir faktördür. Burada geçici olarak fare beyin üretilen nöron sayısını artırmak için kullanılabilir geliştirme ve yetişkinlik döneminde nöral kök hücrelerinin genişlemesi, kontrol etmek için bir sistemi tanımlamak.

Video: Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Nörobilim

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Topikal Transgenik Rats nesil tarafından<em&gt; Utero</em&gt; Elektroporasyon ve<em&gt; In vivo</em&gt; Biyoparlaklık Eleme

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

İnsan Nöral Agregalarının bir cGMP uygulanabilir Açılım Yöntemi kök hücrelerin pluripotent kök hücreleri veya Fetal Beyin dokusundan türetilen

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

In vivo doğrudan reprogramming Resident glial hücreler Interneurons viral vektörler ıntracerebral enjeksiyon ile

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian development. In utero electroporation is a key technique for the manipulation of gene expression in the embryonic mammalian brain in vivo. A protocol for in utero electroporation of the embryonic neocortex of ferrets, a small carnivore, is presented here. The ferret is increasingly being used as a model for neocortex development, because its neocortex exhibits a series of anatomical, histological, cellular, and molecular features that are also present in human and nonhuman primates, but absent in rodent models, such as mouse or rat. In utero electroporation was performed at embryonic day (E) 33, a midneurogenesis stage in ferret. In utero electroporation targets neural progenitor cells lining the lateral ventricles of the brain. During neurogenesis, these progenitor cells give rise to all other neural cell types. This work shows representative results and analyses at E37, postnatal day (P) 1, and P16, corresponding to 4, 9, and 24 days after in utero electroporation, respectively. At earlier stages, the progeny of targeted cells consists mainly of various neural progenitor subtypes, whereas at later stages most labeled cells are postmitotic neurons. Thus, in utero electroporation enables the study of the effect of genetic manipulation on the cellular and molecular features of various types of neural cells. Through its effect on various cell populations, in utero electroporation can also be used for the manipulation of histological and anatomical features of the ferret neocortex. Importantly, all these effects are acute and are performed with a spatiotemporal specificity determined by the user.

Presented here is a protocol to perform genetic manipulation in the embryonic ferret brain using in utero electroporation. This method allows for targeting of neural progenitor cells in the neocortex in vivo.

Utero Elektroporasyon in Ferret Neokorteks nöral progenitor hücrelerinin Vivo Hedefleme

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages over conventional multi-photon calcium imaging systems: (1) compact; (2) light-weighted; (3) affordable; and (4) allows recording from freely behaving animals. This protocol describes brain surgeries for deep brain in vivo calcium imaging using a custom-developed miniscope recording system. The preparation procedure consists of three steps, including (1) stereotaxically injecting the virus at the desired brain region of a mouse brain to label a specific subgroup of neurons with genetically encoded calcium sensor; (2) implantation of gradient-index (GRIN) lens that can relay calcium image from deep brain region to the miniscope system; and (3) affixing the miniscope holder over the mouse skull where miniscope can be attached later. To perform in vivo calcium imaging, the miniscope is fastened onto the holder, and neuronal calcium images are collected along with simultaneous behavior recordings. The present surgery protocol is compatible with any commercial or custom-built single-photon and two-photon imaging systems for deep brain in vivo calcium imaging.

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo calcium imaging is a powerful technique to study neuronal dynamics and microcircuits in freely behaving mice. This protocol describes performing brain surgeries to achieve good in vivo calcium imaging using a miniscope.

Derin Beyin In Vivo Kalsiyum Görüntüleme için Stereotaksik Viral Enjeksiyon ve Degrade İndeks Lens İmplantasyonu

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the lack of proper animal models that fully mimic human diseases and the poor availability of post-mortem human brain tissue. Adult human nervous tissue culture offers the possibility to study different aspects of neurological disorders. Molecular, cellular, and biochemical mechanisms could be easily addressed in this system, as well as testing and validating drugs or different treatments, such as cell-based therapies. This method combines long-term organotypic cultures of the adult human cortex, obtained from epileptic patients undergoing resective surgery, and ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors. This method will allow the study of cell survival, neuronal differentiation, the formation of synaptic inputs and outputs, and the electrophysiological properties of human-derived cells after transplantation into intact adult human cortical tissue. This approach is an important step prior to the development of a 3D human disease modeling platform that will bring basic research closer to the clinical translation of stem cell-based therapies for patients with different neurological disorders and allow the development of new tools for reconstructing damaged neural circuits.

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

This protocol describes long-term organotypic cultures of adult human cortex combined with ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors, which present a novel methodology to further test stem cell-based therapies for human neurodegenerative disorders.

İnsan Kök Hücre Nakli ve Validasyonu için Ex vivo Model Olarak Yetişkin İnsan Korteksinin Organotipik Kültürleri

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...